Summary
Cet article décrit les méthodes qui sont utilisés pour étendre le cerveau foetal humain des cellules souches neurales dans la culture, ainsi que comment les différencier en divers sous-types neuronales et les astrocytes, en mettant l’accent sur l’utilisation des cellules souches neurales pour étudier l’infection par le virus Zika.
Abstract
Cerveau foetal humain des cellules souches neurales sont un système unique de modèle non génétiquement modifié pour étudier l’impact de divers stimuli sur la neurobiologie du développement humaine. Plutôt que d’utiliser un modèle animal ou cellules pluripotentes induites génétiquement modifiés, des cellules souches neurales humaines constituent un système efficace in vitro pour examiner les effets des traitements, médicaments de l’écran, ou examiner les différences individuelles. Ici, nous fournissons les protocoles détaillés pour les méthodes utilisées pour développer des cellules souches neurales de cerveau foetal humain en culture et médias sans sérum, pour différencier dans divers sous-types neuronales et les astrocytes via des procédures différentes d’amorçage, geler et récupérer ces cellules. En outre, nous décrivons une procédure d’utilisation de cellules souches neurales de cerveau foetal humain pour étudier l’infection par le virus Zika.
Introduction
Zika virus (ZIKV) est un flavivirus transmis sexuellement ou par les moustiques Aedes aegypti et Aedes albopictus moustique vecteur. ZIKV a été récemment identifié comme une menace grave de santé publique en raison de sa facilité de transmission et affiliés ainsi qu’avec des symptômes neurologiques1. Un des plus concernant les effets neurologiques est le développement d’une microcéphalie chez les foetus nés de mères infectées enceintes2,3. Microcéphalie est un trouble neurologique du développement où la tête est plus petite que la taille typique pendant le développement du foetus et à la naissance, dont la circonférence est inférieure à 2 écarts-types au-dessous de la moyenne4. Le plus petit tour de tête est généralement accompagné d’une variété de maladies concomitantes telles que les retards de développement, saisies, vision et perte d’audition et difficultés d’alimentation.
Des études récentes ont utilisé des modèles animaux ou induite par les cellules souches pluripotentes pour étudier l’effet de l’infection à ZIKV sur le développement neurologique5,6,7,8. Alors que ces études ont contribué à notre connaissance de ZIKV, l’utilisation d’espèces différentes ou de cellules génétiquement modifiées peuvent être beaucoup de temps et/ou ajouter des variables supplémentaires qui peuvent entraîner l’effet du ZIKV sur le développement neuronal cellules5, 6 , 7 , 8. Toutefois, la difficulté avec la culture de HNS, particulièrement la culture non adhérents Neurosphère décrite dans le présent protocole, est que la culture est très sensible aux méthodes utilisées pour mener la culture9. Tout changement de composants moyens, ou encore la manipulation physique du navire la culture, est suffisant pour déclencher une réaction de la cellules9. Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé une culture in vitro humain foetal encéphales cellules souches neurales (hNSCs) pour interroger mécaniquement l’effet du ZIKV sur les cellules souches neuronales foetales. En utilisant notre méthode, hNSCs ont été maintenues pendant plus de 80 passages sans changements phénotypiques apparent10. En outre, des altérations chromosomiques comme la trisomie n’ont aucun ou un minimum de11. Cette culture de HNS se développe comme une culture Neurosphère non adhérents. Un avantage de neurospheres est que les sphères créent une niche environnementale unique dans la culture qui reflète plus en vivo niches par rapport aux cultures deux dimensions9. Un autre avantage de ce protocole est que plusieurs types de cellules peuvent provenir de la culture de la HNS, permettant à un enquêteur d’observer l’impact d’une variable donnée sur HNS survie et la différenciation. Le présent protocole est applicable aux personnes qui cherchent à répondre à des questions mécanistiques concernant le développement du système nerveux central ou un dysfonctionnement. Le protocole suivant décrit comment développer une culture de HNS pour infecter avec ZIKV et par la suite se différencient la hNSCs pour observer l’impact de l’infection sur le processus de différenciation. Il inclut également des méthodes pour stocker hNSCs pour une utilisation à long terme et pour hNSCs se différencient en divers types de neurones qui permettent une investigation des déficits induite par le ZIKV contribuant au cerveau malformation11. Nous croyons que ce protocole est également d’intérêt pour les enquêteurs qui cherchent à comprendre l’impact de tout stimulus environnementaux tels que l’infection ou de toxines sur les cellules souches neurales de survie et la différenciation.
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Protocol
Les cellules souches neurales humaines provenaient initialement mis au rebut cortex foetus humain dans le premier trimestre12. Toutes les procédures du protocole respectent les lignes directrices à l’University of Texas Medical Branch éthique concernant l’utilisation des échantillons de tissus humains, et les lignées cellulaires ont été approuvées par la Commission institutionnelle de la prévention des risques biotechnologiques.
1. stock moyenne récupération de préparation et de cellules souches
- Préparer le stock de milieu de culture (DFHGPS) en combinant les réactifs dans les étapes 1.1.1.-1.1.5.
- Ajouter 210 mL de milieu Eagle de la modification de Dulbecco avec forte concentration de glucose et de la L-glutamine (D). Conserver à 4 ° c.
- Ajouter 70 mL du mélange nutritif F12 du jambon avec supplément de L-glutamine (F). Conserver à 4 ° c.
- Ajouter 4,2 mL de 15 mM (H) un tampon HEPES et conserver à température ambiante.
- Ajouter 4,2 mL 10 % Solution de D-glucose (G) et le stocker à température ambiante.
- Ajouter 2,88 mL de solution de pénicilline/streptomycine (PS)... Partie aliquote de la solution mère en aliquotes de 3 mL et stocker les aliquotes à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
NOTE : La concentration finale de la pénicilline dans le milieu sera 100 unités/mL et la concentration de la streptomycine sera de 100 µg/mL. Ce moyen de communication sera considérée comme une DFHGPS pour le reste du protocole et doit être conservé à 4 ° C pour une utilisation dans les 1-2 semaines. Si nécessaire, DFHGPS peut être entartré proportionnellement.
- La nuit la veille de cellules sont récupérés, enduire une fiole T75 avec 5 mL de milieu conditionné, obtient à partir des cultures précédentes de la lignée cellulaire de HNS et laissent dans un incubateur à 37 ° C avec 8,5 % de dioxyde de carbone (CO2).
Remarque : Si actuellement cultivant hNSCs, enregistrer le média qui ont connu une croissance dans les cellules lors d’un changement de moyen. Il s’agit d’un milieu conditionné comme il a été « conditionné » par les cellules. Un milieu conditionné peut être enregistré dans un tube avec bouchon à vis et stocké à 4 ° C pendant environ 7 jours. Contacter l’auteur-correspondant pour recevoir hNSCs. Il est préférable mais pas absolument nécessaire, notamment lors du premier démarrage la culture de hNSCs milieu conditionné. - Le jour de reprise, chaud 20 mL de DFHGPS dans un tube à bouchon à vis 50 mL dans un bain d’eau de 37 ° C pendant au moins 10 min et gardez-le dans un bain-marie jusqu'à utilisation.
- Dans un tube à bouchon à vis séparé 15 mL, réchauffer 10 mL de DFHGPS dans un bain d’eau de 37 ° C pendant au moins 10 min et gardez-le dans un bain-marie jusqu’au moment de l’utiliser à l’étape 1.13.
- Récupérer un récipient de glace et de tous les composants moyennes (tableau 1). Décongeler toutes les composantes moyennes sur la glace et laissez-les sur la glace tout en préparant le changement médiatique.
- Obtenir 5 mL de conditionné stock moyen (conservée à 4 ° C) et gardez-le dans un bain-marie à 37 ° C jusqu’au moment de l’utiliser à l’étape 1.14. Voir la note après l’étape 1.2 si il n’y a aucune culture conditionné moyenne ou courant humain foetal cellules souches neurales.
- Récupérer le tube avec bouchon à vis 50 mL de l’étape 1.3 et le placer dans l’armoire de biosécurité (BSC). Transférer 10 mL de DFHGPS dans un nouveau tube de 15 mL bouchon à vis et placez ensuite le tube de 50 mL contenant les restant 10 mL de milieu DFHGPS de retour dans le bain-marie à 37 ° C.
- Obtenir un cryo-flacon de hNSCs conservés dans l’azote liquide. Voir la note après l’étape 1.2 si il n’y a aucune culture de cellules souches neuronales foetales humaines actuelles.
Remarque : Les cellules souches neurales humaines ont été initialement dérivés du cerveau foetal humain mis au rebut12 et maintenues en culture sans modification génétique10. 5 × 106 cellules devraient être décongelés et plaqués sur une fiole T75. Chaque flacon de cryo-doit contenir 5 × 106 cellules ; par conséquent, il faut un flacon par flacon. - Décongeler un flacon de cellules dans le bain-marie à 37 ° C en retournant le flacon toutes les 10 s pendant environ 1 minute ou jusqu'à ce que la glace est fondue et le contenu de la fiole est complètement liquid. Ne pas immerger le flacon entier sous l’eau pour éviter la contamination potentielle.
- Dans la GCS, utiliser une P1000 micro-pipette pour aspirer la solution cellulaire décongelés et ajoutez-le goutte-à-goutte dans le tube de 15 mL de l’étape 1.7, contenant 10 mL de DFHGPS. Pour ajouter la solution de cellules décongelées goutte-à-goutte, lentement enfoncer le piston afin que seulement une ou deux gouttes est sorti en même temps. Pendant ce temps, agiter le tube de 15 mL pour permettre un mélange rapide.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant, en veillant à conserver le culot cellulaire.
- Au cours de l’étape 1.11, extraire le tube de 50 mL contenant les 10 mL restant de l’étape 1.7. Après la centrifugation, resuspendre le culot cellulaire dans les 10 mL DFHGPS et centrifuger à nouveau à 200 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Lors de l’essorage final, préparer le milieu de croissance nouvelle suivant tableau 1 pour ajouter des facteurs de croissance à 10 mL de milieu DFHGPS de l’étape 1.4 (tableau 1) de la BSC. Laissez ce nouveau média contenant des facteurs de croissance dans la GCS jusqu’au prêt à l’emploi.
- Récupérez la fiole T75 étape 1.2 et jeter le milieu conditionné la fiole de revêtement par aspiration. Ajouter ensuite le 5 mL de milieux conditionnés de l’étape 1.6. dans le ballon à l’aide d’une pipette sérologique. Veillez à ne pas se gratter le fond du flacon.
- Extraire le tube de cellules de la centrifugeuse et éliminer le surnageant par aspiration, laissant le culot cellulaire intacte.
- Resuspendre le culot dans 10 mL de nouveaux médias de l’étape 1.13 en utilisant une pipette sérologique de 5 mL et de pipetage et descendre plusieurs fois. Ajouter la suspension au ballon T75 revêtu de l’étape 1.14. Utilisez les restants de 5 mL pour rincer le tube contenant le culot cellulaire et ensuite ajouter ces 5 mL dans le ballon aussi bien.
- Balancer le ballon T75 3 fois en arrière pour s’assurer que les cellules sont uniformément répartis dans la fiole. Assurez-vous que le bouchon du flacon est lâche qui permettent l’écoulement de l’air. Sous un microscope photonique observer les cellules, prendre des notes et prendre des photos si possible.
Remarque : Les cellules devraient ressembler translucides et sphériques. Noter s’il y a des cellules qu’opaque noir, coup d’oeil, ou avoir des pensionnaires asymétriques car cela peut indiquer la mort cellulaire. Surveillez également toute contamination bactérienne ou fongique, tels que les médias deviennent jaune en couleur. - Placer la fiole de cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 8,5 % CO2.
Remarque : Utilisez 8,5 % au lieu de 5.0 % CO2 pour maintenir le pH de ce milieu de culture sans sérum dans la gamme de 7.1 à 7.4.
2. HNS changement médiatique
Remarque : Changer de support tous les 3-4 jours.
- Allumez le BSC et nettoyer soigneusement avec l’éthanol à 70 %. Observer les cellules sous un microscope optique.
Remarque : Prendre des notes sur l’apparence des cellules et sphère de tailles. Trois jours après la récupération ou de passage, cellules vont regrouper ensemble et commencent à former des neurospheres non adhérents.
ATTENTION : Si les cellules adhèrent au fond de la fiole, la culture devront être jetés comme l’adhérence cellulaire augmentera la différenciation prématurée et cellules sera incapables de maintenir un état de la tige. S’il y a trop de cellules dans le ballon, les cellules peuvent former de grandes sphères (supérieur à 2 mm de diamètre) auquel cas, les cellules dans le centre de la sphère vont commencer à différencier en raison du manque d’accès aux facteurs de croissance dans le milieu. Si on observe des sphères plus de 1 mm de diamètre, les cellules peuvent être repiquées (étapes 3.1-3.22). - Suivez les étapes 1.4 et 1.5 et préparer les 10 mL de milieu frais (voir étape 1.13).
- Inclinez le ballon sur le côté, permettant aux sphères pour couler au fond du flacon.
- Prélever 5 mL de milieux conditionnés par le haut du milieu commun à l’aide d’une pipette de 5 mL sérologique, prenant soin de ne pas pour aspirer tout neurospheres. Déposer les 5 mL de milieux conditionnés dans un tube propre de 15 mL.
- Retirez 5 mL supplémentaire de milieux conditionnés de la fiole, évitant à nouveau soigneusement les sphères et placez les 5 mL dans le même tube de 15mL.
- Ajouter 10 mL de nouveaux médias de l’étape 2.2 à la 5 mL restant de milieux conditionnés et de cellules dans le ballon. Mettre le ballon à plat et observer les cellules sous un microscope optique.
- S’il apparaît que les cellules ont été aspirés pendant la collecte de milieu conditionné, faites tourner le milieu conditionné à 100 x g pendant 5 min à température ambiante. Remettre en suspension les cellules qui s’accumulent au fond dans 1 mL de milieu conditionné et puis les ajouter dans le flacon de culture.
- Stocker les 10 mL de milieux conditionnés inutilisés des étapes 2.5/2.6 à 4 ° c dans un tube à bouchon à vis 15 mL.
- Répétez les étapes 1.17/1.18.
3. HNS Passage
Remarque : hNSCs devrait être de passage tous les jours 9-11 si les cellules se développent normalement, comme le temps de doublement de la population est environ 3 jours13.
- Si les CNS en expansion dans un nouveau flacon, assurez-vous que tous les nouveaux flacons sont enduits comme à l’étape 1.2.
- Nettoyer le BSC comme à l’étape 2.1 et effectuer les étapes 1.4 et 1.5.
- Préparer le milieu comme dans l’étape 1.13. Chaque fiole T75 nécessite 10 mL de milieu. Pour plusieurs ballons T75, multipliez 10 mL de médias par nombre de flacons.
- Préparer 1 ou 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (SPD) et de glucose et de place dans un bain d’eau de 37 ° C pour chauffer pendant 10 min (pour une solution de trypsine) selon les volumes dans le tableau 2de Dulbecco. En ce moment, ne pas ajouter de la trypsine ou DNase. DNase peut-être devoir décomposer tout ADN détache les cellules mortes en raison de la dissociation cellulaire mécaniques ou chimiques.
Remarque : Pour un flacon de T75 subcultures après 9-10 jours de croissance il y aura environ 30 × 106 cellules, si 5 × 10,6 ont été ensemencés à l’origine sur la fiole. En règle générale, 1 mL de solution de SPD sert à 10 × 106 cellules. Par conséquent, 3 mL de solution de SPD est nécessaire pour une fiole T75 subcultures après 9-10 jours. - Lieu de nettoyer les petites pèsent bateau et hémocytomètre hotte. Nettoyer avec de l’éthanol à 70 % et laisser à l’air sec dans la hotte pendant environ 5 min.
Remarque : Le bateau de pesée servira en étapes 3.17.1. - Récupérez la fiole de cellules qui va être repiquées de l’incubateur et l’amener dans la GCS. Inclinez le flacon doucement permettant aux cellules de couler vers le bas des médias mis en commun. Il y a environ 15 mL de médias dans le ballon.
- Enlever environ 10 mL de médias en portions de 5 mL (soit 5 mL + 5 mL). Placer ce 10 mL de médias dans un tube propre 15 mL étiqueté « CM » pour « milieu conditionné ». Veillez à ne pas aspirer toutes les cellules que se sont installés dans les 5 mL restant des médias dans la fiole ; ces cellules et 5 mL de médias seront soumis à l’étape 3,8.
- Prendre de 3 mL de milieux conditionnés du tube « CM » (de l’étape 3,7) et placer dans un tube de 15 mL étiqueté « solution d’inhibiteur de trypsine ». Cela sera utilisé à l’étape 3.12. Après avoir retiré les 3 mL, il y a 7 mL de milieux conditionnés gauche dans le tube « CM ». Le tube « CM » mis de côté jusqu'à l’étape 3,9.
- Retirer les 5 mL de médias et les cellules restantes dans la fiole T75 et placer dans un tube propre 15 mL étiqueté « Cellules ».
- Prendre le métro « CM » contenant 7 mL de milieux conditionnés (de l’étape 3.7.1) et rincer le fond du flacon T75 deux fois avec 3,5 mL de milieux conditionnés, à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL. Après chaque rinçage, placer les portions de 3,5 mL dans le tube de « Cellules ». L’objectif de cette étape est de supprimer tous les neurospheres (cellules) de la fiole T75.
- Centrifuger le tube de « Cellules » à 100 x g pendant 5 min à température ambiante. Alors que les cellules tournent, obtenir une solution de SPD/glucose du bain-marie à 37 ° C et ajouter la quantité appropriée de la trypsine et la DNase selon le tableau 2.
- Après que le tube de « Cellules » a cessé de tourner, supprimer tous le milieu conditionné surnageant et transférer dans le tube « CM ».
- Prenez le métro étiqueté « solution de trypsine inhibiteur » de l’étape 3.7.1. et d’ajouter le volume d’inhibiteur de la trypsine a indiqué dans le tableau 3. Utilisez le même volume de solution d’inhibiteur de la trypsine a été utilisé pour la solution de trypsine.
- Placer solution d’inhibiteur de la trypsine dans le bain d’eau de 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
- Ajoute le culot cellulaire dans le tube de 15 mL de solution de trypsine et Pipeter verticalement environ 5 - 10 fois avec une pipette de 5 mL. Fermer le bouchon du tube et incuber dans un bain-marie à 37 ° C pendant 5 min. Après 5 min, récupérer les cellules et Pipeter de haut en bas 5 - 10 fois. Puis incuber dans le bain-marie à 37 ° C pendant une supplémentaire de 10-15 min.
- Dans les 5 dernières min, déplacer la solution d’inhibiteur de trypsine à la GCS.
- Récupérez les cellules après étape 2.14 est complète et pipeter les cellules de haut en bas jusqu'à ce que les sphères sont complètement dissociées (20 - 30 fois). Puis ajouter immédiatement la solution d’inhibiteur de la trypsine et la pipette de haut en bas 10 fois. Cette solution de cellules dissociées et inhibiteur de la trypsine sera dénommée la « suspension de cellules ».
- Compter le nombre de cellules de la suspension cellulaire en suivant les étapes.
- Pipetter 15 µL du mélange avant le bleu Trypan (contenant 5 µL de 0,4 % Trypan Blue et 10 µL de SPD) sur un bateau de petit poids et ensuite ajouter 5 µL de la suspension cellulaire. Pipetter haut et en bas de 3 - 5 fois pour mélanger. Ensuite, pipette 10 µL de la suspension bleu Trypan/cellules sur chaque côté d’un hémocytomètre recouvert d’une lamelle de verre.
- Observer les cellules sous un microscope optique et compter le nombre total de cellules dans chacune des grilles de quatre coins. Additionnez ces chiffres ensemble.
- Répétez comptant pour l’autre côté et la moyenne des deux côtés ensemble.
- Multipliez ce nombre par 10 000 de donner le nombre total de cellules / mL. Multipliez ce nombre par le nombre de millilitres de calculer le nombre total de cellules de la suspension cellulaire. Calculer le volume de suspension cellulaire est nécessaires pour 5 millions de cellules par T75 flacon de graines.
Remarque : En général, après 9-10 jours, un T75 aura 25 à 30 × 106 cellules. Par conséquent, si passage toutes les cellules dans des fioles de nouveau, un total de 5-6 flacons est nécessaire. - Ajouter le volume de suspension cellulaire calculé à l’étape 3.19 dans chaque fiole T75 pour obtenir 5 × 106cellules par flacon. Si le volume est inférieur à 5 mL, ajouter moyenne condition supplémentaire pour faire à un total de 5 mL. Puis ajoutez 10 mL nouveau DFHGFPS médias contenant des facteurs de croissance (tableau 1) dans le ballon.
- Répétez les étapes 1.17 et 1.18 et s’assurer que le ballon est étiqueté avec le type de cellules, les dates, le nombre de cellules dans le ballon et le nombre de passage (c’est le nombre de fois que la cellule a été repiquée). Puis passer aux étapes 4 à 9.
- Si nécessaire, semence extra cellules dans une fiole de T75 à la densité à 30 × 106cellules par flacon du jour au lendemain et congeler le lendemain après l’étape 4.
4. HNS congélation et stockage
- Au lendemain du passage, récupérez la fiole de l’incubateur contenant les cellules pour congélation (de l’étape 3.19 et 3.22). Inclinez la fiole et enlever toutes les cellules et les moyennes de la fiole et la placer dans un tube de 15 mL. Centrifuger le tube à 216 x g pendant 5 min.
- Au cours du processus de centrifugation, préparer la congélation moyen (tableau 4). Pour chaque 5 × 106 cellules préparent 1 mL de milieu de congélation. Le nombre de cellules a été déterminé à l’étape 3.19 lorsqu’il détermine combien de cellules à mettre dans chaque fiole. Ce nombre n’aura pas changé du jour au lendemain.
- Préparer les flacons de cryo-preserve avec des étiquettes de nom de cellule, nombre de passage, le nombre de cellules, initiales et date. Après centrifugation, retirez le surnageant par aspiration et Resuspendre le culot dans le milieu de congélation afin qu’il y a 5 × 106 cellules/mL. Aide d’une pipette de 5 mL, aliquote 1 mL par flacon et joint serré (5 × 106 cellules par flacon).
- Placer les flacons dans un récipient de cryo-preserve avec 250 mL d’isopropanol (max utilisation de 5 fois par remplacement d’isopropanol). Stocker au congélateur-80 ° C durant la nuit et puis les transférer à un système de stockage d’azote liquide.
5. électrodéposition HNS adhérentes pour validation
- La veille de passage (étapes 3.1-3.22), nettoyer le BSC comme à l’étape 2.2 et obtenir une plaque 24 puits et les lamelles de 12 mm de verre stériles.
- Avec une pincette, déposez un lamelle couvre-objet unique sur le fond de chaque puits de la plaque.
- Enrober les puits contenant des lamelles avec 0,01 % poly-D-lysine (PDL) dans de l’eau stérile et incuber pendant 1 heure à 37 ° c. Pour une plaque 24 puits, utilisez 250 μL de PDL / puits.
- Retirez la PDL provenant des puits et puis enduire de 1 µg/cm2 laminin/SPD (250 μL / puits). Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C. Si ce n’est pas le cas nécessaire le lendemain, sceller la plaque avec du parafilm en encapsulant le parafilm autour des bords de la plaque et conserver à 4 ° C.
NOTE : Plaques recouvertes de laminine peuvent être conservés jusqu'à 2 semaines si étanche avec du parafilm aussi longtemps que les lamelles ne séchez pas. - Cellules de passage comme décrit aux étapes 3.1-3.22 et ensuite déterminant le nombre de cellules aux semences dans la plaque 24 puits avec enduit lamelles couvre-objet.
- Supprimer n’importe quelle solution de laminine excès de puits par aspiration et rincez une fois avec 0,5 mL de SPD. Puis les semences des cellules dans les puits à une densité de 0,6-1 x 105 cellules/cm2 / puits. Utiliser les cellules restantes selon étapes 3.16-3.21.
- Atvarious fois au cours de la culture de la plaque 24 puits, difficulté et tacher les cellules pour divers marqueurs de cellules souches après l’étape 9.
6. amorçage afin d’obtenir des neurones GABA et du glutamate
- Les cellules comme décrit dans 3.1-3.22, de passage et puis de déterminer le nombre de cellules à graines dans une assiette de 24 puits comme au point 5.6.
- La veille de l’amorçage, préparer les lamelles et la plaque de couche comme décrit aux points 5.1 à 5.4.
- Le jour de l’amorçage, récupérer les flacons contenant des cellules de 2-3 jours. Placer dans un tube de 15 mL et les cellules de granule par centrifugation à 100 x g pendant 5 min.
- Préparer le milieu de l’amorçage de facteur inhibiteur/laminine (ELL) facteur de croissance épidermique/leucémie conformément au tableau 5.
- Remettre en suspension les cellules avec le coude du milieu.
- Graine suspendue cellules dans une assiette de 24 puits (suivre point 5.6).
7. amorçage afin d’obtenir des neurones moteurs
- Suivez les étapes 6.1-6.4.
- Préparer le milieu de l’amorçage (FHL) de facteur de croissance/héparine/Laminin de basique des fibroblastes selon tableau 6.
- Suivez l’étape 5,6.
8. infection par le Virus Zika
NOTE : ZIKV est très sensible à la température, donc il est impératif que le stock ZIKV sont conservés à - 80 ° C et le gel/dégel cycles de séchage sont évités. Continuer à travailler sur la glace aliquotes.
- Cellules de passage comme décrit aux points 3.1-3.22. cellules 3 millions au total sont nécessaires pour amorcer une plaque 24 puits, donc quand passage, mettez le nombre de cellules nécessaires pour l’infection et l’ensemencement dans un ballon lors de passage.
- Si l’ensemencement de cellules dans une plaque 24 puits pour la coloration, préparer la plaque suivant étapes 5.1 à 5.4 et lamelles couvre-objet.
- Après passage, placer 1 mL de suspension cellulaire de l’étape 8.2 dans un tube de microtubes de 1,5 mL et centrifuger à 200 x g à température ambiante pendant 5 min. Puis retirez le surnageant par aspiration.
- Resuspendre le culot de l’étape 8,3 en stock ZIKV d’acquérir une multiplicité d’infection (MOI) de 1 à 10. Le volume de solution ZIKV ne doit pas dépasser 0,5 mL. Pour un traitement simulé (hématies), remettre en suspension les cellules dans le même volume et le type de support utilisé en stock ZIKV.
Remarque : L’infection et la préparation de ZIKV sont détaillées dans une précédente publication11. Les infections simulacres sont également réalisées avec support. - Incuber au-dessus d’un mélange cellulaire/ZIKV à 37 ° C pendant 1 h. inverser le tube 2 - 3 fois et puis centrifuger mélange pendant 5 min à 216 x g à température ambiante pour obtenir un culot cellulaire. Resuspendre culot au SPD et centrifuger à nouveau pendant 5 min à 216 x g à la température ambiante.
- Retirez le surnageant par aspiration, remettre en suspension les cellules avec un moyen approprié et charger les cellules infectées dans la fiole ou plaque nécessaire pour l’expérience. Si l’ensemencement des cellules dans une plaque de 24 puits Resuspendre le culot dans 12 mL de milieu approprié et puis ajouter 500 μl de suspension dans chaque puits.
Remarque : À ce stade soit maintenir les cellules en milieux de croissance pour observer les effets de ZIKV sur les cellules souches, ou aller aux étapes 6 ou 7 pour étudier l’effet du ZIKV sur le processus de différenciation.
9. procédure de coloration
- Pour fixer les cellules, éliminer le milieu, rincez une fois avec 0,5 mL par puits (plaque 24 puits) de glace froide phosphate salin (PBS).
- Enlever les PBS et couvrir les cellules avec 0,5 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS et laisser à température ambiante pendant 20 à 30 min.
- Enlever le paraformaldéhyde et rincer les cellules trois fois avec 0,5 mL de PBS, laissant le troisième rinçage PBS pendant 10 min à température ambiante.
- À ce stade laissez le PBS dessus durant la nuit et stocker la plaque à 4 ° c ou commencer une coloration après le rinçage de 10 min.
- Après le rinçage de 10 min de PBS, bloquer les cellules pendant 45-60 min en position stationnaire avec une solution de 0,5 mL de 5 % de sérum de chèvre normal (NGS), 0,3 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,25 % X-100 Triton en tampon Tris salin (SCT). Par exemple, pour faire 1 mL de solution utilisation de blocage : 10 µL de 25 % Triton X-100, 50 µL de 100 % NGS et 100 µL de 3 % de BSA mélangés dans 840 µL du SCT.
- Pendant l’étape de blocage, préparer la solution d’anticorps primaire, en s’assurant que tous les réactifs sont conservés sur la glace. Pour la validation des hNSCs, protéines comme Nestin peuvent être ciblés à l’aide de l’anticorps appropriés à leur encontre. Pour valider une infection ZIKV, utilisez un anticorps contre ZIKV coat protein11. Pour la différenciation, utilisez marqueurs comme classe III β-tubuline pour identifier les populations neuronales protéine fibrillaire acide gliale (GFAP) peut être utilisés pour identifier les astrocytes. Les concentrations d’anticorps primaires sont déterminées empiriquement selon le fournisseur et le lot. Nous avons utilisé des anticorps plus de 1/100 à une dilution de 1 : 2000.
- Centrifuger l’anticorps primaire à 12 000 x g pendant 2 min à 4 ° C et ensuite faire une dilution ; par exemple pour réaliser une dilution au 1/1000 d’anticorps, ajouter 7,2 µL d’anticorps désiré dans 7,2 mL de 0,25 % X-100 Triton dans les directives du SCT.
- Ajouter environ 300 µL de solution d’anticorps dans chaque puits d’une plaque 24 puits et incuber les cellules avec l’anticorps primaire en position stationnaire pendant 2 h à température ambiante ou à 4 ° c durant la nuit en position stationnaire.
- Après l’incubation, laver les cellules avec 0,5 mL de TBS trois fois à température ambiante pendant 10 minutes chacun en position stationnaire.
- Centrifuger l’anticorps secondaire à 12 000 x g pendant 2 min à 4 ° C, puis diluer la solution de Triton X-100/TBS de 0,25 %. Faire suffisamment de solution anticorps pour ajouter 300 µL à chaque puits. Ici, diluer l’anticorps secondaire fluorescents 1/500 (Figure 3).
- Après que le SCT final lavage, ajouter 300 µL de la solution d’anticorps secondaire dans chaque puits et incuber dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante dans une position stationnaire. Dès lors, toutes les mesures doivent avoir lieu dans une pièce sombre.
- Laver les cellules trois fois avec le SCT pour 10 min chacun en position stationnaire.
- Lors du dernier lavage de 10 min, diluer le marqueur nucléaire nucléaire DAPI tacher à la concentration recommandée au SCT (typiquement 1 : 1 000 - 5 000:1). Faire suffisamment de solution pour ajouter 300 µL à chaque puits.
- Après le lavage final, ajouter 300 µL de solution de DAPI dans chaque puits et incuber pendant 5 min à température ambiante dans une position stationnaire. Puis laver une fois avec 0,5 mL du SCT.
- Utiliser un support de montage anti-fondu pour fluorescence et 1 goutte (10-15 µL) par lamelle qui sera placé sur la diapositive. Utilisez soigneusement pince à épiler pour retirer les lamelles provenant des puits de la plaque 24 puits et placez la surface de la cellule vers le bas sur la baisse moyenne de montage sur la diapositive.
- Une fois les lamelles sont placés sur la diapositive, placez la dans un plat porte-diapositive. Assurez-vous de diapositives étiquette aura toutes les informations pertinentes nécessaires pour identifier les cellules sur cette diapositive, puis recouvrir le support avec papier d’aluminium pour garder les diapositives abri de la lumière.
- Stocker les lames à 4 ° c et laisser le milieu de montage solidifier durant la nuit. Le lendemain, observer la diapositive à l’aide d’un microscope à épifluorescence avec filtre UV-2F/C (340-380 nm), GFP Jean-Sébastien BP filter (450-490 nm) ou Y-2F/C Texas filtre rouge (540-580 nm), un grossissement de 20 X.
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Representative Results
HNSCs cultivés dans leur stade prolifératif augmentera comme non adhérents neurospheres (Figure 1). Immédiatement après le passage de la HNS, il y aura beaucoup de cellules individuelles, qui agrègent et commencera à sphères forme dans les prochains jours (Figure 1 a et 1 b). Sphères en bonne santé devraient être environ 1-2 mm de diamètre 9-10 jours suite à un passage (Figure 1). Les sphères qui poussent plus de 2 mm mettra au point un centre sombre et les facteurs de croissance dans le milieu ne sera pas en mesure d’atteindre les cellules dans le centre de la sphère, ce qui entraîne une différenciation non désirée. Sphères en santé apparaît translucides et afficher les faux cils sur les bords de la sphère (Figure 1).
Placage neurospheres sur une surface d’adhérence à des fins de coloration se traduira par la croissance des sphères adhérentes (Figure 2 a). Ces sphères vont toucher la surface du récipient de la culture et ont certaines projections qui s’étend sur la surface du bateau, tout en conservant une sphère centrale (Figure 2 a). D’amorçage et de différencier les cellules nécessitent les cellules d’adhérer à une lamelle au fond d’une plaque de culture de cellules, comme une plaque 24 puits. Suite aux étapes d’amorçage approprié et l’ajout du support de différenciation, les cellules seront répartis sur la surface du récipient de la culture et grandir en tant qu’interconnecté monocouche de cellules (Figure 2 b).
Pour soit confirmer la validité de la culture de HNS ou phénotype de cellules différenciées, immunohistochimie fluorescent peut être utilisé. Nestin est un filament intermédiaire communément exprimée en CNS et peut être utilisé pour vérifier la culture HNS (Figure 3 a). Pour vérifier la présence de neurones après différenciation, classe III β-tubuline permet généralement aux neurones de l’étiquette (Figure 3 b). Bien que l’étape d’amorçage sert à obtenir un pourcentage plus élevé de neurones après différenciation, il y aura encore des astrocytes dans la culture. Protéine fibrillaire acide gliale (GFAP) peut servir à astrocytes étiquette afin de quantifier quel pourcentage de cellules différenciées sont devenus astrocytes ou neurones.
Nous avons constaté que la ligne K048 des CNS a été infectée par des souches africaines et asiatiques de ZIKV détectés par immunofluorescence avec un anticorps spécifique de la ZIKV. Les images représentatives sont indiquées à la Figure 4. Simulacre infection ne pas permis d’obtenir un changement de morphologie HNS ou de survie (Figure 4 a, 4C). ZIKV a tendance à rester dans la région périphérique d’un poste de jour une cellule infectée, une infection de 1 heure, mais remplit la cellule entière à 3 à 7 jours (Figure 4 b4D, 4E). Visiblement, avec la même MOI (0,1), un taux estimé à 5 % d’infection dans les cellules K048 est considérablement plus bas que ceux rapportés récemment ZIKV infection taux humain peau induite par le CNS7(jusqu'à 80 %). Cette étude, 80 % l’infectivité, utilisé le prototype de souche africaine de ZIKV (MR766) qui peut ont adapté un phénotype neurotrope pendant plus de 140 passages dans les cellules de cerveau de souris.
Figure 1 : images de champ lumineux de la culture de HNS. (A-C) Champ lumineux représentant images prises à un grossissement de X 10 jours culture 1, 4 et 9 HNS après passage, respectivement. Barreaux de l’échelle : 60 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : images de champ lumineux de cultures adhérentes. (A) images de champ lumineux représentant prises au grossissement de 10 X de culture adhérent HNS, 7 jours après l’ensemencement. (B) images de champ lumineux représentant prises à un grossissement de X 10 des adhérentes différencient de cellules après ELL d’amorçage et 9 jours de différenciation. Barreaux de l’échelle : 60 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : images fluorescentes de hNSCs et de cultures différenciées. (A) représentant fluorescents images prises à un grossissement de X 20 de hNSCs adhérentes colorées avec des marqueurs nucléaires, DAPI (bleu) et marqueur de cellules souches Nestin (rouges). Echelle : 60 µm (B) les images fluorescentes représentatives prises à grossissement 60 X des cellules différenciées colorées au marqueur neuronal βIII-tubuline (vert), fabricant d’astrocytes GFAP (rouge) et marqueurs nucléaires DAPI (bleus). Barreaux de l’échelle : 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : l’infection ZIKV chez les humains foetaux encéphales CNS. CNS humaines ont été traités soit simulé (A et C), inoculé pendant une heure avec une souche de la lignée africaine de ZIKV à MOI de 0,1 (B et D), ou avec la souche asiatique de ZIKV récemment isolé contre les moustiques au Mexique en 2016 (E). Immunofluorescence détecte l’étiquetage des anticorps ZIKV dans le CNS à un à sept jours après l’inoculation (dpi 1 b, 7 d et 3 PPP par E). Échelle bars et 10 µm A-D et 5 µm dans E. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Médias DFHGPS pour un T75 | 10 mL |
| PPT * | 173 ΜL |
| 200 mM L-Glutamin | 50 ΜL |
| 10 mg/mL d’insuline ** | 25 ΜL |
| facteur de croissance épidermique de 20 µg/mL | 10 ΜL |
| facteur de croissance fibroblastique base 20 µg/mL | 10 ΜL |
| facteur d’inhibiteur de leucémie 10 µg/mL | 10 ΜL |
| 5 mg/mL héparine | 10 ΜL |
| * Mélange contenant 100 µg/mL la transferrine, 100 µM putresine, 20 nM progestérone et sélénite de sodium 30 nM. Le mélange est fabriqué à partir des stocks de concentré et parties aliquotes sont conservés à-80 ° C et preferablly utilisés dans les 6 semaines de préparation. Les stocks de concentré sont la transferrine 10 mg/mL, putrescine 30 mM, 10 progestérone µM et 15 sélénite de sodium µM stockées à-80 ° c. | |
| ** L’insuline se dissout dans 0,01 N hydroen chlorure, filtrée par le filtre de liaison 0,2 µM hypoprotidique et stockés à 4 ° c pendant 6 semaines. | |
Tableau 1 : facteurs de croissance pour le nouveau médium de la prolifération.
| SPD * | 1 mLune | 3 mLb |
| 10 % de glucose | 60 ΜL | 180 ΜL |
| 2,5 % trypsine | 10 ΜL | 30 ΜL |
| DNase ** | 5 ΜL | 15 ΜL |
| Solution saline tamponnée au phosphate de le Dulbecco | ||
| ** Désoxyribonucléase | ||
| un pour 10 millions de cellules | ||
| b pour 30 millions de cellules | ||
Tableau 2 : Préparation de la trypsine.
| Milieux conditionnés | 1 mLune | 3 mLb |
| Inhibiteur de la trypsine | 10 ΜL | 30 ΜL |
| un pour 10 millions de cellules | ||
| b pour 30 millions de cellules |
Tableau 3 : Préparation de l’inhibiteur de la trypsine.
| DFHGPS * | 0,7 mLun | 2,1 mLb |
| FBS ** 20 % | 0,2 mL | 0,6 mL |
| DMSO *** 10 % | 0,1 mL | 0,3 mL |
| * DMEM, F12, HEPES, glucose, pénicilline-streptomycine | ||
| ** Sérum de veau fœtal | ||
| Sulfoxyde de diméthyle | ||
| un pour 5 millions de cellules dans un flacon | ||
| b de trois flacons, 5 millions de cellules/flacon | ||
Tableau 4 : préparation du gel médium.
| DFGHPS * pour un puits dans une plaque 24 puits | 1 mL |
| PPT ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM de L-glutamine | 5 ΜL |
| 10 mg/mL d’insuline | 2,5 ΜL |
| facteur de croissance épidermique de 20 µg/mL | 1 ΜL |
| facteur inhibiteur de leucémie de 10 µg/mL | 1 ΜL |
| 1 mg/mL laminine | 1 ΜL |
| * Contenant de la pénicilline-streptomycine, HEPES, DMEM, glucose, F12 | |
| ** Contenant 100 µg/mL de la transferrine, 100 µM putresine, | |
| 20 nM progestérone et sélénite de sodium 30 nM | |
Tableau 5 : Préparation du support d’amorçage ELL.
| DFGHPS * pour un puits dans une plaque 24 puits | 1 mL |
| PPT ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM de L-glutamine | 5 ΜL |
| 10 mg/mL d’insuline | 2,5 ΜL |
| facteur de croissance fibroblastique base 20 µg/mL | 0,5 ΜL |
| 5 mg/mL héparine | 0,5 ΜL |
| 1 mg/mL laminine | 1 ΜL |
| * Contenant de la pénicilline-streptomycine, HEPES, DMEM, glucose, F12 | |
| ** Contenant 100 µg/mL de la transferrine, 100 µM putresine, | |
| 20 nM progestérone et sélénite de sodium 30 nM | |
Tableau 6 : Préparation du support d’amorçage FHL.
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Discussion
La capacité de la culture et de manipuler des hNSCs fournit un outil essentiel qui peut être utilisé pour une variété de fins de modélisation des maladies humaines à drogue haut débit préalable10,11,12,14, 15,16,17. Beaucoup de questions restée à traiter comme le cerveau foetal humain comment CNS ou leur progéniture est susceptibles d’être ZIKV infection, si les différentes souches de ZIKV infectent CNS avec la même efficacité et comment infection pendant le développement neural se traduit par une microcéphalie. Nous avons utilisé cette culture HNS pour étudier Zika virus associés neuropathologie11,14. À l’aide de trois souches de cellules isolées de trois donateurs individuels, nous sommes également en mesure de comparer les différences de susceptibilité à des déficits neurologiques observés suivant ZIKV infection11. Une des limites de cette technique est l’accessibilité à des échantillons de HNS et du milieu conditionné essentiel pour la culture appropriée. Pour contourner cet obstacle, veuillez communiquer avec l’auteur-correspondant pour organiser un transfert de matériel comme les cellules utilisées dans le présent protocole ne sont pas disponibles dans le commerce.
Les études in vitro utilisant des hNSCs non seulement donnent un aperçu unique de comportement de base des cellules souches, ils fournissent également une excellente plateforme pour mener des recherches précliniques. Cependant, les défis techniques de culture hNSCs peuvent servir comme un obstacle à leur utilisation comme modèles efficaces et reproductibles. Dans ce protocole, nous avons défini les étapes clés et des méthodologies qui peuvent être utilisés pour réduire la variabilité des méthodes de culture et produisent une culture de cellules souches saines et stables HNS. Un inconvénient de l’utilisation de la culture Neurosphère HNS est que les cellules sont extrêmement sensibles aux stimuli toutes. Même avec le protocole détaillé ci-dessus, il est essentiel de porter une attention particulière à combien les fioles ou les plats de hNSCs sont manipulés, comme les variations plus subtiles sur le protocole peuvent entraîner des changements dans le comportement de Neurosphère.
La plus importante partie de cet article de méthodes est le cocktail de facteurs de croissance et de la préparation des différents médias. Si le temps de doublement de la culture de l’HNS est très faible, ou de nombreuses cellules adherie pour le récipient de culture (alors qu’ils devraient être non adhérents), la première étape consiste à s’assurer que les facteurs de croissance utilisés sont la concentration appropriée et n’a pas expiré. Tous les facteurs de croissance dans le présent protocole ont une très courte durée de conservation après décongelée (5-6 jours). En outre, nous avons utilisé des facteurs de croissance de plusieurs sociétés et remarqué des différences dans la qualité et la concentration nécessaires pour maintenir la culture. Par conséquent, nous recommandons fortement à partir des facteurs de croissance exacts indiqués dans le Tableau des matériaux. L’étape passaging (étapes 3.1-3.22) est également une source commune d’erreur. S’il y a beaucoup de cellules mortes suite au processus de dissociation, réduire le nombre de fois de pipetage de haut en bas pour dissocier les cellules, comme trop dissociation physique peut entraîner la mort cellulaire. Alternativement, s’il n’y a de nombreux amas de cellules après l’étape de dissociation, augmentation le vigor ou le nombre de fois de pipetage de haut en bas, comme ces amas va rapidement devenir grandes sphères qui ne restera pas viables dans la culture. Si la culture est correctement entretenue, Infectionà ZIKV est relativement simple.
Alors que l’infection à ZIKV est le traitement détaillé dans le présent protocole, il est possible d’utiliser ce système de culture HNS pour un large éventail d’études. Ce système de modèle peut servir de médicaments de l’écran, examiner la susceptibilité individuelle et enquêter sur les mécanismes sous-jacents d’une variété de maladies et de troubles du développement14. Ce système est également idéal pour les études de génomique depuis les cellules cultivées n’ont pas été génétiquement manipulés et montrent peu ou aucune anomalie chromosomique, même jusqu'à 80 passages10,11. Nous croyons que ce système de culture est idéal pour la modélisation in vitro , comment les stimuli environnementaux tels que l’infection, médicaments, alcool, toxines, etc. peuvent influencent le développement du système nerveux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds de le S. John Dunn Foundation et l’Institut des infections chez l’homme et de l’immunité de l’University of Texas Medical Branch (P.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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