Summary
Denne artikkelen omhandler metodene som brukes til å utvide menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller i kultur, samt hvordan å skille dem i ulike neuronal subtyper og astrocyttene, med hovedvekt på bruk av nevrale stamceller å studere Zika virusinfeksjon.
Abstract
Menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller er en unik ikke-genmodifisert modell-system for å studere virkningen av ulike stimuli på menneskelig utviklingsmessige nevrobiologi. Heller enn å bruke en dyremodell eller genmodifiserte indusert pluripotent celler, gir menneskelige embryonale stamceller en effektiv i vitro system for å undersøke effektene av behandlinger, skjermen narkotika, eller undersøke individuelle forskjeller. Her gir vi detaljerte protokollene for metoder brukes til å utvide menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller i kultur med serum-frie medier, å skille seg ut forskjellige nevrale subtyper og astrocyttene via forskjellige grunning prosedyrer, og å fryse og gjenopprette disse cellene. I tillegg beskriver vi en prosedyren for bruk av menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller Zika virusinfeksjon.
Introduction
Zika virus (ZIKV) er en flavivirus overføres seksuelt, eller av mygg vektorer Aedes aegypti og Aedes albopictus myggen. ZIKV nylig ble oppdaget som en alvorlig folkehelsen trussel på grunn av sin brukervennlighet overføring og tilknyttet nevrologiske symptomer1. En av mest om nevrologiske effekter er utviklingen av microcephaly i fostre født infiserte graviditet2,3. Microcephaly er en neurodevelopmental lidelser der hodet er mindre enn vanlig størrelse under fosterutvikling og fødsel omkretsen mindre enn 2 standardavvik under mener4. Den mindre hodeomkrets er vanligvis ledsaget av en rekke samtidige som utviklingsmessige forsinkelser, beslag, visjon og hørselstap og fôring problemer.
Nyere studier har brukt dyremodeller eller indusert pluripotent stamceller å studere effekten av ZIKV på neurodevelopment5,6,7,8. Mens disse studiene har bidratt til vår kunnskap om ZIKV, bruk av ulike arter eller genmodifiserte celler kan være tidkrevende og/eller legge til flere variabler som kan forvirre effekten av ZIKV på celler utvikling av neural5, 6 , 7 , 8. problemer med hNSC kultur, særlig ikke-tilhenger neurosphere kulturen beskrevet i denne protokollen, er imidlertid at kulturen er svært følsomme for metodene som brukes til å gjennomføre kultur9. Endringer i mellomstore komponenter eller selv den fysiske håndteringen av kultur fartøyet, er nok til å lokke fram en reaksjon fra celler9. For å løse disse problemene, utviklet vi en i vitro menneskelige fosterets hjerne-avledet nevrale stamceller (hNSCs) kultur for å avhøre mechanistically effekten av ZIKV på fetal nevrale stamceller. Bruke våre metoden ble hNSCs opprettholdt for over 80 passasjer uten tilsynelatende fenotypiske endringer10. Videre chromosomal endringer som trisomy var enten ingen eller minimal11. HNSC kultur vokser som en ikke-tilhenger neurosphere kultur. En fordel med neurospheres er at kulene opprette en unik miljømessige nisje i kultur som er mer reflektert i vivo nisjer i forhold til todimensjonal kulturer9. En annen fordel med denne protokollen er at flere celletyper kan utledes fra hNSC kultur, slik at en etterforsker å observere virkningen av en gitt variabel hNSC overlevelse og differensiering. Denne protokollen gjelder personer ute for å svare mekanistisk spørsmål angående sentralnervesystemet utvikling eller dysfunksjon. Følgende protokollen beskriver hvordan å utvide en hNSC kultur for å infisere med ZIKV, og deretter skille hNSCs å observere virkningen av infeksjon på differensiering prosessen. Det inkluderer også lagre hNSCs for langsiktig bruk, og å skille hNSCs i ulike typer nerveceller som tillate ytterligere undersøkelse av ZIKV-indusert underskudd bidra til hjernen misdannelse11. Vi tror denne protokollen er også av interesse for etterforskere søker å forstå virkningen av eventuelle miljømessige stimulans som infeksjon eller giftstoffer på nevrale stamceller overlevelse og differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelige embryonale stamceller var opprinnelig avledet fra forkastet menneskelige føtal cortexes i den første trimester12. Alle protokollen prosedyrer overholder University of Texas Medical Branch etiske retningslinjene for bruk av menneskelige, og cellen linjene ble godkjent av institusjonelle Biosafety utvalget.
1. lager medium forberedelse og stamcelleforskningen utvinning
- Forberede kultur medium lager (DFHGPS) ved å kombinere reagenser i trinn 1.1.1.-1.1.5.
- Legge til 210 mL av Dulbeccos endret Eagle Medium med høy glukose og L-glutamin (D). Lagre den på 4 grader.
- Legge til 70 mL Ham F12 næringsstoff blanding med L-glutamin supplement (F). Lagre den på 4 grader.
- Legge til 4,2 mL 15 mM HEPES Buffer (H) og oppbevares ved romtemperatur.
- Legge til 4,2 mL 10% D-glukose løsning (G) og oppbevares ved romtemperatur.
- Legge til 2,88 mL av penicillin/streptomycin (PS) løsning. Aliquot lager løsningen i 3 mL dele og lagre dele på 20 ° C til nødvendig.
Merk: Den endelige konsentrasjonen av penicillin i medium vil være 100 enheter/mL konsentrasjonen av streptomycin blir 100 µg/mL. Dette mediet vil bli referert til som DFHGPS for resten av protokollen og bør lagres på 4 ° C for bruk innen 1-2 uker. Eventuelt DFHGPS kan bli skalert proporsjonalt.
- Dagen før celler gjenopprettes, pels en MT75 kolbe med 5 mL av betinget medium, innhentet fra tidligere kulturer av hNSC celle linjen og la i en 37 ° C inkubator 8.5% karbondioksid (CO2) over natten.
Merk: Hvis tiden dyrking hNSCs, lagre mediet som celler har vært økende i under en middels endring. Dette er betinget medium som det har vært "betinget" av cellene. Betinget medium kan lagres i et skrukork rør og lagret på 4 ° C i ca 7 dager. Kontakt tilsvarende forfatteren å motta hNSCs. Betinget medium er foretrukket men ikke helt nødvendig, særlig når først begynner kulturen i hNSCs. - Utvinning, varme 20 mL DFHGPS i et 50 mL skrukork rør i et vannbad 37 ° C i minst 10 min og holde den i vannbad til klar til bruk.
- I en separat 15 mL skrukork tube, varme 10 mL av DFHGPS i et vannbad 37 ° C i minst 10 min og holde det i vannbad helt klar til å bruke i trinn 1.13.
- Hente en beholder isen og alle mellomstore komponenter (tabell 1). Tine alle mellomstore komponenter på isen og la dem på isen mens forbereder middels endringen.
- Få 5 mL av betinget middels lager (lagret på 4 ° C) og holde den i et vannbad 37 ° C til klar til bruk i trinn 1.14. Se merknad etter trinn 1.2 Hvis det er ingen aircondition middels eller nåværende menneskelige fosterets nevrale stamceller kultur.
- Hente 50 mL skrukork røret fra trinn 1.3 og plasserer den i biosikkerhet kabinett (BSC). Overfør 10 mL av DFHGPS i en ny 15 mL skrukork tube, og plasser den 50 mL tube inneholder de resterende 10 mL av DFHGPS medium tilbake i vannbad 37 ° C.
- Få cryo-ampuller med hNSCs lagret i flytende nitrogen. Se merknad etter trinn 1.2 Hvis det er ingen gjeldende menneskelige fosterets nevrale stamceller kultur.
Merk: Menneskelige embryonale stamceller var opprinnelig avledet fra forkastet menneskelige fosterets hjerne12 og vedlikeholdes i kultur uten genetiske modifikasjoner10. 5 × 106 celler skal Tint og belagt på et MT75 kolbe. Hvert cryo-hetteglass skal inneholde 5 × 106 celler. Derfor er en flaske per kolbe nødvendig. - Tine ampuller med celler i 37 ° C vannbad ved å snu ampullen hver 10 for ca 1 min eller til is er smeltet og innholdet av ampullen er helt flytende. Ikke dykke hele ampullen under vann for å unngå potensielle forurensning.
- I BSC-maskin, kan du bruke en P1000 mikro-pipette Sug opp tinte celle løsningen og legge den drop-wise til 15 mL røret fra trinn 1.7, som inneholder 10 mL av DFHGPS. For å legge til tinte cellen løsning drop-wise, langsomt trykk ned på stempelet slik at bare en dråpe eller to frigis samtidig. I mellomtiden swirl 15 mL røret for å tillate en rask blanding.
- Sentrifuge celle suspensjon 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast nedbryting, og pass på å beholde celle pellets.
- Under trinn 1.11, hente 50 mL tube med de resterende 10 mL fra trinn 1.7. Etter sentrifugering, resuspend celle pellet i 10 mL DFHGPS og sentrifuger igjen 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Under den siste spinn, klargjør nye vekstmediet av følgende tabell 1 å legge til vekstfaktorer på 10 mL av DFHGPS medium fra trinn 1.4 (tabell 1) i BSC. La det nye mediet som inneholder vekstfaktorer i BSC til klar til bruk.
- Hente MT75 kolbe fra trinn 1.2 og kast betinget mediet belegg kolbe av aspirasjon. Deretter Legg den 5 mL betinget medier fra trinn 1.6. bruker en serologisk pipette til kolbe. Pass på at du ikke skraper bunnen av flasken.
- Hente tube celler fra sentrifuge og kast nedbryting av aspirating, røres celle pellets.
- Resuspend celle pellet i 10 mL av nye medier fra trinn 1.13 ved hjelp av en 5 mL serologisk pipette og pipettering opp og ned flere ganger. Legge til suspensjon belagt MT75 kolbe fra trinn 1.14. Bruk det resterende 5 mL skylle røret som inneholdt celle-pellets, og deretter legge til de 5 mL kolbe også.
- Rock MT75 kolbe frem og tilbake 3 ganger for å sikre cellene er jevnt fordelt over kolbe. Kontroller kolbe hetten er løs at luftstrømmen. Under lys mikroskop observere cellene, ta notater og ta bilder hvis mulig.
Merk: Cellene skal se gjennomsiktig og sfærisk. Merk Hvis det er celler det se mørkt, ugjennomsiktig eller har asymmetrisk landegrenser som dette kan angi celledød. Også se for noen fungal eller bakteriell forurensning, for eksempel media bli gul i fargen. - Plass kolbe celler i en 37 ° C inkubator med 8,5% CO2.
Merk: Bruk 8,5% stedet for 5.0% CO2 for å opprettholde pH i denne serum-fri kultur medier mellom 7.1-7.4.
2. hNSC Medium endring
Merk: Endre medium hver 3-4 dager.
- Slå på BSC og rengjør grundig med 70% etanol. Observere cellene under et lys mikroskop.
Merk: Lage notater på utseendet til cellene og sphere størrelser. Tre dager etter gjenoppretting eller passasje, vil celler klynge sammen og begynner å danne ikke-tilhenger neurospheres.
Advarsel: Hvis cellene overholder bunnen av flasken, kulturen må forkastes som cellen etterlevelse vil øke tidlig differensiering og celler vil kunne opprettholde en stilk tilstand. Hvis det er for mange celler i flasken, cellene kan danne store kuler (større enn 2 mm i diameter) da, celler midt i sfæren vil begynne å skille på grunn av mangel på tilgang til vekst faktorer i medium. Hvis kuler større enn 1 mm i diameter er observert, kan celler passaged (trinn 3.1-3,22). - Følg trinn 1,4 og 1,5 og forberede 10 mL av fersk medium (se trinn 1.13).
- Tilt kolbe til siden, slik at å synke å bunnen av flasken.
- Fjerne 5 mL betinget medier fra toppen av grupperte mediet bruker en 5 mL serologisk pipette, ta vare ikke å Sug opp alle neurospheres. Plass det 5 mL betinget medier i en ren 15 mL tube.
- Fjerne en ekstra 5 mL betinget medier fra flasken, igjen nøye unngå Sfærene, og plasser den 5 mL i samme 15mL rør.
- Legge til 10 mL av nye medier fra trinn 2.2 de resterende 5 mL av betinget media og celler i flasken. Angi kolbe ned flatt og observere cellene under et lys mikroskop.
- Hvis det vises celler har blitt pustende under innsamling av betinget medium, spinne betinget middels på 100 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Nytt suspendere celler som akkumuleres nederst i 1 mL av betinget medium, og deretter legge dem til kultur kolbe.
- Lagre den 10 mL av ubrukte betinget medier fra trinn 2.5/2.6 på 4 grader i et 15 mL skrukork rør.
- Gjenta trinn 1.17/1.18.
3. hNSC passasje
Merk: hNSCs må være passasje hver 9-11 dager hvis cellene vokse normalt som befolkningen dobling tid er ca 3 dager13.
- Hvis utvide NSCs til en ny kolbe, sikre alle nye flasker er belagt som i trinn 1.2.
- Rengjøre BSC i trinn 2.1, og utføre trinn 1,4 og 1,5.
- Forberede medium som i trinn 1.13. Hver MT75 kolbe krever 10 mL av medium. For flere MT75 flasker, multiplisere 10 mL av media av antall flasker.
- Forberede enten 1 eller 3 mL Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (dPBS) og glukose og sted i en 37 ° C vannbad å varme i 10 min (for trypsin løsning) i henhold til volumene i tabell 2. Ikke Legg trypsin eller DNase nå. DNase kan være nødvendig å bryte ned noen DNA fra de døde cellene på grunn av mekanisk eller kjemikalie celle dissosiasjon.
Merk: For en MT75 kolbe passaged etter 9-10 dager av vekst det vil være ca 30 × 106 celler, hvis 5 × 106 var opprinnelig frø på flasken. 1 mL av dPBS løsning brukes vanligvis til 10 × 106 celler. 3 mL dPBS løsningen er derfor nødvendig for en MT75 kolbe passaged etter 9-10 dager. - Sted feilfri små veier båt og hemocytometer i panseret. Rengjør med 70% etanol og la luften tørr i panseret for ca 5 min.
Merk: Veie båten skal brukes i trinn 3.17.1. - Hente kolbe celler som vil bli passaged fra inkubator og bringe i BSC. Tilt kolbe forsiktig slik at cellene til synke å bunnen av grupperte media. Det er ca 15 mL av media i flasken.
- Fjern ca 10 mL av media i 5 mL deler (dvs. 5 mL + 5 mL). Plass denne 10 mL av media i en ren 15 mL tube merket "CM" for "betinget medium". Vær forsiktig med å Sug opp noen av cellene i den gjenværende 5 mL av media i flasken; disse cellene og 5 mL av media vil bli utsatt for trinn 3.8.
- Ta 3 mL betinget media fra "CM" røret (fra trinn 3.7) og plasser i en 15 mL tube merket "trypsin inhibitor løsning". Dette vil bli brukt i trinn 3.12. Etter fjerning av de 3 mL er 7 mL av betinget media venstre i "CM" røret. Avsette "CM" røret til trinn 3.9.
- Fjern de 5 mL av media og celler igjen i MT75 kolbe, og plasser i en ren 15 mL tube merket "Celler".
- Ta "CM" røret som inneholder 7 mL av betinget media (fra trinn 3.7.1) og skyll nederst MT75 kolbe to ganger med 3,5 mL deler av betinget media, bruker en 5 mL serologisk pipette. Etter hver skylling, plassere den 3,5 mL delen inn i "Celler" røret. Formålet med dette trinnet er å fjerne alle neurospheres (celler) fra MT75 kolbe.
- Sentrifuge "Celler" røret 100 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Mens celler er spinner, få dPBS/glukose løsning fra 37 ° C vannbad og legge til riktig mengde trypsin og DNase etter tabell 2.
- Etter "Celler" røret har stoppet spinning, fjerne alle betinget medium supernatant og overføre til "CM" røret.
- Ta av røret merket "trypsin inhibitor løsning" fra trinn 3.7.1. og legge volumet av trypsin hemmer angitt i tabell 3. Bruk samme volum trypsin inhibitor løsning som ble brukt for trypsin løsningen.
- Plasser trypsin inhibitor løsning i vannbad 37 ° C inntil nødvendig.
- Legg trypsin løsning til celle pellet i 15 mL tube og Pipetter opp og ned ca 5 - 10 ganger med en 5 mL pipette. Lukk lokket av røret og ruge i et vannbad 37 ° C i 5 min. Etter 5 min, hente cellene og Pipetter opp og ned 5 - 10 ganger. Deretter ruge i vannbad 37 ° C for en ytterligere 10-15 minutter.
- I de siste 5 min, flytte trypsin inhibitor løsningen til BSC.
- Hente cellene etter trinn 2.14 er fullført og Pipetter cellene opp og ned til kuler er helt atskilt (20 – 30 ganger). Deretter umiddelbart legge trypsin inhibitor løsningen og pipette opp og ned 10 ganger. Denne løsningen av dissosiert celler og trypsin hemmer vil bli referert til som "celle suspensjon".
- Tell antall celler i cellen suspensjon ved å følge trinn.
- Pipetter 15 µL Trypan blå pre blanding (inneholder 5 µL av 0,4% Trypan blå og 10 µL av dPBS) på en liten veie båten, og deretter legge 5 µL av cellen suspensjon. Pipetter opp og ned 3 - 5 ganger å blande. Deretter Pipetter 10 µL av Trypan blå/mobiltelefon suspensjon på hver side av en hemocytometer dekket med et glass dekkglassvæske.
- Observere cellene under et lys mikroskop og telle antall celler i hver av de fire hjørne rutenettene. Legg disse tallene sammen.
- Gjenta teller for den andre siden og gjennomsnittlig de to sidene sammen.
- Multiplisere dette nummeret med 10.000 gi antall celler per mL. Multiplisere dette tallet med antall ml beregne antall celler i cellen suspensjon. Beregne hvor mye volum av cellen suspensjon vil være nødvendig å frø 5 millioner celler per MT75 kolbe.
Merk: Vanligvis etter 9-10 dager, en MT75 må 25-30 × 106 celler. Derfor, hvis passaging alle cellene i nye flasker, totalt 5-6 flasker nødvendig. - Legg volumet av cellen suspensjon beregnet i trinn 3.19 til hver MT75 kolbe å få 5 × 106celler per kolbe. Hvis volumet er mindre enn 5 mL, legge tilleggsbetingelse medium utgjør totalt 5 mL. Deretter legge til 10 mL av nye DFHGFPS media inneholder vekst faktorer (tabell 1) kolbe.
- Gjenta trinn 1.17 og 1,18 og sikre kolbe er merket med typen celler, datoene, antall celler i flasken og passasje nummeret (dette er antall ganger cellen har vært passaged). Deretter gå til trinn 4-9.
- Hvis nødvendig, frø ekstra celler i en MT75 kolbe på tettheten opptil 30 × 106celler per kolbe over natten og fryse dagen etter trinn 4.
4. hNSC frysing og lagring
- Dagen etter passaging, hente kolbe settefiskanlegg inneholder celler for frysing (fra trinn 3.19 og 3,22). Tilt kolbe og fjerne alle medium og celler fra flasken og sted i en 15 mL tube. Deretter sentrifuge røret på 216 x g i 5 min.
- Under sentrifugering prosessen, forberede frysing medium (Tabell 4). For hver 5 × 10 forberede6 celler 1 mL av frysing medium. Antall celler identifiserte i trinn 3.19 når du bestemmer hvor mange celler å innlegge hver kolbe. Dette tallet vil ikke har endret over natten.
- Forberede cryo-bevare ampuller med etiketter cellenavn, passasjen tall, celle nummer, initialer og dato. Etter sentrifugering, fjerne nedbryting av aspirasjon og å suspendere celle pellet i iskaldt middels slik at det er 5 × 106 celler/mL. Bruke en 5 mL pipette, aliquot 1 mL per medisinglass og segl tett (5 × 106 celler per medisinglass).
- Plasser ampuller i cryo-bevare beholder med 250 mL isopropanol (maks bruk 5 ganger per utskifting av isopropanol). Lagre i-80 ° C fryseren over natten, og deretter overføre til et flytende nitrogen tank lagringssystem.
5. plating tilhenger hNSC for validering
- Dagen før passaging (trinn 3.1-3,22), rengjøre BSC i trinn 2.2, og få en 24-vel plate og sterile glass 12 mm coverslips.
- Ved hjelp av pinsett, plassere en enkelt dekkglassvæske på bunnen av hver brønn av platen.
- Pels brønnene som inneholder cover slips med 0,01% poly-D-lysine (PDL) i sterilt vann og ruge 1t på 37 grader. En 24-vel plate, bruke 250 μL PDL per brønn.
- Fjern PDL fra brønnene, og deretter pels med 1 µg/cm2 laminin/dPBS (250 μL per brønn). Inkuber platen overnatting på 37 ° C. Hvis ikke nødvendig dagen forsegle platen med parafilm av emballasjen parafilm rundt kantene av plate og lagre på 4 ° C.
Merk: Platene belagt med laminin kan lagres til 2 uker hvis forseglet med parafilm som dekker slips ikke tørr. - Passasjen cellene som beskrevet i trinnene 3.1-3,22, og deretter bestemme antall celler til frø inn i 24-vel plate med belagt coverslips.
- Fjern overflødig laminin løsning fra brønner gjennom aspirasjon, og skyll når med 0,5 mL dPBS. Så frø celler i brønnene på en tetthet 0,6-1 x 105 celler/cm2 per brønn. Bruk gjenværende celler etter trinn 3.16-3.21.
- Atvarious ganger i løpet av 24-vel plate kultur, fikse og flekken celler for ulike stamcelleforskningen markører etter trinn 9.
6. grunning hente GABA og glutamat nerveceller
- Passasje cellene som beskrevet i 3.1-3,22, og deretter bestemme antall celler til frø i en 24-vel plate som i trinn 5.6.
- Dagen før grunningen forberede forsiden slips og frakk platen som beskrevet i trinnene 5.1-5.4.
- Priming dag, hente flasker med 2-3-dagers celler. Plasser i en 15 mL tube og pellets cellene av sentrifugering 100 x g i 5 min.
- Forberede epidermal vekstfaktor/leukemi hemmende faktor/laminin (ELL) grunning mediet etter tabell 5.
- Resuspend celler med ELL medium.
- Frø suspendert celler i en 24-vel plate (Følg trinn 5.6).
7. grunning å få motor neurons
- Fremgangsmåten 6.1-6.4.
- Forberede grunnleggende fibroblast vekst faktor/Heparin/Laminin (FHL) grunning mediet etter tabell 6.
- Følg trinn 5.6.
8. Zika virusinfeksjon
Merk: ZIKV er svært følsom for temperatur, så det er avgjørende at ZIKV lager lagres på - 80 ° C og fryse/tining sykluser unngås. Fortsette arbeidet dele på is.
- Passasjen celler som beskrevet i trinnene 3.1-3,22. 3-4 millioner celler totalt er nødvendig å frø en 24-vel plate, derfor når passaging, antall celler nødvendig for infeksjon og frø i en bolle når passaging.
- Hvis seeding celler i en 24-vel plate til farging, forberede coverslips og platen etter trinn 5.1-5.4.
- Etter passaging, sett 1 mL av cellen suspensjon fra trinn 8.2 i en 1,5 mL microcentrifuge rør, og sentrifuger 200 x g ved romtemperatur for 5 min. Deretter fjerne nedbryting av aspirasjon.
- Resuspend pellets fra trinn 8.3 i ZIKV aksjer å kjøpe et mangfold av infeksjon (MOI) fra enten 1 til 10. Volumet av ZIKV løsning bør ikke overstige 0,5 mL. For uekte behandling (kontroll celler), resuspend celler i samme volum og type brukt på ZIKV lager.
Merk: ZIKV lager forberedelse og infeksjon er beskrevet i en tidligere publikasjon11. Mock infeksjoner er også utført med medium. - Ruge over cellen/ZIKV blanding på 37 ° C 1 h. Inverter røret 2 - 3 ganger, og deretter virvel blandingen for 5 min på 216 x g ved romtemperatur å få celle pellets. Resuspend pellets i dPBS og sentrifuger igjen for 5 min på 216 x g ved romtemperatur.
- Fjerne nedbryting av aspirasjon, resuspend celler med passende medium og laste inn infiserte celler i flasken eller plate nødvendig for eksperimentet. Hvis seeding cellene i en 24-vel plate resuspend pellet i 12 mL av passende medium, og deretter legge 500 μL suspensjon i hver brønn.
Merk: på dette punktet enten opprettholde cellene i vekst medier å observere effekter av ZIKV på stamceller, eller gå til trinn 6 eller 7 å studere effekten av ZIKV på differensiering prosessen.
9. farging prosedyre
- For å fikse cellene, fjerne medium, skyll når med 0,5 mL per brønn (24-vel plate) is kaldt fosfat-bufret saltoppløsning (PBS).
- Fjerne PBS, og dekk celler med 0,5 mL 4% paraformaldehyde i PBS og la ved romtemperatur for 20-30 min.
- Fjerne paraformaldehyde og skyll celler tre ganger med 0,5 mL PBS, forlater tredje PBS skylling på for 10 min ved romtemperatur.
- På dette punktet enten la PBS på natten og lagre platen ved 4 grader, eller starte flekker etter 10 min skylling.
- Etter 10 min PBS skylling, hindre celler for 45-60 minutter i en stillestående posisjon med en 0,5 mL løsning av 5% normal geit serum (NGS), 0,3% bovin serum albumin (BSA), 0,25% Triton X-100 i Tris-bufret saltvann (SS). For eksempel 1 mL av blokkering solution bruk: 10 µL 25% Triton X-100, 50 µL av 100% NGS og 100 µL av 3% BSA blandet i 840 µL av TBS.
- Under det blokkerende trinnet klargjør primære antistoff løsningen, sørge for at alle reagenser holdes på is. For å validere hNSCs, kan proteiner som Nestin målrettes ved hjelp av riktig antistoffer mot dem. For å validere ZIKV infeksjon, kan du bruke et antistoff mot ZIKV pels protein11. For differensiering, bruke markører som klasse III β-tubulin for å identifisere neuronal bestander mens glial fibrillary Sure protein (GFAP) kan brukes til å identifisere astrocyttene. Konsentrasjonen av primære antistoffer bestemmes empirisk avhengig av leverandøren og mye. Vi har brukt mest antistoffer fra 1: 100 til 1:2000 fortynning.
- Sentrifuge primære antistoffer 12.000 x g i 2 minutter på 4 ° C, og deretter gjøre en fortynning; f.eks for å gjøre en 1:1000 fortynning av antistoff, legger du til 7,2 µL ønsket antistoff til 7,2 mL 0,25% Triton X-100 i TBS.
- Legg ca 300 µL av antistoff løsning i hver brønn av en 24-vel plate, og ruge cellene med primære antistoff en stillestående posisjon for 2 timer ved romtemperatur eller 4 grader overnatter i en stillestående posisjon.
- Inkubasjon vaskes celler med 0,5 mL av TBS tre ganger ved romtemperatur for 10 min hver i en stillestående posisjon.
- Sentrifuge sekundære antistoffer 12.000 x g i 2 minutter på 4 ° C, og fortynne i 0.25% Triton X-100/SS løsning. Gjør nok antistoff løsning til 300 µL i hver brønn. Her fortynne fluorescerende sekundære antistoffer 1:500 (Figur 3).
- Etter de endelige TBS vaske, legger 300 µL av sekundær antistoff løsningen i hver brønn og ruge i mørket 1t ved romtemperatur i en stillestående posisjon. Fra dette punktet må alle trinn skje i et mørkt rom.
- Vask cellene tre ganger med TBS i 10 min hver i en stillestående posisjon.
- Under siste 10 min vask, fortynne kjernefysiske markøren DAPI kjernefysiske flekken til anbefalte konsentrasjonen i ss (vanligvis 1:1,000 - 1:5, 000). Gjør nok løsning til 300 µL i hver brønn.
- Etter siste vask, legger 300 µL DAPI løsning i hver brønn og ruge i 5 minutter ved romtemperatur i en stillestående posisjon. Deretter vaskes en gang med 0,5 mL TBS.
- Bruk en anti-fade montering medium for fluorescens og 1 dråpe (10-15 µL) per dekkglassvæske som skal plasseres på lysbildet. Nøye bruke pinsett for å fjerne coverslips fra 24-vel plate brønnene og plassere celleoverflaten ned på montering middels miste på lysbildet.
- Når coverslips plasseres på lysbildet, plasserer du lysbildet i en flat lysbildeholderen. Pass på at etiketten lysbilder vil all relevant informasjon for å identifisere cellene på lysbildet, og deretter dekke holderen med aluminiumsfolie for å holde lysbilder beskyttet mot lyset.
- Lagre skliene i 4 grader og tillater montering medium å størkne over natten. Dagen observere lysbildet med en epifluorescent mikroskop med UV-2E/C filter (340-380 nm), GFP HYQ BP filter (450-490 nm) eller Y-2E/C Texas rød filter (540-580 nm), 20 X forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kultivert hNSCs i deres proliferativ fase vil vokse som ikke-tilhenger neurospheres (figur 1). Umiddelbart etter hNSC passering, vil det være mange individuelle celler som vil samle og begynne skjemaet kuler i de neste dagene (figur 1A og 1B). Sunn kuler bør være ca 1-2 mm i diameter 9-10 dager etter et avsnitt (figur 1 c). Kuler som vokse større enn 2 mm vil utvikle en mørk senter og vekstfaktorer i medium vil ikke kunne nå cellene i midten av den sfæren, noe som resulterer i uønskede differensiering. Sunn kuler vises gjennomsiktig og vise pseudo flimmerhårene rundt kantene av sfæren (figur 1 c).
Kontaktflate neurospheres på en tilhenger overflate for farging formål vil resultere i veksten av tilhenger kuler (figur 2A). Disse kulene vil berøre overflaten av kultur fartøyet og har noen anslag strekker seg ut på overflaten av fartøyet, samtidig opprettholde en sentral kule (figur 2A). Grunning og differensiering cellene krever cellene å følge en cover slip på bunnen av en celle kultur plate, som en 24-vel plate. Etter passende grunning trinnene og tillegg av differensiering medium, vil cellene spredt over overflaten på kultur fartøyet og vokse som sammenknyttede monolayer celler (figur 2B).
For å enten bekrefte gyldigheten av hNSC kultur eller fenotypen av differensierte celler, kan fluorescerende immunohistochemistry brukes. Nestin er en intermediære vanligvis uttrykt i NSCs og kan brukes til å kontrollere hNSC kultur (figur 3A). For å bekrefte tilstedeværelse av neurons etter differensiering, kan klassen III β-tubulin generelt brukes til etiketten neurons (figur 3B). Selv om det grunning trinnet brukes til å oppnå en høyere prosentandel av neurons etter differensiering, vil det fortsatt være astrocyttene i kulturen. Glial fibrillary Sure protein (GFAP) kan brukes til etiketten astrocyttene for å kvantifisere hvor stor prosentandel av differensierte celler ble astrocyttene eller neurons.
Vi fant at K048 linjen av NSCs var infisert av både afrikansk og asiatisk stammer av ZIKV oppdaget av immunofluorescent flekker med et spesifikt antistoff ZIKV. Representant bildene er vist i Figur 4. Mock infeksjon ikke framprovosere hNSC morfologi eller overlevelse (figur 4A, 4 C). ZIKV liggende i eksterne regionen et infiserte cellen en dag innlegg en 1-timers infeksjon, men fyller hele cellen på 3 til 7 dager (figur 4B4 D, 4E). Merkbart, med den samme MOI (0.1), en estimert 5% infeksjon rate i K048 celler er vesentlig lavere enn de nylig rapportert ZIKV infeksjon rate (opptil 80%) i menneskelig hud-indusert NSCs7. Denne studien rapporterer 80% infectivity, brukt prototypen afrikansk stamme av ZIKV (MR766) som kan ha tilpasset en neurotropic fenotypen under 140 passasjer i musen hjerneceller.
Figur 1: lysende felt bilder av hNSC kultur. (A-C) Representant lyse feltet bilder tatt på 10 X forstørrelse hNSC kultur 1, 4 og 9 dager etter passaging, henholdsvis. Skalere barer: 60 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: lysende felt bilder av tilhenger kulturer. (A) representant lyse feltet bilder tatt på 10 X forstørrelse av tilhenger hNSC kultur, 7 dager etter plating. (B) representant lyse feltet bilder tatt på 10 X forstørrelse av tilhenger differensierte celler etter ELL grunning og 9 dager av differensiering. Skalere barer: 60 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: fluorescerende bilder av hNSCs og forskjellige kulturer. (A) representant fluorescerende bilder tatt på 20 X forstørrelse av tilhenger hNSCs med kjernefysiske trådkorsmarkør, DAPI (blå) og stilk cellen Nestin (rød). Skala bar: 60 µm (B) representant fluorescerende bilder tatt ved 60 X forstørrelse av differensierte celler med nevrale markør βIII-tubulin (grønn), astrocytter maker GFAP (rød) og kjernefysiske markør DAPI (blå). Skalere barer: 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: ZIKV infeksjon i menneskelig fosterets hjerne-avledet NSCs. Menneskelige NSCs ble enten Mock behandlet (A og C), inokulert i 1 time med en afrikansk avstamning stamme av ZIKV på MOI 0,1 (B og D), eller med en asiatisk stamme av ZIKV nylig isolert fra mygg i Mexico i 2016 (E). Immunofluorescent flekker oppdager merking av ZIKV antistoffer i NSCs i ett til syv dager innlegget inoculation (1 dpi i B, 7 PPT i D og 3 dpi i E). Skala barer 10 µm i A-D og 5 µm i E. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| DFHGPS medier for en MT75 | 10 mL |
| TPPS * | 173 ΜL |
| 200 mM L-Glutamin | 50 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin ** | 25 ΜL |
| 20 µg/mL Epidermal vekstfaktor | 10 ΜL |
| 20 µg/mL grunnleggende fibroblast vekstfaktor | 10 ΜL |
| 10 µg/mL leukemi hemmer faktor | 10 ΜL |
| 5 mg/mL Heparin | 10 ΜL |
| * Blanding som inneholder 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine, 20 nM progesteron og 30 nM natrium selenitt. Blandingen er laget av konsentrert aksjer, og dele lagres ved-80 ° C og preferablly brukes innen 6 uker forberedelse. Konsentrert bestandene er 10 mg/mL transferrin, 30 mM putrescine, 10 µM progesteron og 15 µM natrium selenitt lagret på-80 grader. | |
| ** Insulin er oppløst i 0.01 N hydroen chloride, filtrert gjennom 0,2 µM lav protein bindingsfilter og lagret på 4 grader for inntil 6 uker. | |
Tabell 1: vekst faktorer for nye spredning Medium.
| dPBS * | 1 mLen | 3 mLb |
| 10% glukose | 60 ΜL | 180 ΜL |
| 2,5% trypsin | 10 ΜL | 30 ΜL |
| Dnase ** | 5 ΜL | 15 ΜL |
| * Dulbecco fosfat-bufret saltvann | ||
| ** Deoxyribonuclease | ||
| en for 10 millioner celler | ||
| b for 30 millioner celler | ||
Tabell 2: Forberedelse av trypsin.
| Betinget media | 1 mLen | 3 mLb |
| Trypsin hemmer | 10 ΜL | 30 ΜL |
| en for 10 millioner celler | ||
| b for 30 millioner celler |
Tabell 3: Utarbeidelse av trypsin hemmer.
| DFHGPS * | 0,7 mLen | 2.1 mLb |
| FBS ** 20% | 0,2 mL | 0,6 mL |
| DMSO *** 10% | 0,1 mL | 0,3 mL |
| * DMEM, F12, HEPES, glukose, penicillin-streptomycin | ||
| ** Fosterets bovin serum | ||
| Dimethyl sulfoxide | ||
| en for 5 millioner celler i en flaske | ||
| b for tre ampuller, 5 millioner celler/medisinglass | ||
Tabell 4: Forberedelse av frysing medium.
| DFGHPS * for en godt i en 24-vel plate | 1 mL |
| TPPS ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM L-glutamin | 5 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin | 2,5 ΜL |
| 20 µg/mL Epidermal vekstfaktor | 1 ΜL |
| 10 µg/mL leukemi hemmende faktor | 1 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * Som inneholder DMEM, F12, HEPES, glukose, penicillin-streptomycin | |
| ** Som inneholder 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine, | |
| 20 nM progesteron og 30 nM natrium selenitt | |
Tabell 5: Forberedelse av ELL grunning medium.
| DFGHPS * for en godt i en 24-vel plate | 1 mL |
| TPPS ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM L-glutamin | 5 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin | 2,5 ΜL |
| 20 µg/mL grunnleggende fibroblast vekstfaktor | 0,5 ΜL |
| 5 mg/mL Heparin | 0,5 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * Som inneholder DMEM, F12, HEPES, glukose, penicillin-streptomycin | |
| ** Som inneholder 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine, | |
| 20 nM progesteron og 30 nM natrium selenitt | |
Tabell 6: Forberedelse av FHL grunning medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kultur og manipulere hNSCs gir et kritisk verktøy som kan brukes til en rekke formål fra modellering menneskelig sykdom til høy gjennomstrømning narkotikarelaterte screening10,11,12,14, 15,16,17. Mange spørsmål gjensto å bli behandlet som hvordan menneskelige fosterets hjerne NSCs eller deres avkom er mottakelige for ZIKV infeksjon om annerledes belastninger av ZIKV infisere NSCs med lik effektivitet og hvordan infeksjon under neural utvikling resultater i microcephaly. Vi har brukt denne hNSC kulturen for å undersøke Zika virus forbundet neuropathology11,14. Ved hjelp av tre stammer av celler isolert fra tre individuelle givere, er vi også kunne sammenligne individuelle forskjeller til mottakelighet for nevrologiske underskudd observert følgende ZIKV infeksjon11. En av begrensninger av denne teknikken er tilgang til hNSC prøver og betinget medium avgjørende for riktig kultur. For å omgå denne barrieren, kontakt tilsvarende forfatteren å ordne materiale transport som cellene som brukes i denne protokollen ikke er kommersielt tilgjengelig.
De tilbyr også en utmerket plattform for å gjennomføre prekliniske undersøkelser i vitro studier med hNSCs ikke bare gir unik innsikt i grunnleggende stamcelleforskningen atferd. Imidlertid kan de tekniske utfordringene i dyrking hNSCs tjene som en hindring i å bruke dem som effektivt og reproduserbar modeller. I denne protokollen, har vi skissert hovedtrinnene og metoder som kan brukes til å redusere variasjonen i dyrking metoder og gir en rask og stabil hNSC stamcelleforskningen kultur. En ulempe med å bruke hNSC neurosphere kultur er at cellene er svært følsomme for alle stimuli. Selv med detaljert protokollen ovenfor er det viktig å være oppmerksom på hvor mye flasker eller retter av hNSCs håndteres, som minste variasjoner på protokollen kan føre til endringer i neurosphere atferd.
Den viktigste delen av notatet metoder er cocktail av vekstfaktorer og utarbeidelse av ulike media. Hvis dobling tid hNSC kultur er svært lav, eller mange celler adherie å kultur fartøyet (når de skal ikke-tilhenger), det første trinnet er å sikre at vekst faktorer brukes er riktig konsentrasjonen og ikke er utgått. Alle vekstfaktorer i denne protokollen har kort holdbarhet når tint (5-6 dager). I tillegg har vi brukt vekstfaktorer fra flere selskaper og merke forskjeller i kvaliteten og konsentrasjon nødvendig for å opprettholde kulturen. Derfor anbefaler vi bruker nøyaktig vekstfaktorer i Materialer tabell. Det passaging trinnet (trinn 3.1-3,22) er også en vanlig kilde av feil. Hvis det er mange død celler følge dissosiasjon prosessen, redusere antall ganger av pipettering opp og ned for å distansere cellene, som mye fysisk dissosiasjon kan føre til celledød. Alternativt, hvis det er mange klynger av cellene etter dissosiasjon trinn, økningen vigor eller antall ganger av pipettering opp og ned som disse klyngene vil raskt bli store sfærer som ikke vil være levedyktig i kultur. Hvis kulturen er riktig vedlikeholdt, er infeksjon med ZIKV relativt enkelt.
Mens ZIKV infeksjon er behandling i denne protokollen, er det mulig å bruke denne hNSC kultur-systemet for en rekke studier. Modell systemet kan brukes til skjermen narkotika, undersøke personlige mottakelighet og undersøke underliggende mekanismene av en rekke sykdommer og utviklingsforstyrrelser14. Dette systemet er også ideell for genomisk studier siden kulturperler cellene ikke har vært genetisk manipulerte og viser liten eller ingen kromosomavvik, selv opp til 80 passasjer10,11. Vi tror dette kultur-systemet er ideelt for modellering i vitro hvordan miljømessige stimuli som infeksjon, narkotika, alkohol, toksiner, etc. kan påvirke utviklingen av nervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra John S. Dunn Foundation og Institutt for menneskelige infeksjoner og immunitet av University of Texas Medical Branch (pw).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
