Summary
Den här artikeln beskriver de metoder som används för att expandera mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller i kultur, liksom hur att skilja dem i olika neuronala subtyper och astrocyter, med betoning på användningen av neurala stamceller att studera Zika virusinfektion.
Abstract
Mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller är en unik icke genmodifierade modellsystem studera effekterna av olika stimuli på mänskliga utvecklingsmässiga neurobiologi. Snarare än använder en djurmodell eller genetiskt modifierade inducerade pluripotenta celler, ger mänskliga neurala stamceller en effektiv in vitro- system för att granska effekterna av behandlingar, skärmen droger, eller granska individuella skillnader. Här, tillhandahåller vi detaljerade protokollen för metoder som används för att utöka mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller i kultur med serumfritt media, att skilja dem i olika neuronala subtyper och astrocyter via olika priming förfaranden, och att frysa och återställa dessa celler. Dessutom beskriver vi ett förfarande att använda mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller för att studera Zika virusinfektion.
Introduction
Zikavirus (ZIKV) är ett flavivirus som överförs sexuellt, eller av mygga vektorer Aedes aegypti och Aedes albopictus myggor. ZIKV identifierades nyligen som en allvarlig folkhälsorisk på grund av dess användarvänlighet överföring och anslutna neurologiska symtom1. En av mest rörande neurologiska effekter är utvecklingen av mikrocefali hos foster född till gravida infekterade mödrar2,3. Mikrocefali är en störning i nervsystemets utveckling där huvudet är mindre än den typiska storleken under fosterutvecklingen och vid födseln, med omkretsen mindre än 2 standardavvikelser under medelvärdet4. Den mindre huvudomfång åtföljs ofta av en mängd sjukdomstillstånd såsom försenad, kramper, syn och hörselnedsättning och utfodring svårigheter.
Nyligen genomförda studier har använt djurmodeller eller inducerade pluripotenta stamceller att studera effekten av ZIKV infektion på neuroutvecklingssjukdomar5,6,7,8. Medan dessa studier har bidragit till vår kunskap om ZIKV, användning av olika arter eller genetiskt modifierade celler kan vara tidskrävande och/eller lägga till ytterligare variabler som kan blanda ihop effekten av ZIKV på celler utveckla neurala5, 6 , 7 , 8. svårigheten med hNSC kultur, särskilt icke-anhängare neurosphere kulturen beskrivs i detta protokoll, är dock att kulturen är mycket känsliga för de metoder som används för att genomföra kultur9. Någon förändring i medelstora komponenter, eller ens den fysiska hanteringen av kultur fartyget, är tillräckligt för att framkalla en reaktion från celler9. För att lösa problemen, utvecklat vi en in vitro- mänskliga fostrets hjärna-derived neurala stamceller (hNSCs) kultur för att slentrianmässigt förhöra effekten av ZIKV på fostrets neurala stamceller. Med vår metod, bibehölls hNSCs för över 80 passager utan uppenbar fenotypiska förändringar10. Dessutom kromosomala förändringar såsom trisomi var antingen ingen eller minimal11. Denna hNSC kultur växer som en icke-anhängare neurosphere kultur. En fördel med neurospheres är att kulorna skapar en unik miljö nisch i kultur som är mer reflekterande i vivo nischer jämfört med tvådimensionell kulturer9. En annan fördel med detta protokoll är att flera celltyper kan härledas från den hNSC kulturen, så att en utredare att iaktta effekterna av en viss variabel på hNSC överlevnad och differentiering. Detta protokoll är tillämpligt för individer som söker för att besvara mekanistiska frågor angående centrala nervsystemet utveckling eller dysfunktion. Följande protokoll beskriver hur att utöka en hNSC kultur för att infektera med ZIKV, och därefter skilja hNSCs för att observera effekterna av infektion på differentiering processen. Den innehåller också metoder för att lagra hNSCs för långsiktig användning, och differentieras hNSCs till olika typer av nervceller som tillåter att ytterligare utredning av ZIKV-inducerad underskott bidrar till hjärna missbildning11. Vi anser att detta protokoll är också av intresse att utredarna försöker förstå effekten av eventuella miljömässiga stimulus såsom infektion eller toxiner på neurala stamceller överlevnad och differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga neurala stamceller var ursprungligen härrör från kasserade mänskliga fostrets cortexes i första trimestern12. Alla protokoll förfaranden följa de University of Texas Medical Branch etiska riktlinjer om användningen av mänskliga vävnadsprover och cellinjer godkändes av utskottet för institutionella biosäkerhet.
1. medium förberedelse och stamceller bestånden
- Förbereda odlingsmedium lager (DFHGPS) genom att kombinera reagenserna i steg 1.1.1.-1.1.5.
- Lägg till 210 mL Dulbeccos modifierade Eagle Medium med hög glukos och L-glutamin (D). Förvara den vid 4 ˚C.
- Tillsätt 70 mL Hams F12 näringsämne blandning med L-glutamin tillägg (F). Förvara den vid 4 ˚C.
- Lägg till 4,2 mL 15 mM HEPES buffert (H) och förvara den i rumstemperatur.
- Lägg till 4,2 mL 10% D-glukos lösning (G) och förvara den i rumstemperatur.
- Tillsätt 2.88 mL penicillin/streptomycin (PS) lösning... Alikvot stamlösning i 3 mL-portioner och lagra alikvoter vid-20 ° C tills den behövs.
Obs: Den slutliga koncentrationen av penicillin i mediet kommer att 100 enheter/mL, och koncentrationen av streptomycin blir 100 µg/mL. Detta medium kommer att betecknas som DFHGPS för återstoden av protokollet och ska förvaras vid 4 ° C för användning inom 1-2 veckor. Om det behövs, kan DFHGPS vara skalas upp proportionerligt.
- Dagen innan celler återvinns, coat en T75 kolv med 5 mL av konditionerat medium, erhållits från tidigare kulturer av hNSC cell fodrar och lämna i en 37 ° C inkubator med 8,5% koldioxid (CO2) över natten.
Obs: Om för närvarande odling hNSCs, spara det medium som celler har ökat i under en medellång förändring. Detta är luftkonditionerade medium som det har varit ”beroende” av cellerna. Konditionerat medium kan sparas i en tub med skruvlock och lagras vid 4 ° C i cirka 7 dagar. Kontakta motsvarande författare att få hNSCs. Konditionerat medium är att föredra men inte absolut krävs, särskilt när de först inleder kulturen av hNSCs. - Dagen för återhämtning, värm 20 mL av DFHGPS i en 50 mL skruvlock tub i 37 ° C vattenbad i minst 10 min och hålla det i vattenbad tills klar att använda.
- I en separat 15 mL skruvlock tube, värma 10 mL DFHGPS i 37 ° C vattenbad i minst 10 min och hålla det i vattenbad tills redo att använda i steg 1.13.
- Hämta en behållare av is och alla medelstora komponenter (tabell 1). Tina alla medelstora komponenter på isen och lämna dem på isen samtidigt förbereda för medelstora ändringen.
- Få 5 mL av konditionerat medelstora lager (lagrad vid 4 ° C) och hålla det i 37 ° C vattenbad tills redo att använda i steg 1,14. Se not efter steg 1.2 om det finns ingen luftkonditionering medium eller nuvarande mänskliga fostrets neurala stamceller kultur.
- Hämta 50 mL skruvlock röret från steg 1.3 och placera den i biosäkerhet skåp (BSC). Överför 10 mL av DFHGPS till en ny 15 mL skruvlock tub, och sedan placera den 50 mL tub som innehåller den återstående 10 mL DFHGPS medium tillbaka i 37 ° C vattenbad.
- Skaffa en cryo-injektionsflaska med hNSCs lagras i flytande kväve. Se not efter steg 1.2 om det finns ingen nuvarande mänskliga fostrets neurala stamceller kultur.
Obs: Mänskliga neurala stamceller var ursprungligen härrör från kasserade mänskliga fostrets hjärna12 och underhålls i kultur utan att genetisk modifiering10. 5 × 106 celler bör Tinas och pläterade på en T75 kolv. Varje cryo-injektionsflaska ska innehålla 5 × 106 celler; Därför behövs en injektionsflaska per kolv. - Tina en injektionsflaska av celler i 37 ° C vattenbad genom att vända flaskan varje 10 s för cirka 1 min eller tills isen är smält och innehållet i injektionsflaskan är helt flytande. Sänk inte hela flaskan under vatten för att undvika risken för nedsmutsning.
- I BSC, använda P1000 mikro-pipett aspirera den tinade cell lösningen och lägga till den drop-wise till 15 mL röret från steg 1,7, innehållande 10 mL DFHGPS. För att lägga till cellen tinade lösning drop-wise, långsamt tryck ned kolven så att endast en droppe eller två släpps på en gång. Samtidigt snurra 15 mL röret för att tillåta en snabb blandning.
- Centrifugera cellsuspension vid 200 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Kassera supernatanten, se till att behålla cellpelleten.
- Under steg 1.11, hämta den 50 mL tub innehållande de återstående 10 mL från steg 1,7. Efter centrifugeringen, resuspendera cellpelleten i 10 mL DFHGPS och centrifugera igen vid 200 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Under den slutliga spinn, förbereda nya odlingsmedium genom följande tabell 1 att lägga tillväxtfaktorer till 10 mL DFHGPS medium från steg 1.4 (tabell 1) i BSC. Lämna det nya mediet som innehåller tillväxtfaktorer i BSC förrän du är klar att använda.
- Hämta T75 kolven från steg 1.2 och kassera luftkonditionerade medium beläggning kolven av aspiration. Lägg sedan till de 5 mL av konditionerat media från steg 1,6. med serologisk pipett till kolven. Var noga med att inte skrapa botten av kolven.
- Hämta röret av celler från centrifugen och kasta bort supernatanten genom att aspirera, lämnar cellpelleten intakt.
- Återsuspendera cellpelleten i 10 mL av nya medier från steg 1.13 med hjälp av en 5 mL serologiska pipett och pipettering upp och ner flera gånger. Lägga till suspensionen belagda T75 kolven från steg 1,14. Använd de återstående 5 mL att skölja röret som innehöll cellpelleten och sedan tillsätt de 5 mL till kolven också.
- Rock T75 kolven fram och tillbaka 3 gånger för att säkerställa cellerna distribueras jämnt över kolven. Kontrollera att locket på kolven är lös så att luftflödet. Under ett ljusmikroskop iaktta cellerna, göra anteckningar och ta bilder om möjligt.
Obs: Cellerna bör ser genomskinlig och sfäriska. Anteckna om det finns celler som ser mörk, ogenomskinlig, eller har asymmetrisk internatelever eftersom detta kan indikera celldöd. Se också för all svamp eller bakteriell kontaminering, såsom media blir gul i färgen. - Placera kolven av celler i en 37 ° C inkubator med 8,5% CO2.
Obs: Använd 8,5% istället för 5,0% CO2 för att upprätthålla pH av detta serum-fri kultur media i spänna av 7.1-7.4.
2. hNSC Medium förändring
Obs: Ändra medium efter 3-4 dagar.
- Slå på BSC och rengör noggrant med 70% etanol. Iaktta celler under ett ljusmikroskop.
Obs: Göra anteckningar om utseendet på cellerna och sfär storlekar. Tre dagar efter återvinning eller passagen, kommer celler kluster ihop och börjar bilda icke-anhängare neurospheres.
Försiktighet: Om celler följer botten av kolven, kulturen kommer att behöva kasseras som cellen följsamhet kommer att öka för tidig differentiering och celler kommer att kunna upprätthålla en stam. Om det finns alltför många celler i kolven, cellerna kan bilda stora områden (större än 2 mm i diameter) i vilket fall, celler i mitten av området kommer att börja skilja på grund av bristande tillgång till tillväxtfaktorer i mediet. Om områden större än 1 mm i diameter observeras, kan cellerna vara överförda (steg 3.1-3.22). - Följ steg 1.4 och 1.5, och förbereda 10 mL färsk medium (se steg 1.13).
- Tilt-kolv till sida, så att kulorna att sjunka till botten av kolven.
- Ta bort 5 mL luftkonditionerade medier från toppen av poolade medium med 5 mL serologiska pipett, noga med att inte aspirera någon neurospheres. Placera de 5 mL av konditionerat media i en ren 15 mL tub.
- Ta bort ytterligare 5 mL av konditionerat media från kolven, igen noggrant undvika kulorna, och placera de 5 mL i en och samma 15mL tub.
- Tillsätt 10 mL av nya medier från steg 2.2 till de återstående 5 mL av konditionerat media och celler i kolven. Ställa in kolven ner platt och observera celler under ett ljusmikroskop.
- Om det visas att celler har varit aspirerade under samling av konditionerat medium, snurra luftkonditionerade mediet vid 100 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Återsuspendering celler som ansamlas i botten i 1 mL av konditionerat medium, och sedan lägga till dem till kultur kolven.
- Förvara oanvända luftkonditionerade media från steg 2,5/2,6 vid 4 ˚C 10 mL i en 15 mL skruvlock tub.
- Upprepa steg 1.17/1.18.
3. hNSC Passage
Obs: hNSCs bör vara passage varje 9-11 dagar om cellerna växer normalt, som populationsfördubblingstid är cirka 3 dagar13.
- Om expanderar Karolina i en ny kolv, kontrollera att alla nya kolvar är belagda i steg 1.2.
- Rengöra BSC som i steg 2.1, och genomföra steg 1.4 och 1.5.
- Förbereda medium som i steg 1.13. Varje T75 kolv kräver 10 mL medium. För flera T75 kolvar, multiplicera 10 mL av media av antal kolvar.
- Bereda antingen 1 eller 3 mL Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (dPBS) och glukos och plats i 37 ° C vattenbad att värma för 10 min (för trypsin lösning) enligt volymerna i tabell 2. Lägg inte till trypsin eller DNAS vid denna tid. DNAS kan behöva bryta ner eventuella DNA som släppt från döda celler på grund av mekanisk eller kemisk cell dissociation.
Obs: För en T75 kolv anpassade efter 9-10 dagars tillväxt blir det ca 30 × 106 celler, om 5 × 106 seedade ursprungligen på kolven. Vanligtvis används 1 mL dPBS lösning för 10 × 106 celler. Därför behövs 3 mL dPBS lösning för en T75 kolv anpassade efter 9-10 dagar. - Placera rena små väger båten och hemocytometer i huva. Rengör med 70% etanol och låt lufttorka i hood under cirka 5 minuter.
Obs: Väga båten kommer att användas i steg 3.17.1. - Hämta kolven av celler som kommer att vara passaged från inkubatorn och sätta i BSC. Tilt kolven försiktigt så att celler att sjunka till botten av poolade media. Det finns ca 15 mL av media i kolven.
- Ta bort ca 10 mL av media i 5 mL portioner (dvs 5 mL + 5 mL). Placera denna 10 mL av media i en ren 15 mL tub märkt ”CM” för ”betingad medium”. Var noga med att inte aspirera någon av cellerna bosatte sig i de återstående 5 mL av media i kolven; dessa celler och 5 mL media kommer att utsättas för steg 3,8.
- Ta 3 mL luftkonditionerade media från ”CM” röret (från steg 3,7) och placera i en 15 mL tub märkt ”trypsin hämmare lösning”. Detta kommer att användas i steg 3.12. Efter avlägsnande av de 3 mL finns 7 mL luftkonditionerade medier kvar i ”CM” röret. Avsätta ”CM” röret tills steg 3,9.
- Ta bort de 5 mL av media och celler kvar i T75 kolven och placera i en ren 15 mL tub märkt ”celler”.
- Ta ”CM” röret som innehåller 7 mL luftkonditionerade medier (från steg 3.7.1) och skölj botten T75 kolvens två gånger med 3,5 mL delar av konditionerat media, med 5 mL serologiska pipett. Efter varje sköljning, placera 3,5 mL portionr ”celler” röret. Syftet med detta steg är att ta bort alla neurospheres (celler) från T75 kolven.
- Centrifugera ”celler” röret vid 100 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Medan celler snurrar, få dPBS-och/eller glukoslösning från 37 ° C vattenbad och Tillsätt lämplig mängd trypsin och DNAS enligt tabell 2.
- Efter ”celler” röret har slutat snurra, ta bort alla luftkonditionerade medium supernatanten och överföra till ”CM” röret.
- Ta röret ”trypsin hämmare lösning” från steg 3.7.1. och lägga till volymen av trypsin-inhibitor som anges i tabell 3. Använd samma volym av trypsin hämmare lösning som användes för trypsin lösningen.
- Placera trypsin hämmare lösning i 37 ° C vattenbad tills den behövs.
- Lägga till trypsin lösning till cellpelleten i 15 mL röret och Pipettera upp och ned cirka 5 - 10 gånger med 5 mL pipett. Stäng locket på röret och inkubera i ett vattenbad på 37 ° C i 5 min. Efter 5 min, Hämta cellerna och Pipettera upp och ned 5 - 10 gånger. Sedan Inkubera i 37 ° C vattenbad för en ytterligare 10-15 min.
- I de sista 5 min, flytta trypsin hämmare lösningen till BSC.
- Hämta cellerna efter steg 2.14 är klar och Pipettera cellerna upp och ner tills sfärer dissocieras helt (20 - 30 gånger). Sedan omedelbart lägga till trypsin hämmare lösningen och pipett upp och ner 10 gånger. Denna lösning av dissocierade celler och trypsin hämmare kommer att betecknas som ”cellsuspensionen”.
- Räkna antalet celler i cellsuspensionen genom att följa steg.
- Pipettera 15 µL av Trypan blå blandning (innehållande 5 µL 0,4% Trypan blå och 10 µL av dPBS) på en liten väger båt och sedan Tillsätt 5 µL cellsuspension. Pipettera upp och ner 3 - 5 gånger att blanda. Sedan Pipettera 10 µL av Trypan blå/cellsuspension på vardera sidan av en hemocytometer som täckts med ett täckglas.
- Observera cellerna under ett ljusmikroskop och räkna det totala antalet celler i var och en av fyra hörn rutnäten. Lägg till dessa siffror tillsammans.
- Upprepa räknar för den andra sidan och genomsnitt två sidor tillsammans.
- Multiplicera detta tal med 10.000 att ge det totala antalet celler per mL. Multiplicera detta tal med det totala antalet milliliter att beräkna det totala antalet celler i cellsuspension. Beräkna hur mycket volymen av cellsuspensionen kommer att behövas till utsäde 5 miljoner celler per T75 kolv.
Obs: Efter 9-10 dagar, en T75 kommer har normalt 25-30 × 106 celler. Om passaging alla celler till nya kolvar, behövs därför sammanlagt 5-6 kolvar. - Lägga till volymen av cellsuspensionen som beräknades i steg 3.19 i varje T75 kolv att erhålla 5 × 106celler per kolv. Om volymen är mindre än 5 mL, lägga till ytterligare villkor medium gör upp till sammanlagt 5 mL. Lägg sedan till 10 mL av nya DFHGFPS media som innehåller tillväxtfaktorer (tabell 1) kolven.
- Upprepa steg 1.17 och 1.18 och se till att kolven är märkt med typ av celler, datum, antalet celler i kolven och antalet passage (detta är antalet gånger som cellen har varit anpassade). Gå sedan till steg 4-9.
- Om behövs, utsäde extra celler till en T75 kolven på tätheten upp till 30 × 106celler per kolv över natten och frysa nästa dag enligt Steg4.
4. hNSC frysning och lagring
- Dagen efter passaging, Hämta kolven från inkubatorn som innehåller celler för frysning (från steg 3.19 och 3.22). Tilt kolven och ta bort alla medium och celler från kolven och plats i en 15 mL tub. Sedan Centrifugera röret vid 216 x g i 5 min.
- Under centrifugering, förbereda frysa medel (tabell 4). För varje 5 × 10 förbereda6 celler 1 mL frysning medium. Antalet celler som var beslutsam i steg 3.19 vid fastställandet av hur många celler att sätta i varje kolv. Detta nummer kommer inte har ändrats under natten.
- Förbereda cryo-preserve flaskor med etiketter cellnamn, passage nummer, mobilnummer, initialer och datum. Efter centrifugering, ta bort supernatanten genom aspiration och slamma cellpelleten i frysning medium så att det finns 5 × 106 celler/mL. Med 5 mL pipett alikvotens 1 mL per injektionsflaska och tätning tätt (5 × 106 celler per injektionsflaska).
- Placera injektionsflaskor i en cryo-preserve behållare med 250 mL isopropanol (max användning 5 gånger per byte av isopropanol). Lagra i-80 ° C frys över natten och sedan överföra till ett flytande kväve tank lagringssystem.
5. plätering vidhäftande hNSC för validering
- Dagen innan passaging (steg 3.1-3.22), rengör BSC som i steg 2.2 och få en plattan 24 brunnar och sterilt glas 12 mm coverslips.
- Med pincett, placera ett enda täckglas på botten av varje brunn av plattan.
- Kappa brunnarna som innehåller täckglas med 0,01% poly-D-lysin (PDL) i sterilt vatten och inkubera i 1 h vid 37 ˚C. För en 24-väl plåt, Använd 250 μL av PDL per brunn.
- Ta bort PDL från brunnarna, och sedan belägga med 1 µg/cm2 laminin/dPBS (250 μl per brunn). Inkubera plattan över natten vid 37 ° C. Om inte behövs nästa dag, försegla plattan med parafilm genom att Linda parafilm runt kanterna på plattan och förvaras vid 4 ° C.
Obs: Plattor belagda med laminin kan lagras till 2 veckor om förseglade med parafilm så länge täckglas inte torka. - Passagen celler som beskrivs i steg 3.1-3.22, och sedan bestämma antalet celler till utsäde i 24-väl plattan med belagda coverslips.
- Ta bort eventuell överflödig laminin-lösning från brunnarna genom aspiration, och skölj en gång med 0,5 mL av dPBS. Sedan utsäde celler i brunnar på en densitet 0.6-1 x 105 celler/cm2 per brunn. Använd alla återstående celler enligt steg 3.16-3.21.
- Atvarious gånger under 24-well plate kulturen, fixa och färga cellerna för olika stamceller markörer efter steg 9.
6. priming att erhålla GABA och glutamat nervceller
- Passagen cellerna som beskrivs i 3.1-3.22, och sedan bestämma antalet celler till utsäde till en 24-well platta som i steg 5,6.
- Dagen innan grundning, förbereda täckglas och pälsen plattan enligt beskrivningen i steg 5.1-5.4.
- Priming dag, Hämta kolvar som innehåller 2-3-dagars celler. Placera i en 15 mL tub och pellet cellerna genom centrifugering vid 100 x g i 5 min.
- Förbereda epidermal tillväxtfaktor/leukemi hämmande faktor/laminin (ELL) priming medium enligt tabell 5.
- Att resuspendera cellerna med ELL medium.
- Utsäde suspenderade celler till en 24-well platta (Följ steg 5,6).
7. priming att få motoriska nervceller
- Följ steg 6.1-6.4.
- Förbered det grundläggande fibroblast tillväxtfaktor/Heparin/Laminin (FHL) priming mediet enligt tabell 6.
- Följ steg 5,6.
8. Zika Virus infektion
Obs: ZIKV är mycket känsliga för temperatur, så det är mycket viktigt att ZIKV lager lagras vid - 80 ° C och frysning/upptining cykler undviks. Fortsätta arbeta alikvoter på is.
- Passagen celler enligt beskrivningen i steg 3.1-3.22. 3-4 miljoner celler totalt behövs för att seeda en 24-well platta, därför när passaging, sätter antalet celler behövs för infektion och seedning i en kolv när passaging.
- Om seedning celler till en 24-well platta för färgning, förbereda coverslips och plattan enligt steg 5.1-5.4.
- Efter passaging, placera 1 mL cellsuspension från steg 8,2 i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och centrifugera vid 200 x g i rumstemperatur i 5 min. Ta sedan bort supernatanten genom aspiration.
- Återsuspendera pelleten från steg 8,3 i ZIKV lager att förvärva en multiplicity av infektion (MOI) i antingen 1 till 10. Volymen av ZIKV lösning bör inte överstiga 0,5 mL. Håna behandling (kontroll celler), att resuspendera cellerna i samma volym och typ av medium som används i ZIKV lager.
Obs: ZIKV lager förberedelse och infektion beskrivs i en tidigare publikation11. Håna infektioner genomförs också med medium. - Inkubera över cellen/ZIKV blandning vid 37 ° C för 1 h. Vänd tuben 2 - 3 gånger och sedan Centrifugera blandningen för 5 min vid 216 x g vid rumstemperatur för att erhålla en cellpelleten. Återsuspendera pelleten i dPBS och centrifugera igen för 5 min vid 216 x g vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten genom aspiration, Omsuspendera cellerna med lämpligt medium och läsa in infekterade celler i kolven eller plattan behövs för experimentet. Om seedning cellerna till en 24-well platta återsuspendera pelleten i 12 mL lämpligt medium och sedan lägga till 500 μL suspension till varje brunn.
Obs: vid denna punkt antingen behålla cellerna i tillväxt medier att iaktta effekterna av ZIKV på stamceller, eller gå till steg 6 eller 7 att studera effekten av ZIKV på differentiering processen.
9. färgning förfarande
- För att fixa cellerna, ta bort medium, skölj en gång med 0,5 mL per brunn (24-well plate) is kallt fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Ta bort PBS, och täcka celler med 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD i PBS och lämna i rumstemperatur i 20-30 min.
- Avlägsna PARAFORMALDEHYD och skölj celler tre gånger med 0,5 mL PBS, lämnar den tredje PBS-skölj på under 10 minuter vid rumstemperatur.
- På denna punkt antingen lämna PBS över natten och förvara plattan på 4 ° c, eller börja färgning efter 10 minuter skölj sedan.
- Efter 10 min PBS sköljningen, blockera cellerna för 45-60 min i stationärt läge med en 0,5 ml av 5% normala get serum (NGS), 0,3% bovint serumalbumin (BSA), 0,25% Triton x-100 i Tris-buffrad koksaltlösning (TBS). Till exempel, att göra 1 mL blockerar lösning användning: 10 µL 25% Triton x-100, 50 µL av 100% NGS och 100 µL av 3% BSA blandas i 840 µL av TBS.
- Under blockera steg, Bered den primär antikropp, se till att alla reagenser hålls på is. För att validera hNSCs, kan proteiner som Nestin riktas med hjälp av lämpliga antikropp mot dem. För att validera ZIKV infektion, Använd en antikropp mot ZIKV coat protein11. För differentiering, Använd markörer såsom klass III β-tubulin för att identifiera neuronala populationer medan glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande) kan användas för att identifiera astrocyter. Koncentrationerna av primära antikroppar är empiriskt bestämmas beroende på leverantör och hel. Vi har använt de flesta antikroppar från 1: 100 till 1: 2000 utspädning.
- Centrifugera den primär antikroppen på 12 000 x g under 2 minuter vid 4 ° C, och sedan göra en utspädning; t.ex. för att göra en 1: 1000 utspädning av antikropp, tillsätt 7,2 µL av önskad antikropp till 7,2 mL av 0,25% Triton x-100 i TBS.
- Tillsätt ungefär 300 µL antikropp lösning till varje brunn 24-well platta och inkubera cellerna med primär antikropp i stationärt läge för 2 h i rumstemperatur eller vid 4 ˚C övernattning i stationärt läge.
- Efter inkubering, tvätta cellerna med 0,5 mL av TBS tre gånger i rumstemperatur i 10 min varje i stationärt läge.
- Centrifugera den sekundära antikroppen vid 12 000 x g under 2 minuter vid 4 ° C, och späd därefter i 0,25% Triton X-100/TBS lösning. Gör tillräckligt antikropp lösning att lägga 300 µL till varje brunn. Här, späd den fluorescerande sekundära antikroppar 1: 500 (figur 3).
- Efter sista TBS tvätta, tillsätt 300 µL av sekundär antikropp lösningen till varje brunn och inkubera i mörkret för 1 h i rumstemperatur i stationärt läge. Från denna punkt på, måste alla åtgärder ske i ett mörkt rum.
- Tvätta cellerna tre gånger med TBS för 10 min varje i stationärt läge.
- Under de senaste 10 min tvätten, späd den nukleära markör DAPI nukleära fläcken rekommenderade koncentrationen i TBS (vanligtvis 1:1,000 - 1:5, 000). Gör tillräckligt lösning att lägga 300 µL till varje brunn.
- Efter den sista tvättningen, tillsätt 300 µL DAPI lösning till varje brunn och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur i stationärt läge. Tvätta sedan en gång med 0,5 mL av TBS.
- Använda en anti fade monteringsmedium för fluorescens och 1 droppe (10-15 µL) per täckglas som kommer att placeras på bilden. Försiktigt använda pincett ta bort coverslips från 24-well plate brunnarna och placera cellytan ner på det montering medium droppa i bilden.
- När coverslips placeras på bilden, placera bilden i en platt bild-hållare. Se till att etiketten bilder kommer alla relevanta uppgifter som behövs för att identifiera cellerna som på bilden, sedan täcka innehavaren med aluminiumfolie för att hålla bilderna skyddas från ljus.
- Lagra bilder på 4 ° c och låt den monteringsmedium att stelna över natten. Följande dag, Observera bilden med en epifluorescerande Mikroskop med UV-2E/C filter (340-380 nm), GFP HYQ BP filter (450-490 nm) eller Y-2E/C Texas rött filter (540-580 nm), 20 X förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Odlade hNSCs i deras proliferativa fas kommer att växa som icke-anhängare neurospheres (figur 1). Omedelbart efter hNSC passagen, kommer det att finnas många enskilda celler, som kommer att sammanställa och börja form sfärer i de närmaste dagarna (figur 1A och 1B). Friska sfärer bör vara cirka 1-2 mm i diameter 9-10 dagar efter en passage (figur 1 c). Sfärer som växer större än 2 mm kommer att utveckla en mörk center och tillväxtfaktorer i medium kommer inte att kunna nå cellerna i mitten av området, vilket leder till oönskade differentiering. Friska sfärer visas genomskinliga och Visa pseudo cilier runt kanterna på området (figur 1 c).
Plätering neurospheres på en vidhäftande yta för färgning syften kommer att resultera i tillväxten av vidhäftande sfärer (figur 2A). Dessa områden kommer att röra vid ytan på kultur fartyget och har vissa prognoser som sträcker ut på ytan av fartyget, samtidigt som en central sfär (figur 2A). Grundning och differentiering cellerna kräver cellerna att följa ett täckglas på botten av en cell kultur plattan, såsom en 24-bra platta. Efter den lämpliga priming steg och tillägg av differentiering medium, kommer cellerna sprids ut över ytan av kultur fartyget och växa som sammankopplade enskiktslager av celler (figur 2B).
För att antingen bekräfta giltigheten av den hNSC kulturen eller fenotyp av differentierade celler, kan fluorescerande immunohistokemi användas. Nestin är en mellanliggande glödtråden vanligen uttryckt i Karolina och kan användas för att verifiera hNSC kultur (figur 3A). För att kontrollera förekomsten av nervceller efter differentiering, kan klass III β-tubulin generellt användas till etikett nervceller (figur 3B). Även om steget priming används för att uppnå en högre andel av nervceller efter differentiering, kommer det fortfarande att finnas astrocyter i kulturen. Glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande) kan användas till etikett astrocyter för att kvantifiera vilken procentandel av differentierade celler blev astrocyterna eller nervceller.
Vi hittade att K048 raden av Karolina var infekterad av både afrikanska och asiatiska stammar av ZIKV påvisas med immunofluorescens färgning med en specifik ZIKV antikropp. De representativa bilderna visas i figur 4. Håna infektion gav inte upphov till en förändring i hNSC morfologi eller överlevnad (figur 4A, 4 C). ZIKV tenderar att bo i en infekterad cell en dag post perifera regionen en 1 timmes infektion, men fyller hela cellen på 3 till 7 dagar (figur 4B4 D, 4E). Märkbart, med den samma MOI (0,1), en uppskattningsvis 5% infektionsfrekvensen i K048 celler är betydligt lägre än de rapporterade nyligen ZIKV infektion Betygsätt (upp till 80%) i mänsklig hud-inducerad Karolina7. Denna studie, rapportering 80% smittsamhet, använde prototypen afrikanska stam av ZIKV (MR766) som kan ha anpassat en neurotrop fenotyp under över 140 passager i mus hjärnceller.
Figur 1: ljusa fält bilder av hNSC kultur. (A-C) Representativa ljusa fält bilder tagna vid 10 X förstoring av hNSC kultur 1, 4 och 9 dagar efter passaging, respektive. Skala barer: 60 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: ljusa fält bilder av vidhäftande kulturer. (A) representativa ljusa fält bilder tagna vid 10 X förstoring av fastsittande hNSC kultur, 7 dagar efter bordläggningen. B representativa ljusa fält bilder tagna vid 10 X förstoring av anhängare differentierade celler efter ELL priming och 9 dagar av differentiering. Skala barer: 60 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: fluorescerande bilder av hNSCs och differentierade kulturer. (A) representativa fluorescerande bilder tagna på 20 X förstoring av fastsittande hNSCs färgas med nukleära markör, DAPI (blå) och stamcells markör Nestin (röd). Skalstapeln: 60 µm (B) representativa fluorescerande bilder tagna på 60 X förstoring av differentierade cellerna färgas med neurala markör βIII-tubulin (grön), astrocyt maker Fredsgenomförande (röd) och nukleära markör DAPI (blå). Skala barer: 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: ZIKV infektion i mänskliga fostrets hjärna-derived Karolina. Mänskliga Karolina behandlades antingen håna (A och C), inokuleras i 1 timme med en afrikansk härstamning stam av ZIKV på MOI 0,1 (B och D) eller med en asiatisk stam av ZIKV nyligen isolerade från myggor i Mexiko under 2016 (E). Immunofluorescerande färgning upptäcker märkning av ZIKV antikroppar i Karolina på en till sju dagar efter inympningen (1 dpi i B, 7dpi i D och 3 dpi i E). Skala barer 10 µm i A-D, och 5 µm i E. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| DFHGPS media för en T75 | 10 mL |
| TPPS * | 173 ΜL |
| 200 mM L-Glutamin | 50 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin ** | 25 ΜL |
| 20 µg/mL Epidermal tillväxtfaktor | 10 ΜL |
| 20 µg/mL Basic fibroblast tillväxtfaktor | 10 ΜL |
| 10 µg/mL leukemi hämmare faktor | 10 ΜL |
| 5 mg/mL Heparin | 10 ΜL |
| * Blandning innehållande 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine, 20 nM progesteron och 30 nM natrium selenit. Blandningen görs från koncentrerat bestånd och alikvoter lagras vid-80 ° C och preferablly används inom 6 veckor förberedelser. De koncentrerade bestånd är 10 mg/mL transferrin, 30 mM dimetylsulfat, 10 µM progesteron och 15 µM natrium selenit lagras vid-80 ˚C. | |
| ** Insulin löses i 0,01 N hydroen klorid, filtrerat genom 0,2 µM låg protein bindningsfilter och lagras vid 4 ° c i upp till 6 veckor. | |
Tabell 1: tillväxtfaktorer för nya spridning Medium.
| dPBS * | 1 mLen | 3 mLb |
| 10% glukos | 60 ΜL | 180 ΜL |
| 2,5% trypsin | 10 ΜL | 30 ΜL |
| DNAS ** | 5 ΜL | 15 ΜL |
| * Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning | ||
| ** Deoxyribonuclease | ||
| en för 10 miljoner celler | ||
| b för 30 miljoner celler | ||
Tabell 2: Beredning av trypsin.
| Konditionerat media | 1 mLen | 3 mLb |
| Trypsin-hämmare | 10 ΜL | 30 ΜL |
| en för 10 miljoner celler | ||
| b för 30 miljoner celler |
Tabell 3: Beredning av trypsin-hämmare.
| DFHGPS * | 0,7 mLen | 2,1 mLb |
| FBS ** 20% | 0,2 mL | 0,6 mL |
| DMSO *** 10% | 0,1 mL | 0,3 mL |
| * DMEM, F12, HEPES, glukos, penicillin-streptomycin | ||
| ** Fetalt bovint serum | ||
| Dimetyl sulfoxid | ||
| en för 5 miljoner celler i en injektionsflaska | ||
| b för tre injektionsflaskor, 5 miljoner celler/injektionsflaska | ||
Tabell 4: beredning av frysning medium.
| DFGHPS * för en brunn i en 24-well platta | 1 mL |
| TPPS ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM L-glutamin | 5 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin | 2,5 ΜL |
| 20 µg/mL Epidermal tillväxtfaktor | 1 ΜL |
| 10 µg/mL leukemi hämmande faktor | 1 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * Som innehåller DMEM, F12, HEPES, glukos, penicillin-streptomycin | |
| ** Innehållande 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine | |
| 20 nM progesteron och 30 nM natrium selenit | |
Tabell 5: Beredning av ELL priming medium.
| DFGHPS * för en brunn i en 24-well platta | 1 mL |
| TPPS ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM L-glutamin | 5 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin | 2,5 ΜL |
| 20 µg/mL basic fibroblast tillväxtfaktor | 0,5 ΜL |
| 5 mg/mL Heparin | 0,5 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * Som innehåller DMEM, F12, HEPES, glukos, penicillin-streptomycin | |
| ** Innehållande 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine | |
| 20 nM progesteron och 30 nM natrium selenit | |
Tabell 6: Beredning av FHL priming medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Möjligheten att kultur och manipulera hNSCs ger ett kritiskt verktyg som kan användas för olika ändamål från modellering mänskliga sjukdomar till hög genomströmning drug screening10,11,12,14, 15,16,17. Många frågor återstod att ta itu med såsom hur mänskliga fostrets hjärnan Karolina eller deras avkomma är mottagliga för ZIKV infektion, huruvida olika stammar av ZIKV infektera Karolina med lika effektivitet och hur infektionen under neural utveckling resulterar i mikrocefali. Vi har använt denna hNSC kultur för att undersöka Zika virus associerade neuropatologi11,14. Genom att använda tre stammar av celler isolerade från tre enskilda givare, är vi också kunna jämföra individuella skillnader till mottaglighet för neurologiska bortfall observeras följande ZIKV infektion11. En av begränsningarna av denna teknik är tillgängligheten till hNSC prover och det luftkonditionerade mediet som är avgörande för korrekt kultur. För att kringgå detta hinder, vänligen kontakta motsvarande författare att ordna en materiell överföring som cellerna som används i detta protokoll inte är kommersiellt tillgängliga.
In vitro studier med hNSCs inte bara ger unik insikt i grundläggande stamceller beteende, de ger också en utmärkt plattform för att bedriva preklinisk forskning. De tekniska utmaningarna med odling hNSCs kan dock fungera som ett hinder i att använda dem som effektiva och reproducerbara modeller. I detta protokoll, har vi sammanställt viktiga steg och metoder som kan användas för att minska variationen i odling metoder och ger en frisk och stabil hNSC stamceller kultur. En nackdel med att använda hNSC neurosphere kultur är att cellerna är extremt känsliga för alla stimuli. Även med det detaljerade protokollet ovan är det viktigt att uppmärksamma på hur mycket den kolvar eller rätter av hNSCs hanteras, eftersom de mest subtila variationerna på protokollet kan resultera i förändringar i neurosphere beteende.
Den mest avgörande delen av denna metoder papper är cocktailen av tillväxtfaktorer och beredning av olika media. Om fördubbling tid av den hNSC kulturen är mycket låg, eller många celler adherie till kultur fartyget (när de bör vara icke-anhängare), det första steget är att säkerställa att de tillväxtfaktorer som används är lämpliga koncentrationen och inte utgånget. Alla tillväxtfaktorer i detta protokoll har en mycket kort hållbarhet en gång tinade (5-6 dagar). Dessutom har vi använt tillväxtfaktorer från flera företag och märkt skillnader i kvalitet och koncentration som behövs för att bibehålla kulturen. Vi rekommenderar därför använda de exakta tillväxtfaktorer detaljerad i Material tabell. Det passaging steget (steg 3.1-3.22) är också en vanlig källa till fel. Om det finns många döda celler efter dissociation process, minska antalet gånger av pipettering upp och ner för att sära på cellerna, eftersom för mycket fysiska dissociation kan leda till celldöd. Alternativt om det finns många kluster av celler efter steget dissociation, öka den kraft eller antal gånger för pipettering upp och ner, som dessa kluster kommer snabbt bli stora sfärer som inte kommer att förbli livskraftig kultur. Om kulturen bibehålls ordentligt, är infektion med ZIKV relativt okomplicerad.
Även ZIKV infektion är den behandling som beskrivs i detta protokoll, är det möjligt att använda detta hNSC kultur system för ett brett spektrum av studier. Denna modell-systemet kan användas till skärmen droger, undersöka individuell känslighet och undersöka bakomliggande mekanismer för en mängd sjukdomar och utvecklingsstörningar14. Detta system är också perfekt för genomisk studier eftersom de odlade cellerna inte har manipulerats genetiskt och visa lite att inga kromosomavvikelser, ända upp till 80 stycken10,11. Vi anser att denna kultur-systemet är perfekt för modellering i vitro hur miljön stimuli såsom infektion, läkemedel, alkohol, toxiner, etc. kan påverka utvecklingen av nervsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av medel från John S. Dunn Foundation och Institutet för mänskliga infektioner och immunitet på University of Texas Medical Branch (PW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
