Summary
이 문서는 문화, 다양 한 신경 하위와 이다, Zika 바이러스 감염 연구 신경 줄기 세포의 사용에 대 한 강조와 함께 그들을 차별화 하는 방법에 있는 인간적 인 태아 두뇌 신경 줄기 세포를 확장 하는 데 사용 되는 방법을 자세히 설명 합니다.
Abstract
인간의 태아 뇌 신경 줄기 세포는 인간의 발달 신경 생물학에 다양 한 자극의 영향 연구에 고유 비-유전자 변형된 모델 시스템입니다. 오히려 동물 모델 또는 유전자 변형된 유도 만능 세포를 사용 하 여, 보다 인간의 신경 줄기 세포 화면 약물 치료의 효과 검사 하거나 개별 차이 검사에 효과적인 체 외에 시스템을 제공 합니다. 여기, 우리 인간의 태아 뇌 신경 줄기 세포 세럼 무료 미디어, 다양 한 신경 하위 및 다른 못쓰게 절차를 통해 이다 그들을 차별화 하 고 고정 하 고 복구와 문화에서를 확장 하는 데 사용 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜 제공 이러한 세포입니다. 또한, Zika 바이러스 감염 연구를 인간의 태아 뇌 신경 줄기 세포를 사용 하 여 프로시저를 설명 합니다.
Introduction
Zika 바이러스 (ZIKV)는 성적으로, 또는 모기 벡터 Aedes aegypti , Aedes albopictus 모기에 의해 전송 flavivirus. ZIKV 전송의 용이성으로 인해 심각한 공중 보건 위협으로 최근 확인 됐다 고 신경 증상1제휴. 하나는 대부분의 감염 된 임산부2,3태어난 태아에 microcephaly의 개발은 신경 효과 관한. Microcephaly 머리가 일반 크기 보다 작은 태아 개발 중 그리고 출생 시, 평균4아래 2 표준 편차 보다 작은 원주와 neurodevelopmental 장애입니다. 작은 머리 둘레 comorbidities 발달 지연, 발작, 비전 및 청력 손실, 및 어려움 먹이 등의 다양 한 일반적으로 동반 됩니다.
최근 연구 동물 모델 또는 유도 만능 줄기 세포 neurodevelopment5,6,,78ZIKV 감염의 효과 연구 하는. 이러한 연구는 ZIKV, 다른 종류의 사용의 우리의 지식에 공헌 했다 또는 유전자 변형된 세포 시간이 소요 될 수 있습니다 또는에 ZIKV의 효과 혼동 수 있습니다 추가적인 변수를 추가 하는 동안5, 세포 신경 개발 6 , 7 , 그러나 8., hNSC 문화, 특히 비 점착 neurosphere 문화가이 프로토콜에서 설명 된 어려움은 문화 문화9를 수행 하는 데 사용 하는 방법에 아주 과민 하다. 중간 구성 요소, 또는 심지어 문화 선박의 물리적 처리에 어떤 변화 든 지 셀9에서 반응을 유도 충분 하다. 이러한 문제를 해결 하기 위해 우리는 생체 외에서 인간 태아 두뇌 파생 된 신경 줄기 세포 (hNSCs) 문화 mechanistically 태아 신경 줄기 세포에 ZIKV의 효과가 개발. 우리의 방법을 사용 하 여, hNSCs는 명백한 phenotypic 변경10없이 80 구절에 대 한 유지 되었다. 또한, trisomy 같은 염색체 변경 했다 없음 또는 최소한의11. 이 hNSC 문화 비 점착 neurosphere 문화로 자 랍니다. Neurospheres의 장점 중 하나는 구체 2 차원 문화9에 비해 vivo에서 틈새의 더 반사 이다 문화에 독특한 환경 틈새를 만들. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 그 여러 셀 형식 파생 될 수 있다 hNSC 문화에서 주어진된 변수 hNSC 생존 및 분화에 미치는 영향을 관찰 하는 탐정을 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 시스템 개발 또는 기능 장애에 관한 기계 질문 하고자 하는 개인에 게 적용 됩니다. 다음 프로토콜 위하여 ZIKV, 감염 후 감염 분화 과정에 미치는 영향을 관찰 하는 hNSCs hNSC 문화를 확장 하는 방법을 설명 합니다. 그것은 또한 장기 사용에 대 한 hNSCs를 저장 하 고 hNSCs ZIKV 유도 적자 뇌 기형11에 기여의 더 허용 하는 뉴런의 다양 한 유형으로 차별화 하는 방법을 포함 한다. 우리는이 프로토콜은 또한 감염이 나 신경 줄기 세포 생존 및 분화에 독 소 같은 어떤 환경 자극의 영향을 이해 하고자 하는 수 사관에 대 한 관심의 믿습니다.
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Protocol
인간의 신경 줄기 세포 첫 임신12에 버려진된 인간의 태아 이르렀다는에서 원래 파생 되었다. 모든 프로토콜 절차 인간의 조직 샘플의 사용에 관한 텍사스 대학 의료 지점 윤리 지침을 준수 하 고 셀 라인 기관 Biosafety 위원회에 의해 승인 했다.
1. 재고의 준비 및 줄기 세포를 복구 하는 중
- 단계 1.1.1.-1.1.5에서 시 약을 결합 하 여 문화 매체 주식 (DFHGPS)를 준비 합니다.
- 높은 포도 당과 Dulbecco의 수정이 글 매체 및 L-글루타민 (D)의 210 mL를 추가 합니다. 4 ˚C에서 그것을 저장 합니다.
- L-글루타민 보충 (F)과 햄의 F12 영양소 혼합의 70 mL를 추가 합니다. 4 ˚C에서 그것을 저장 합니다.
- 4.2 mL 15 m m의 추가 HEPES 버퍼 (H) 상 온에서 저장 하 고.
- 4.2 mL 10%의 추가 D-포도 당 솔루션 (G) 상 온에서 저장 하 고.
- 페니실린/스 (PS) 솔루션의 2.88 mL을 추가... 약 3 mL aliquots로 재고 솔루션 수 필요할 때까지-20 ° C에서 aliquots를 저장 하 고.
주: 매체에 페니실린의 최종 농도 100 단위/mL, 고 스의 농도 100 µ g/mL를 될 것입니다. 이 매체는 프로토콜의 나머지 부분에 대 한 DFHGPS로 참조 됩니다 고 1-2 주 이내 사용 4 ° C에 저장 한다. 필요한 경우 DFHGPS 수 있습니다 확장할 수 비례.
- 하루 전에 세포 복구, 코트 바른된 매체의 5 mL와 T75 플라스 크, hNSC 셀 라인의 이전 문화에서 얻은 고 8.5% 이산화탄소 (CO2)와 함께 37 ° C 배양 기에서 떠나 하룻밤.
참고: 현재 hNSCs 경작, 세포는 중간 변경 증가 되었습니다 매체 저장. 이것은 그것은 되었습니다 "조건" 셀에 의해 조건 화 된 매체입니다. 바른된 매체 스크류 캡 튜브에 저장 고 4 ° C에서 약 7 일 동안 저장 될 수 있습니다. HNSCs을 받을 해당 작성자에 게 문의. 바른된 매체는 선호 하지만 절대적으로 필요 하지, 특히 처음 시작할 때 hNSCs의 문화 이다. - 복구, 날 적어도 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 50 mL 스크류 캡 튜브에 DFHGPS의 20 mL 따뜻한 고 물 목욕에 사용 하 여 준비까지.
- 별도 15 mL 스크류 캡 튜브에 적어도 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 DFHGPS의 10 mL 따뜻한 고 물 목욕에 단계 1.13에서에서 사용할 준비가 될 때까지.
- 모든 중간 구성 요소 (표 1)과 얼음의 컨테이너를 검색 합니다. 얼음에 모든 중간 구성 요소를 녹여 및 매체 변화에 대 한 준비 하는 동안 얼음에 그들을 두십시오.
- 바른된 중간 재고 (4 ° C에서 저장 된)의 5 mL을 얻기 고 37 ° C 물 욕조에 단계 1.14에서에서 사용할 준비가 될 때까지. 경우 조건된 중간 또는 현재 인간의 태아 신경 줄기 세포 문화 참고 단계 1.2 후 참조.
- 1.3 단계에서 50 mL 스크류 캡 튜브를 검색 하 고 biosafety 내각 (BSC)에 배치. 새로운 15 mL 스크류 캡 튜브에 DFHGPS의 10 mL를 전송 하 고 50 mL 튜브 포함 DFHGPS 매체의 나머지 10 mL 37 ° C 물 욕조에 다시 놓습니다.
- 액체 질소에 저장 하는 hNSCs의 cryo 유리병을 가져옵니다. 인간의 태아 신경 줄기 세포 문화 현재 경우 1.2 단계 후 메모를 참조.
참고: 인간 신경 줄기 세포 원래 버려진된 인간의 태아 두뇌12 에서 파생 되었고 유전 수정10없이 문화에서 유지. 5 × 106 세포를 해 동 한 T75 플라스 크에 도금 해야 합니다. 각 곳을 알아내는-유리병 5 × 106 세포; 있어야 합니다. 따라서 플라스 크 당 한 유리병이 필요 합니다. - 모든 10 유리병을 반전 하 여 37 ° C 물 목욕에 셀의 유리병을 녹여 약 1 분 동안 또는 얼음이 녹아 때까지 유리병의 내용이 완전히 액체 s. 잠재적인 오염을 방지 하는 물에서 전체 유리병을 잠수함 하지 마십시오.
- BSC에서 P1000 마이크로 피 펫을 사용 하 여 발음 해 동된 셀 솔루션을 drop-wise에 추가 15 mL 튜브 단계의 1.7, DFHGPS의 10 mL를 포함 하. 해 동된 셀을 추가 하려면 솔루션 drop-wise, 천천히 눌러 플런저만 드롭 또는 두 개의 한 번에 해제 되도록. 한편, 빠른 혼합 수 있도록 15 mL 튜브를 소용돌이 친다.
- 실 온에서 5 분 동안 200 x g에 세포 현 탁 액 원심 상쾌한, 셀 펠 릿을 유지를 확인 하 고 삭제 합니다.
- 1.11 단계 단계 1.7에서에서 나머지 10 mL를 포함 하는 50 mL 튜브를 검색 합니다. 원심, 후 실 온에서 5 분 동안 200 x g에 10 mL DFHGPS 원심 분리기에 셀 펠 릿을 다시 resuspend.
- 마지막 회전 중 다음 표 1 단계 1.4 (표 1) BSC에서에서 DFHGPS 매체의 10 mL에 성장 인자를 추가 하 여 새로운 성장 매체를 준비 합니다. 사용 하 여 준비까지 BSC에 성장 인자를 포함 하는 새로운 매체를 둡니다.
- 1.2 단계에서 T75 플라스 크를 검색 하 고 열망 하 여 플라스 크를 코팅 조절된 매체를 삭제. 다음 단계의 1.6 바른된 미디어의 5 mL를 추가 합니다. 플라스 크에는 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여. 수 술병의 바닥 스크래치 하지 않도록 주의 하십시오.
- 원심 분리기에서 셀의 튜브를 검색 하 고, 셀 펠 릿을 그대로 발음으로 상쾌한 삭제.
- 5 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 여러 번 위아래로 pipetting 셀 펠 렛 1.13 단계에서 새로운 미디어의 10 mL에 resuspend. 1.14 단계에서 코팅된 T75 플라스 크를 정지를 추가 합니다. 나머지 5 mL를 사용 하 여 셀 펠 릿을 포함 하는 튜브를 헹 구 고 뿐만 아니라 플라스 크에 그 5 mL를 추가 합니다.
- 셀은 플라스 크에 걸쳐 고르게 분포 되도록 T75 플라스 크 3 번 앞뒤로 바위. 플라스 크의 모자는 느슨한 공기 흐름을 허용 하도록 다는 것을 확인 하십시오. 가벼운 현미경 세포를 관찰 하 고 메모, 가능 하다 면 이미지를 받아.
참고: 셀은 반투명 하 고 구형을 찾아야 한다. 만들기 참고 있으면 그 모습, 불투명, 세포 또는 비대칭 경계선으로이 세포 죽음을 나타낼 수 있습니다. 또한 색상에서 노란 되 고 미디어 어떤 곰 팡이 또는 세균 오염에 대 한 감시. - 8.5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 세포의 플라스 크를 놓습니다.
참고:이 혈 청 무료 문화 미디어 7.1-7.4의 범위에서의 pH를 유지 하기 위해 5.0% CO2 대신 8.5%를 사용 합니다.
2입니다. hNSC 매체 변경
참고: 모든 3-4 일 매체를 변경 합니다.
- BSC를 켜고 70% 에탄올으로 철저 하 게 청소. 가벼운 현미경으로 세포를 관찰 합니다.
참고: 셀의 모양에 메모를 확인 하 고 범위 크기. 3 일 후 복구 또는 통로, 세포 클러스터 함께 되며 비 점착 neurospheres를 형성 하기 시작.
주의: 세포는 플라스 크의 하단 준수, 문화 셀 준수 조 차별화 증가 하 고 세포 줄기의 상태를 유지할 수 있을 것입니다 삭제 됩니다 필요 합니다. 플라스 크에 너무 많은 셀이, 셀 경우 큰 분야 (직경에서 2 m m 이상)를 형성 수 있습니다, 그리고 셀 구 중심에 매체에 성장 요인에 대 한 액세스의 부족으로 차별화 하는 데 시작 됩니다. 직경에서 1 m m 보다 큰 분야, 관찰 하는 경우 셀 passaged (단계 3.1-3.22) 될 수 있습니다. - 1.4, 1.5, 단계를 수행 하 고 10 mL 신선한 매체의 준비 (1.13 단계 참조).
- 플라스 크의 바닥에 침 몰 하는 분야를 수 있도록 측면에 플라스 크를 기울기.
- 바른된 미디어의 5 mL는 5 mL 혈 청 학적인 피 펫, 어떤 neurospheres를 발음 하지 않도록 주의 복용를 사용 하 여 풀링된 매체의 정상에서 제거 합니다. 깨끗 한 15 mL 튜브에 바른된 미디어의 5 mL을 놓습니다.
- 다시 신중 하 게 피하 영역, 플라스 크에서 바른된 미디어의 추가 5 mL을 제거 하 고 동일한 15 mL 튜브에 5 mL을 배치.
- 2.2 단계에서 바른된 미디어와 플라스 크에 세포의 나머지 5 mL 뉴 미디어의 10 mL를 추가 합니다. 평면 아래 플라스 크를 설정 하 고 가벼운 현미경으로 세포를 관찰.
- 나타나면 세포 조절된 매체의 수집 중 발음 되어 있다, 실 온에서 5 분 x 100g에 바른된 매체를 회전 합니다. 다시 조절된 하는 매체의 1 mL에 하단에 축적 하는 어떤 셀을 일시 중단 하 고 문화 플라스 크에 그들을 추가 합니다.
- 15 mL 스크류 캡 튜브에 4 ˚C에서 2.5/2.6 단계에서 사용 하지 않는 바른된 미디어의 10 mL를 저장 합니다.
- 1.17/1.18 단계를 반복 합니다.
3입니다. hNSC 통로
참고: hNSCs 통로 모든 9 월 11 일 세포 성장 일반적으로, 시간을 두 배로 하는 인구는 약 3 일13이어야 한다.
- 있는지 확인 새로운 플라스 크에는 NSCs를 확장 하는 경우 모든 새로운 플라스 크는 단계 1.2로 입힌 다.
- 2.1 단계 에서처럼 BSC를 청소 하 고 1.4와 1.5 단계 실시.
- 준비 단계 1.13에서 매체. 각 T75 플라스 크에 10 mL 매체의 필요합니다. 여러 T75 플라스 크에 10 mL 플라스 크의 수에 의해 미디어의 증식.
- 1 또는 3 mL 포도 당 인산 염 버퍼 식 염 수 (dPBS) Dulbecco의와 장소에 따라 표 2에서 볼륨 (trypsin 솔루션)에 대 일 분 동안 따뜻한 37 ° C 물 욕조에 준비 합니다. 이 시간에 트립 신 또는 DNase를 추가 하지 마십시오. 기계적 또는 화학적 셀 분리 때문에 죽은 세포에서 발표 된 DNA 뜨 DNase는 필요할 수 있습니다.
참고: T75 플라스 크의 성장 9-10 일 후 passaged 한 있을 것입니다 약 30 × 106 셀, 경우 5 × 106 플라스 크에 시드 원래 했다. 일반적으로, 10 × 106 세포 dPBS 솔루션의 1 mL 사용 됩니다. 따라서, 9-10 일 후 passaged T75 플라스 크 3 mL dPBS 솔루션의 필요 합니다. - 후드에서 청소 작은 무게 보트와 hemocytometer를 배치 합니다. 70% 에탄올으로 깨끗 하 고 약 5 분에 대 한 후드에 건조 공기를 허용.
참고: 무게 보트 3.17.1 단계에서 사용 됩니다. - 인큐베이터에서 passaged와 BSC에가지고 있는 세포의 플라스 크를 검색 합니다. 부드럽게 셀 풀링된 미디어의 하단에 싱크대를 허용 하는 플라스 크를 기울기. 약 15 mL 플라스 크에 미디어의 있다.
- 5 mL 부분 (즉, 5 + 5 mL)에서 미디어의 약 10 mL를 제거 합니다. 미디어의이 10 mL을 "바른된 매체"에 대 한 표시 "CM" 깨끗 한 15 mL 튜브에 넣으십시오. 미디어에서 플라스 크;의 나머지 5 mL에 정착 하는 셀의 발음 하지 않도록 주의 하십시오 이러한 셀 및 미디어의 5 mL 단계 3.8 받게 될 것입니다.
- (에서 단계 3.7) "CM" 튜브에서 바른된 미디어의 3 mL을 받아 고 15 mL 튜브 "트립 신 억제제 솔루션"을 표시 합니다. 이 단계 3.12에서에서 사용 됩니다. 3 mL의 제거 후, "CM" 튜브에 남아 있는 바른된 미디어의 7 mL입니다. 3.9 단계까지 "CM" 튜브를 따로 설정 합니다.
- 미디어와 T75 플라스 크에 남아 있는 셀의 5 mL을 제거 하 고 "셀" 이라고 표시 된 깨끗 한 15 mL 튜브에.
- "CM" 튜브 (3.7.1 단계)에서 바른된 미디어의 7 mL를 포함 하 고 린스 3.5 mL 부분의 바른된 미디어, 5 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 두 번 T75 플라스 크의 하단. 각 린스 후 3.5 mL 부분을 "셀" 관으로 놓습니다. 이 단계의 목적은 T75 플라스 크에서 모든 neurospheres (세포)를 제거 하는 것입니다.
- 실 온에서 5 분 x 100g에서 "셀" 튜브 원심 셀이 회전 하는 동안 37 ° C 물 목욕에서 dPBS/포도 당 솔루션을 얻을 하 고 트립 신 및 표 2에 따라 DNase의 적절 한 금액을 추가.
- "셀" 관 회전 중지, 후 표면에 뜨는 모든 조건된 매체를 제거 하 고 "CM" 튜브를 전송.
- 레이블이 "트립 신 억제제 솔루션" 단계 3.7.1에서에서 튜브를 가져가 라. 고 표 3에 표시 하는 트립 신 억제제의 볼륨을 추가 합니다. 트립 신 억제제 솔루션의 동일한 볼륨을 사용 하 여 트립 신 솔루션에 사용 되는.
- 37 ° C 물 목욕까지 필요에 트립 신 억제 물 솔루션을 배치 합니다.
- 15 mL 튜브에 셀 펠 릿을 trypsin 솔루션을 추가 하 고 플라스틱 아래로 약 5-10 시간 5 mL 피 펫으로. 튜브의 뚜껑을 닫고 5 분 동안 37 ° C 물 욕조에 품 어. 5 분 후 셀을 검색 하 고 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 5-10 시간. 다음 추가 10-15 분 동안 37 ° C 물 목욕에 품 어.
- 마지막 5 분에 BSC를 트립 신 억제 물 솔루션을 이동 합니다.
- 2.14 단계 완료 되 면 셀을 검색 하 고 분야는 완전 하 게 해리 될 때까지 아래로 셀 플라스틱 (20-30 배). 그런 다음 즉시 트립 신 억제제 솔루션 및 10 번 왔다 갔다 피 펫 추가. 천연된 셀과 트립 신 억제제의이 솔루션을 "세포 현 탁 액"으로 참조 됩니다.
- 다음 단계에 의해 세포 현 탁 액에 있는 셀의 수를 계산.
- Trypan 블루 사전 혼합 (5 µ L의 0.4% Trypan Blue, 10 µ L dPBS의 포함)의 15 µ L 작은 무게 보트에 플라스틱 고 세포 현 탁 액의 5 µ L를 추가 합니다. 위쪽 및 아래쪽에 3-5 회 플라스틱 혼합. 다음, 피 펫 10 µ L를 hemocytometer의 양쪽에 Trypan 블루/세포 현 탁 액의 유리 coverslip로 덮여.
- 가벼운 현미경으로 세포를 관찰 하 고 4 개의 코너 격자의 각 셀의 총 수를 계산. 이 숫자를 함께 추가 합니다.
- 다른 측면에 대 한 계산을 반복 하 고 두 가지 측면을 함께 평균.
- ML 당 세포의 총 수에 게 10, 000에이 수를 곱하십시오. 이 번호는 셀에에서 셀의 총 수를 계산 하기 위해 밀리 리터의 총 수에 곱하십시오. 얼마나 많은 양의 세포 현 탁 액 시드 T75 플라스 크 당 5 백만 셀 필요가 있을 것입니다 계산 합니다.
참고: 일반적으로 9-10 일 후는 T75 해야한다 25-30 × 106 셀. 따라서, 새로운 플라스 크로 모든 셀을 뿌리고, 5-6 플라스 크의 총 필요 하다. - 세포 현 탁 액 단계 3.19 플라스 크 당 5 × 106세포를 각 T75 플라스 크에서에서 계산의 볼륨을 추가 합니다. 볼륨은 5 mL 미만, 5 mL의 총 있도록 추가 조건 매체를 추가 합니다. 플라스 크에 새로운 DFHGFPS가 미디어에 포함 된 성장 인자 (표 1) 10 mL를 추가 합니다.
- 1.17과 1.18 단계를 반복 하 고 플라스 크 셀, 날짜, 플라스 크, 셀 수 및 (이것은 셀을 passaged 번 수) 통로 번호의 형식으로 표시 합니다. 다음 4-9 단계 이동 합니다.
- 필요한, 씨앗 외에 세포 밀도에서 한 T75 플라스 크 하룻밤, 플라스 크 당 30 × 106셀 최대 하 고 4 단계에 따라 다음 날 고정.
4. hNSC 및 저장
- 뿌리고, 후 일 (에서 단계 3.19 3.22) 동결에 대 한 셀을 포함 하는 인큐베이터에서 플라스 크를 검색 합니다. 플라스 크를 기울기 고 플라스 크를 15 mL 튜브에 장소 모든 매체와 셀을 제거 합니다. 다음 5 분 동안 216 x g에서 튜브 원심.
- 원심 분리 과정에서 동결 매체 (표 4)을 준비 합니다. 모든 5 × 106 세포 동결 매체의 1 mL를 준비합니다. 세포의 수는 각 플라스 크에 넣어 얼마나 많은 세포를 결정할 때 단계 3.19에서에서 결정 되었다. 이 번호는 하룻밤 변경 되었습니다 것입니다.
- 셀 이름, 통과 번호, 휴대폰 번호, 이니셜 및 날짜의 레이블 cryo-보존 튜브를 준비 합니다. 원심, 후 포부에 의해 상쾌한을 제거 하 고 다시 5 × 106 셀/mL는 중간에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 사용 하 여 aliquot 5 mL 피 펫 1 mL 유리병 및 인감 단단히 (병 당 5 × 106 세포).
- 소 프로 파 놀 (소 프로 파 놀의 교체 당 5 번의 최대 사용)의 250 mL cryo-보존 용기에 튜브를 배치 합니다. -80 ° C 냉장고에서 하룻밤, 저장 하 고 액체 질소 탱크 스토리지 시스템에 전송.
5. 유효성 검사에 대 한 도금 부착 hNSC
- 하루 전에 뿌리고 (3.1-3.22 단계) 단계 2.2에서 BSC를 청소 하 고 24-잘 접시 및 멸 균 유리 12 m m coverslips.
- 집게를 사용 하 여의 각 접시의 바닥에 단일 coverslip 장소.
- 메 마른 물에 포함 된 0.01% 폴 리-D-리 (PDL)와 커버 슬립 웰 스 코트와 1 h 37 ˚C에서 품 어. 24-잘 접시 잘 당 PDL의 250 μ를 사용 합니다.
- 우물에서 PDL를 제거 하 고 1 µ g/c m2 laminin/dPBS (250 μ 잘 당)와 코트. 37 ° c.에 하룻밤 접시를 품 어 하지 않을 경우 다음 날 접시의 가장자리 주위 parafilm 여 parafilm으로 접시를 밀봉 하 고 4 ° c.에 저장 필요
참고: laminin 코팅 접시 저장할 수 있습니다 2 주 커버 미끄러져 건조 하지 마십시오으로 parafilm으로 밀봉 하는 경우. - 으로 통과 셀 3.1-3.22, 단계에서 설명한 고 코팅된 coverslips와 24-잘 접시에 씨앗을 셀 수를 결정 합니다.
- 포부, 통해 우물에서 어떤 과잉 laminin 솔루션을 제거 하 고 dPBS의 0.5 mL로 한 번 씻어. 다음에 잘 당 0.6-1 x 105 셀/c m2 의 조밀도에 우물으로 셀 씨. 3.16-3.21 단계에 따라 나머지 셀을 사용 합니다.
- 24-잘 접시 문화 중 Atvarious 번 수정 하 고 9 단계에 따라 다양 한 줄기 세포 표식에 대 한 셀을 얼룩.
6. 뉴런 GABA와 조미료를 못쓰게
- 3.1-3.22에서 설명한 대로 셀을 통과 하 고 단계 5.6에서 24-잘 접시에 씨앗을 셀 수를 결정 합니다.
- 애 벌 칠, 전날 준비 커버 전표 및 코트 판 단계 5.1-5.4에에서 설명 된 대로.
- 못쓰게 하루에 2-3-하루 세포를 포함 하는 플라스 크를 검색 합니다. 15 mL 튜브에 놓고 5 분 x 100g에 centrifuging 여 세포를 작은.
- 표 5에 따라 표 피 성장 인자/백혈병 금지 요인/laminin (ELL) 못쓰게 매체를 준비 합니다.
- ELL 매체와 셀 resuspend
- 씨 24-잘 접시 (수행 단계 5.6)에 셀을 중단.
7. 모터 뉴런을 못쓰게
- 6.1 6.4 단계.
- 표 6에 따라 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자/덤플링을/Laminin (FHL) 못쓰게 매체를 준비 합니다.
- 5.6 단계를 따릅니다.
8. Zika 바이러스 감염
참고: ZIKV는 온도에 매우 민감한, 그래서 그것은 ZIKV 주식에-80 ° C와 동결/녹고 사이클 저장 됩니다 필수적 피할 수 있습니다. 얼음에 aliquots을 일하고 유지.
- 3.1-3.22 단계에 설명 된 대로 세포를 통과. 총에서 3-4 백만 셀 때 뿌리고, 감염에 대 한 필요 하 고 뿌리고 때 술병에 시드 셀 수 24-잘 접시를 따라서 씨앗 필요 합니다.
- 얼룩에 대 한 24-잘 접시에 셀 시드, coverslips 및 단계 5.1-5.4에 따라 접시를 준비.
- 뿌리고, 후 5 분 동안 실 온에서 200 x g 1ml 세포 현 탁 액 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 그리고 원심 분리기로 8.2 단계에서의 장소. 열망 하 여는 상쾌한을 제거 합니다.
- 중 1 ~ 10의 감염 (MOI)의 다양성을 얻으려고 ZIKV 재고 단계 8.3에서에서 펠 릿 resuspend ZIKV 솔루션의 볼륨 0.5 mL를 넘지 말아야 한다. 모의 치료 (제어 셀), 같은 볼륨 및 ZIKV 주식에 사용 되는 매체의 종류에 셀 resuspend.
참고: ZIKV 재고 준비 및 감염 이전 게시11에 자세히 있습니다. 모의 감염 매체와도 실시 됩니다. - 1 헤 반전 튜브, 2-3 시간 하 고 다음 셀 펠 렛을 얻기 위해 상 온에서 216 x g에서 5 분을 위한 혼합물을 원심 셀/ZIKV 혼합 37 ° C에서 위에 품 어. 실 온에서 216 x g에서 펠 릿 dPBS에 다시 5 분 동안 원심 분리기를 resuspend.
- 열망 하 여는 상쾌한을 제거 하 고 적절 한 매체와 셀 resuspend 감염 된 세포를 플라스 크 또는 접시 실험에 필요한 로드. 24-잘 접시에 셀 시드 경우 적절 한 매체의 12 mL에 펠 릿을 resuspend 고 각 우물에 서 스 펜 션의 500 μ를 추가 합니다.
참고:이 시점에서 줄기 세포에 대 한 ZIKV의 효과 관찰 성장 매체에서 세포를 유지 하거나 6 또는 분화 과정에 ZIKV의 효과 연구 하는 7 단계로 이동 합니다.
9. 얼룩 절차
- 세포를 해결 하려면 제거 매체, 얼음 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 음 (24-잘 접시) 당 0.5 mL로 한 번 씻어.
- PBS를 제거 하 고 0.5 mL PBS에 4 %paraformaldehyde 셀 커버 20-30 분 동안 실내 온도에 떠날.
- paraformaldehyde 제거 하 고 0.5 mL PBS, 실 온에서 10 분 동안에 세 번째 PBS 린스를 떠나의 세 번 셀 린스.
- 이 시점에서 PBS 하룻밤 사이에 두고 고 4 ˚C에서 접시를 저장 하거나 10 분 린스 후 얼룩이 지기 시작 합니다.
- 10 분 PBS 린스 후 차단 5% 정상 염소 혈 청 (NGS), 0.3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 0.5 mL 솔루션으로 고정 위치에 45-60 분에 대 한 셀 0.25% 트라이 톤 X-100 Tris 버퍼 염 분 (TBS)에서. 솔루션 사용을 차단의 1 mL를 만들려고 예: 25%의 10 µ L 트라이 톤 X-100, 100%의 50 µ L NGS, 고 3 %BSA 100 µ L의 tbs. 840 µ L에 혼합
- 단계에서 차단, 모든 시 약은 얼음에 보관 됩니다 확인 하 고 기본 항 체 솔루션을 준비 합니다. HNSCs의 유효성을 검사, 단백질 Nestin 같은 그들에 대 한 적절 한 항 체를 사용 하 여 대상 수 있습니다. ZIKV 외 투 단백질11에 대 한 항 체를 사용 하 여 ZIKV 감염의 유효성을 검사 하십시오. 차별화, 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 이다를 식별 하기 위해 사용 될 수 있지만 신경 인구를 식별 하기 위해 클래스 III β-tubulin 같은 마커를 사용 합니다. 1 차 항 체의 농도 따라 공급 업체와 많은 경험적으로 결정 됩니다. 우리는 1: 100 희석 1: 2000, 대부분 항 체를 이용 했다.
- 12000 x g 4 ° C에서 2 분에 1 차적인 항 체를 원심 이며 희석; 예를 들어 항 체의 1:1000 희석을 추가 0.25%의 7.2 mL로 원하는 항 체의 7.2 µ L tbs.에 트라이 톤 X-100
- 24-잘 접시의 각 음을 항 체 솔루션의 약 300 µ L을 추가 하 고 기본 항 체 고정 위치에 하룻밤 4 ˚C 또는 실내 온도에서 2 h에 대 한 고정 위치에 있는 셀을 품 어.
- 부 화, 후 세 번 각 고정 위치에 10 분 동안 실내 온도에 TBS의 0.5 mL로 세포 세척.
- 4 ° C에서 2 분 동안 12000 x g에서 이차 항 체를 원심 다음 0.25% 트리톤 X-100/TBS 솔루션에 희석 합니다. 각 잘 300 µ L 추가 하려면 충분 한 항 체 솔루션을 확인 합니다. 여기, 형광 이차 항 체 1: 500 (그림 3) 희석.
- 최종 TBS 세척 후 각 우물에 이차 항 체 솔루션의 300 µ L을 추가 하 고 고정 된 위치에 실 온에서 1 h에 대 한 어둠 속에서 품 어. 이 시점에서 모든 단계는 어두운 방에서 일어나 야 한다.
- 셀 고정 위치에 각 10 분에 대 한 큰 술을 세 번 씻는 다.
- 마지막 10 분 세척, 중 핵 마커 DAPI 핵 얼룩 TBS (일반적으로 1:1,000-1:5, 000)에서 권장된 하는 농도에 희석. 각 잘 300 µ L 추가 하려면 충분 한 솔루션을 확인 합니다.
- 최종 세척 후 각 우물에 DAPI 솔루션의 300 µ L을 추가 하 고 고정 된 위치에 실 온에서 5 분 동안 품 어. 다음 tbs. 0.5 mL로 한 번 씻어
- 반대로 페이드 장착 매체를 사용 하 여 형광을 1 방울 (10-15 µ L) 당 coverslip 슬라이드에 배치 됩니다. 신중 하 게 제거 하 coverslips 24-잘 접시 우물에서 고 세포 표면 아래로 슬라이드에 장착 중간 드롭에 핀셋을 사용 합니다.
- coverslips 슬라이드에 배치 되 면 플랫 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓습니다. 라벨 슬라이드 확인 그 슬라이드에 세포를 식별 다음 슬라이드 빛 으로부터 보호를 유지 하는 알루미늄 호 일로 홀더를 커버 하는 데 필요한 모든 관련 정보를 것입니다.
- 4 ˚C에 슬라이드를 저장 하 고 하룻밤을 강화 하기 위해 설치 매체를 허용 합니다. 다음 날, 관찰 UV-2E/C 필터 (340-380 nm), GFP HYQ BP 필터 (450-490 nm), 또는 Y-2E/C 텍사스 epifluorescent 현미경을 사용 하 여 슬라이드 빨간색 필터 (540-580 nm), 20 배 확대.
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Representative Results
그들의 증식 단계에서 교양된 hNSCs 비 점착 neurospheres (그림 1)으로 성장할 것입니다. HNSC 통행 다음 즉시 많은 개별 셀, 집계 및 양식 분야는 앞으로 몇 일 (그림 1A 및 1B)에 시작 있을 것입니다. 건강 한 분야 약 1-2 mm 직경에서 9-10 일 통행 (그림 1C) 이어야 한다. 2 m m 보다 큰 성장 하는 분야는 어두운 센터를 개발할 것입니다 하 고 매체에 성장 요인 원치 않는 차별화에 따른 구 중심에 세포에 도달할 수 없습니다. 건강 한 분야 것 이다 반투명 나타나고 표시 영역 (그림 1C)의 가장자리 주위의 의사 속눈썹.
얼룩을 위해 neurospheres 부착 표면에 도금 하는 것은 부착 분야 (그림 2A)의 성장 귀 착될 것 이다. 이 분야 문화 그릇의 표면을 하 고 중앙 영역 (그림 2A)을 유지 하면서, 그릇의 표면에 밖으로 기지개 하는 일부 예측을가지고 것입니다. 못쓰게 하 고 세포 분화 24-잘 접시 등 셀 문화 접시의 하단에 커버 슬립에 셀 필요 합니다. 다음 적절 한 못쓰게 단계와 차별화 매체의 추가, 셀 문화 그릇의 표면에 걸쳐 밖으로 확산 하 고 세포 (그림 2B)의 상호 연결 된 단층으로 성장 한다.
HNSC 문화의 유효성 또는 차별화 된 세포의 표현 형을 확인 하거나, 형광 immunohistochemistry 사용할 수 있습니다. Nestin 중간 필 라 멘 트 NSCs 일반적으로 표현 하 고 hNSC 문화 (그림 3A)를 확인 하는 데 사용할 수 있습니다. 차별화를 다음 뉴런의 존재를 확인 하려면 클래스 III β-tubulin 일반적으로 레이블 뉴런 (그림 3B)를 사용할 수 있습니다. 못쓰게 단계는 차별화를 다음 뉴런의 더 높은 백분율을 달성 하는 데 사용 됩니다, 하지만 있을 것입니다 아직도 이다 문화. 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 레이블 이다 계량 하기 위해 차별화 된 세포의 어떤 백분율 되었다 이다 또는 뉴런을 사용할 수 있습니다.
우리는 NSCs의 K048 라인 ZIKV immunofluorescent 특정 ZIKV 항 체와 얼룩에 의해 검출의 아프리카와 아시아 종자에 의해 감염 되었다 발견. 대표 이미지는 그림 4에 나와 있습니다. 모의 감염 hNSC 형태학 또는 생존 (그림 4A, 4 C)에 변화를 유도 하지 않았다. ZIKV 1 시간 감염, 감염된 세포 1 일 게시물의 주변 지역에 머물 경향이 있다 하지만 3 ~ 7 일 (그림 4B4 D 4E)에서 전체 셀을 채웁니다. 눈에 띄게, 동일한 뫄 (0.1), K048 셀에 약된 5% 감염 속도 그는 최근 ZIKV을 보고 보다 실질적으로 더 낮은 감염 속도 (최대 80%까지) 인간의 피부 유도 NSCs7에서. 이 연구를 보고 80 %infectivity 프로토 타입 마우스 뇌 세포에 140 구절 중 neurotropic 표현 형을 적용할 수 있습니다 (MR766) ZIKV의 아프리카 변형 사용.
그림 1: hNSC 문화의 밝은 필드 이미지. (A-C) 대표적인 밝은 필드 이미지 각각에 뿌리고, 후 hNSC 문화 1, 4, 9 일의 10 배 확대 촬영. 바 규모: 60 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 밝은 분야 이미지 부착 문화. (A) 대표 밝은 필드 이미지를 10 배 확대 부착 hNSC 문화, 도금 후 7 일에서 찍은. (B) 대표 밝은 필드 이미지 부착의 10 배 확대 촬영 분화 세포 ELL 다음 못쓰게와 차별화의 9 일. 바 규모: 60 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: hNSCs와 차별화 된 문화의 형광 이미지. (A) 대표 형광 이미지 (빨간색) 핵 마커, (파란색), DAPI와 줄기 세포 표식 Nestin 스테인드 부착 hNSCs의 20 배 확대에서 찍은. 눈금 막대: 60 µ m (B) 대표 형광 이미지 (파란색) 차별화 된 세포와 신경 마커 βIII-tubulin (녹색), 사이토 메이커 GFAP (빨간색), 그리고 핵 마커 DAPI 스테인드의 60 배 확대에서 찍은. 스케일 바: 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: ZIKV 감염 인간 태아에 있는 두뇌 파생 NSCs. 인간의 NSCs 모의 치료도 했다 (A와 C), ZIKV (B와 D), 0.1의 나에의 아프리카 계보 긴장 또는 최근 2016 (E)에 멕시코에서 모기에서 분리 하는 ZIKV의 아시아 긴장으로 1 시간 동안 주사. Immunofluorescent 얼룩이 1 ~ 7 일 게시물을 접종 (b에서 1 dpi, 7 dpi d, 그리고 e에서 3 dpi)에서 NSCs에서 ZIKV 항 체의 라벨을 검색 합니다. 스케일 바 10 µ m e에서 A-D, 및 5 µ m에 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 한 T75 DFHGPS 미디어 | 10 mL |
| TPPS * | 173 Μ L |
| 200 m m L-Glutamin | 50 Μ L |
| 10 mg/mL 인슐린 * * | 25 Μ L |
| 20 µ g/mL 표 피 성장 인자 | 10 Μ L |
| 20 µ g/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 | 10 Μ L |
| 10 µ g/mL 백혈병 억제 인자 | 10 Μ L |
| 5 mg/mL 헤 파 린 | 10 Μ L |
| * 100 µ g/mL 올려진다, 100 µ M putresine, 20 nM 호르몬, 그리고 30 nM 나트륨 selenite 혼합물. 혼합물은 집중된 주식 고 aliquots-80 ° C에 저장 되 고 preferablly 6 주 준비에서 사용. 집중된 주식 10 mg/mL 올려진다, 30 mM putrescine, 10 µ M 호르몬 및 15 µ M 나트륨 selenite-80 ˚C에 저장 된 있습니다. | |
| * * 인슐린 0.01 N 염화, 0.2 µ M 낮은 단백질 바인딩 필터를 통해 필터링 하 고 최대 6 주 동안 4 ˚C에 저장 된 hydroen에 녹아 있다. | |
표 1: 새로운 확산 매체에 대 한 성장 요인.
| dPBS * | 1 mL는를 | 3 mLb |
| 10% 포도 당 | 60 Μ L | 180 Μ L |
| 2.5% 트립 신 | 10 Μ L | 30 Μ L |
| Dnase * * | 5 Μ L | 15 Μ L |
| * Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 | ||
| * * Deoxyribonuclease | ||
| 10 백만 셀 | ||
| b 30 백만 셀 | ||
표 2: trypsin의 준비입니다.
| 바른된 미디어 | 1 mL는를 | 3 mLb |
| 트립 신 억제제 | 10 Μ L | 30 Μ L |
| 10 백만 셀 | ||
| b 30 백만 셀 |
표 3: 트립 신 억제제의 준비입니다.
| DFHGPS * | 0.7 mL는를 | 2.1 mLb |
| FBS * * 20% | 0.2 mL | 0.6 mL |
| DMSO * * * 10% | 0.1 mL | 0.3 mL |
| * DMEM, F12, HEPES, 포도 당, 페니실린-스 | ||
| * * 태아 둔감 한 혈 청 | ||
| 디 메 틸 sulfoxide | ||
| 5 백만 셀 한 유리병에 대 한 | ||
| b 3 튜브, 5 백만 셀/유리병 | ||
표 4: 준비 냉동 매체의.
| DFGHPS * 24-잘 접시에 하나 잘 | 1 mL |
| TPPS * * | 17.3 Μ L |
| 200 mM L-글루타민 | 5 Μ L |
| 10 mg/mL 인슐린 | 2.5 Μ L |
| 20 µ g/mL 표 피 성장 인자 | 1 Μ L |
| 10 µ g/mL 백혈병 금지 요인 | 1 Μ L |
| 1 mg/mL Laminin | 1 Μ L |
| DMEM, F12, HEPES, 포도 당, 페니실린 스를 포함 | |
| * * 100 µ g/mL 올려진다, 100 µ M putresine를 포함 하 | |
| 20 nM 호르몬, 그리고 30 nM 나트륨 selenite | |
표 5: 준비 엘 못쓰게 매체의.
| DFGHPS * 24-잘 접시에 하나 잘 | 1 mL |
| TPPS * * | 17.3 Μ L |
| 200 mM L-글루타민 | 5 Μ L |
| 10 mg/mL 인슐린 | 2.5 Μ L |
| 20 µ g/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 | 0.5 Μ L |
| 5 mg/mL 헤 파 린 | 0.5 Μ L |
| 1 mg/mL Laminin | 1 Μ L |
| DMEM, F12, HEPES, 포도 당, 페니실린 스를 포함 | |
| * * 100 µ g/mL 올려진다, 100 µ M putresine를 포함 하 | |
| 20 nM 호르몬, 그리고 30 nM 나트륨 selenite | |
표 6: FHL 못쓰게 매체의 준비입니다.
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Discussion
다양 한 용도로 높은 처리량 약10,11,,1214, 심사에 인간의 질병을 모델링에서 사용할 수 있는 중요 한 도구를 제공 하는 문화 및 hNSCs를 조작 하는 기능 15,,1617. 많은 질문에 어떻게 인간의 태아 두뇌 NSCs 등 해결 되어야 남아 있었다 또는 그들의 자손은 ZIKV 감염, ZIKV의 다른 긴장 동등한 효율, NSCs를 감염 여부와 어떻게 신경 개발 하는 동안 감염 microcephaly 결과. 우리 Zika 바이러스 관련 neuropathology11,14조사이 hNSC 문화를 이용 했다. 3 개별 기증자 로부터 분리 하는 세포의 3 개의 종자를 사용 하 여 우리는 신경학 상 적자 관찰 된 다음 ZIKV 감염11민감성에 개별 차이 비교할 수 있습니다. 이 기술의 한계 중 하나는 hNSC 샘플에 대 한 접근 및 적절 한 문화에 대 한 필수 조건된 매체입니다. 이 장애물을 회피, 셀이이 프로토콜에 사용 되는 상용 자료 전송 준비를 해당 저자를 문의 하시기 바랍니다.
에 체 외 연구 뿐만 아니라 hNSCs를 사용 하 여 기본 줄기 세포 행동에 독특한 통찰력을 제공, 그들은 또한 전 임상 연구를 수행 하는 훌륭한 플랫폼을 제공 합니다. 그러나, hNSCs 경작의 기술적도 전에 그들을 사용 하 여 효과적이 고 재현 가능한 모델로 장애물이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리 주요 단계 및 배양 방법에 있는 가변성을 줄이기 위해 사용할 수 있는 하 고 건강 하 고 안정적인 hNSC 줄기 세포 배양을 항복 방법론을 설명 했습니다. HNSC neurosphere 문화를 사용 하 여 단점은 세포는 모든 자극에 매우 민감한입니다. 도 위의 상세한 프로토콜은 프로토콜에 속합니다 유사 neurosphere 동작이 변경 될 수 있습니다 얼마나 많은 플라스 크 또는 hNSCs의 처리에 세심 한 관심을 지불 하는 중요 한.
이 방법 종이의 가장 중요 한 부분은 성장 요인의 칵테일 및 다양 한 미디어의 준비입니다. HNSC 문화의 배로 시간이 매우 낮은 경우 또는 문화 선박 (때 그들이 비 점착) 많은 셀 adherie 성장 인자 사용 되 고 적절 한 농도가 되도록 첫 번째 단계 이며 만료 되지. 이 프로토콜의 모든 성장 요인 들 한 번 (5-6 일)을 해 동 하는 매우 짧은 수명 있다. 또한, 우리 여러 기업에서 성장 인자를 사용 하 고 품질 및 문화를 유지 하는 데 필요한 농도에 차이 발견. 따라서, 자료 테이블에 정확한 성장 인자를 사용 하 여 것이 좋습니다. Passaging 단계 (단계 3.1-3.22) 오류 일반적인 소스 이기도합니다. 많은 죽은 세포 분리 프로세스를 다음과 같은 경우 너무 많은 물리적 분리 세포 죽음 귀 착될 수 있다로 셀, 해리를 아래로 pipetting의의 수를 줄입니다. 또는, 많은 클러스터 분리 단계를 다음 셀의 경우 활기 또는 이러한 클러스터로 아래로, pipetting의 횟수는 신속 하 게 증가 될 문화에 남아 것 이다 큰 구체. 문화는 제대로, 유지 하는 경우 감염 ZIKV은 상대적으로 간단 합니다.
ZIKV 감염이이 프로토콜에 대 한 자세한 치료는, 연구의 광범위 한이 hNSC 문화 시스템을 사용 하 여 가능 하다. 이 모델 시스템은 마약을 화면 개별 민감성을 검사 하 고 다양 한 질환 및 발달 장애14의 기본 메커니즘을 조사를 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 이후 경작된 한 세포 유전자 조작 하지는 아니 염색체 이상, 최대 80도 구절10,11에 작은 표시에 또한 게놈 연구에 이상적. 우리는 감염, 약물, 알코올, 독 소, 등 수 같은 환경 자극 신경 시스템의 개발에 영향을 미칠 방법이 문화 시스템 모델링에서 시험관에 대 하 이상적 이다 믿습니다.
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Disclosures
저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
이 작품은 존 S. 던 재단과 인간 감염 및 면역 텍사스 대학 의료 지점 (외무장관)의 연구소에서 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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