Summary
Este artículo detalla los métodos que se utilizan para expandir células madre neurales de cerebro fetal humano en la cultura, así como distinguir diferentes subtipos neuronales y astrocitos, con énfasis en el uso de células madre neurales para el estudio de la infección del virus Zika.
Abstract
Células madre neurales de cerebro fetal humano son un sistema modelo único non-genetically modificada para estudiar el impacto de varios estímulos en Neurobiología del desarrollo humano. Más bien que utilice un modelo animal o células pluripotentes inducidas genéticamente, células madre neurales humanas proporcionan un sistema efectivo en vitro para examinar los efectos de los tratamientos, medicamentos de la pantalla, o estudiar las diferencias individuales. Aquí, le ofrecemos protocolos detallados para los métodos utilizados para expandir células madre neurales de cerebro fetal humano en cultura con medios libres de suero, para diferenciarlas en varios subtipos neuronales y los astrocitos mediante procedimientos diferentes de cebado y para congelar y recuperar Estas células. Además, describimos un procedimiento del uso de células madre neurales de cerebro fetal humano para estudiar la infección del virus Zika.
Introduction
Zika virus (ZIKV) es un flavivirus transmitido sexualmente o por los mosquitos mosquitos vectores Aedes aegypti y Aedes albopictus . ZIKV fue identificado recientemente como una amenaza grave de salud pública debido a su facilidad de transmisión y afiliado síntomas neurológicos1. Uno de los más relativos a efectos neurológicos es el desarrollo de microcefalia en los fetos nacidos de madres infectadas embarazadas2,3. Microcefalia es un trastorno del neurodesarrollo, donde la cabeza es más pequeña que el tamaño típico durante el desarrollo fetal y en el nacimiento, con la circunferencia menor de 2 desviaciones estándar por debajo de la media4. La circunferencia principal más pequeño comúnmente se acompaña de una variedad de comorbilidades tales como retrasos en el desarrollo, convulsiones, visión y pérdida de la audición y dificultad para la alimentación.
Estudios recientes han utilizado modelos animales o inducida de pluripotent células para estudiar el efecto de la infección por ZIKV en neurodesarrollo5,6,7,8. Mientras que estos estudios han contribuido a nuestro conocimiento de ZIKV, el uso de diferentes especies o células genéticamente modificadas pueden ser lentos o agregar variables adicionales que pueden confundir el efecto de ZIKV en desarrollo neural células de5, 6 , 7 , 8. sin embargo, la dificultad con hNSC cultura, particularmente la desarrolló no adherente se describe en este protocolo, es que la cultura es muy sensible a los métodos utilizados para llevar a cabo la cultura9. Cualquier cambio en los componentes medianos, o incluso la manipulación física de la vasija de la cultura, es suficiente para provocar una reacción de las células9. Para abordar estas cuestiones, desarrollaron una cultura de fetal derivado neural células madre humanas (hNSCs) en vitro para mecánico interrogar el efecto de ZIKV sobre las células madre neurales fetales. Con nuestro método, hNSCs se mantuvieron por más de 80 pasajes sin aparentes cambios fenotípicos10. Además, alteraciones cromosómicas como la trisomía del par fueron ya sea ninguno o mínimo11. Esta cultura hNSC crece como una cultura desarrolló no adherente. Una ventaja de neuroesferas es que las esferas crean un nicho ambiental único en la cultura que se refleja más en vivo lugares en comparación con las culturas dos dimensiones9. Otra ventaja de este protocolo es que múltiples tipos de células se pueden derivar de la cultura hNSC, permitiendo a un investigador observar el impacto de una variable dada en hNSC supervivencia y diferenciación. Este protocolo es aplicable a las personas para responder a preguntas mecanicistas sobre el desarrollo del sistema nervioso central o disfunción. El siguiente protocolo describe cómo expandir una cultura hNSC para infectar con ZIKV y posteriormente diferenciar la hNSCs para observar el impacto de la infección en el proceso de diferenciación. También incluye métodos para almacenar hNSCs para el uso a largo plazo y hNSCs se diferencian en varios tipos de neuronas que permiten más investigación de déficits inducidos por ZIKV contribuyendo al cerebro malformación11. Creemos que este protocolo también es de interés para los investigadores que buscan entender el efecto de cualquier estímulo ambiental como infección o toxinas en la supervivencia de células madre neurales y diferenciación.
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Protocol
Células madre neuronales humanas obtuvieron originalmente de desechos humanos cortexes fetales en el primer trimestre12. Todos los procedimientos de protocolo seguir las directrices de ética de la rama médica de la Universidad de Texas sobre la utilización de muestras de tejido humano, y las líneas celulares fueron aprobadas por el Comité de bioseguridad institucional.
1. acción recuperación medio de preparación y células madre
- Preparar medio de cultivo caldo (DFHGPS) mediante la combinación de los reactivos en pasos 1.1.1.-1.1.5.
- Añadir 210 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco con alta glucosa y L-glutamina (D). Almacenar a 4 ° c.
- Agregar 70 mL de mezcla de nutrientes F12 de jamón con suplemento de L-glutamina (F). Almacenar a 4 ° c.
- Añadir 4,2 mL de 15 mM HEPES Buffer (H) y almacenar a temperatura ambiente.
- Añadir 4,2 mL de 10% solución de D-glucosa (G) y almacenar a temperatura ambiente.
- Añadir 2,88 mL de solución de penicilina/estreptomicina (PS)... Alícuota de la solución madre en alícuotas de 3 mL y almacenar las alícuotas a-20 ° C hasta que se necesite.
Nota: La concentración final de penicilina en el medio será de 100 unidades/mL y la concentración de estreptomicina será 100 μg/mL. Este medio se referirá como DFHGPS para el resto del protocolo y debe ser almacenado a 4 ° C para su uso dentro de 1-2 semanas. Si es necesario, DFHGPS puede ser aumentado proporcionalmente.
- Durante la noche el día antes de que las células se recuperan, un T75 frasco con 5 mL de medio condicionado de la capa, obtienen de culturas anteriores de la línea de celular hNSC y dejan en una incubadora de 37 ° C con 8.5% dióxido de carbono (CO2).
Nota: Si actualmente cultivo hNSCs, ahorre el medio que las células han ido creciendo en durante un cambio de medio. Se trata de medio condicionado, como lo ha sido "condicionado" por las células. Medio condicionado se puede guardar en un tubo de tapón de rosca y almacenado a 4 ° C por aproximadamente 7 días. Contactar con el autor correspondiente para recibir hNSCs. Medio condicionado se prefiere pero no es absolutamente necesaria, especialmente cuando primero a partir de la cultura de hNSCs. - El día de la recuperación, caliente 20 mL de DFHGPS en un tubo de tapón de rosca 50 mL en un baño de agua de 37 ° C durante al menos 10 minutos y mantener en el baño de agua hasta que esté listo para usar.
- En un tubo de tapón de rosca 15 mL separadas, calentar 10 mL de DFHGPS en un baño de agua de 37 ° C durante al menos 10 minutos y mantener en el baño de agua hasta que esté listo para utilizar en el paso 1.13.
- Recuperar un contenedor de hielo y todos los componentes del medio (tabla 1). Descongelar todos los componentes de media sobre el hielo y dejarlas en el hielo mientras se preparan para el cambio de medio.
- Obtener 5 mL de stock medio condicionado (almacenado a 4 ° C) y mantener en un baño de agua de 37 ° C hasta que esté listo para utilizar en el paso 1.14. Ver nota después del paso 1.2 si existe una cultura condicionada media o corriente fetal neural células madre humanas.
- Recuperar el tubo de tapón de rosca 50 mL de paso 1.3 y colocarlo en el gabinete de bioseguridad (BSC). Transferir 10 mL de DFHGPS en un nuevo tubo de tapón de rosca 15 mL y luego colocar el tubo de 50 mL que contiene los 10 mL restantes de medio DFHGPS de nuevo en el baño de agua de 37 ° C.
- Obtener un cryo-frasco de hNSCs almacenados en nitrógeno líquido. Ver nota después del paso 1.2 si existe una cultura de células madre neurales fetales humanas actuales.
Nota: Células madre neuronales humanas originalmente fueron derivadas de cerebro fetal humano desechado12 y mantenidas en la cultura sin modificaciones genéticas10. 5 x 106 células deben ser descongeladas y plateadas en un matraz T75. Cada crio-frasco debe contener 5 x 106 células; por lo tanto, es necesario un frasco por frasco. - Descongelar un vial de células en baño María de 37 º C invirtiendo el vial cada 10 s durante aproximadamente 1 minuto o hasta que el hielo se haya derretido y el contenido del frasco es totalmente líquido. No sumerja el frasco entero bajo el agua para evitar la contaminación potencial.
- En el BSC, utilice una P1000 micro-pipeta para aspirar la solución de células descongeladas y añadir mediante goteo al tubo de 15 mL de paso 1.7, que contiene 10 mL de DFHGPS. Para agregar la solución de células descongeladas mediante goteo, lentamente Presione el émbolo para que sólo una o dos gotas es lanzado a la vez. Mientras tanto, agitar el tubo de 15 mL para permitir una mezcla rápida.
- Centrifugue la suspensión de células a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante, para retener el sedimento celulares.
- Durante el paso 1.11, recuperar el tubo de 50 mL que contiene los 10 mL restantes de paso 1.7. Después de la centrifugación, Resuspender el precipitado de células en el DFHGPS de 10 mL y centrifugar nuevamente a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Durante el centrifugado final, preparar el nuevo medio de crecimiento siguiente tabla 1 agregar factores de crecimiento a los 10 mL de medio DFHGPS de paso 1.4 (cuadro 1) en el BSC. Deje el nuevo medio que contiene factores de crecimiento en el BSC hasta que esté listo para usar.
- Recuperar el frasco T75 de paso 1.2 y deseche el medio condicionado capa el frasco de aspiración. Luego agregar lo 5 mL de medio condicionado de paso 1.6. en el matraz con una pipeta serológica. Tenga cuidado de no rayar el fondo del matraz.
- Recuperar el tubo de células de la centrifugadora y descarte el sobrenadante por aspiración, dejando el precipitado de células intactas.
- Resuspender el precipitado de células en 10 mL de los nuevos medios de paso 1.13 utilizando una pipeta serológica de 5 mL y pipetear arriba y abajo varias veces. Añadir la suspensión al matraz T75 revestido de paso 1.14. Utilice lo restantes 5 mL para enjuagar el tubo que contiene el precipitado de células y luego añadir los 5 mL en el matraz, así.
- Roca el matraz T75 ida y vuelta 3 veces para asegurar que las células se distribuyen uniformemente en el matraz. Asegúrese de que la tapa del frasco es floja para permitir el flujo de aire. Bajo un microscopio de luz observar las células, tomar notas y tomar imágenes si es posible.
Nota: Las células sería transparente y esférica. Hacer una nota si hay células ese look oscuro, opaco, o tiene bordes asimétricos como éste puede indicar muerte celular. También ten cuidado cualquier contaminación bacteriana o fúngica, tales como los medios de comunicación convertirse en color amarillo. - Coloque el frasco de las células en una incubadora de 37 ° C con 8.5% CO2.
Nota: Utilice 8,5% en lugar de 5.0% CO2 para mantener el pH de este medio de cultivo libre de suero en el rango de 7.1-7.4.
2. hNSC cambio medio
Nota: Cambiar el medio cada 3-4 días.
- Encienda el BSC y limpiar con etanol al 70%. Observar las células bajo un microscopio de luz.
Nota: Hacer notas sobre el aspecto de las células y los tamaños de la esfera. Tres días después de la recuperación o el paso, las células se agrupan y comienzan a formar neuroesferas no adherente.
PRECAUCIÓN: Si las células se adhieren a la parte inferior del frasco, la cultura tendrá que descartarse como adherencia de la célula aumentará la diferenciación y células será incapaces de mantener un estado de la madre. Si hay demasiadas células en el frasco, las células pueden formar grandes esferas (mayores de 2 mm de diámetro) en cuyo caso, las células en el centro de la esfera comenzará a distinguir debido a la falta de acceso a los factores de crecimiento en el medio. Si se observan esferas más grandes que 1 mm de diámetro, las células pueden ser los (pasos 3.1-3.22). - Siga los pasos 1.4 y 1.5 y preparar 10 mL de medio fresco (ver paso 1.13).
- Inclinar el matraz a un lado, permitiendo que las esferas a hundirse hasta el fondo del matraz.
- Extraiga 5 mL de medio condicionado de la parte superior del medio agrupado utilizando una pipeta serológica de 5 mL, teniendo cuidado de no para aspirar ningún neuroesferas. Coloque 5 mL de medio condicionado en un tubo limpio 15 mL.
- Quitar un adicional 5 mL de medio condicionado del frasco, evitando otra vez las esferas y coloque 5 mL en el mismo tubo de 15mL.
- Añadir 10 mL de los nuevos medios de paso 2.2 a los 5 mL restantes de medios condicionados y las células en el frasco. Coloque el frasco de abajo plana y observar las células bajo un microscopio de luz.
- Si parece que las células han sido aspiradas durante la recogida de medio condicionado, girar el medio condicionado a 100 x g por 5 min a temperatura ambiente. Resuspenda las células que se acumulan en la parte inferior en 1 mL de medio condicionado y añádelos a continuación al matraz de cultivo.
- Almacenar los 10 mL de sin usar medios condicionados de pasos 2.5/2.6 a 4 ° c en un tubo de tapón de rosca de 15 mL.
- Repita los pasos 1.17/1.18.
3. hNSC paso
Nota: hNSCs debe ser paso cada días 9-11 si las células crecen normalmente, como tiempo de duplicación de la población es aproximadamente de 3 días13.
- Si ampliar el NSC en un frasco nuevo, asegúrese de que están cubiertos todos los matraces nuevos como en el paso 1.2.
- Limpiar el BSC como en el paso 2.1 y llevar a cabo pasos 1.4 y 1.5.
- Preparar el medio como en el paso 1.13. Cada frasco de T75 requiere 10 mL de medio. Para múltiples frascos T75, multiplicar 10 mL de medio por número de frascos.
- Preparar 1 o 3 mL de solución salina con tampón fosfato (dPBS) de Dulbecco y glucosa y lugar en un baño de agua de 37 ° C para calentar durante 10 minutos (para la solución de tripsina) según los volúmenes en la tabla 2. No agregue tripsina o DNasa en este momento. DNasa se requiera romper cualquier ADN de las células muertas debido a la disociación mecánica o química de la célula.
Nota: Para un frasco de T75 pasado después de 9-10 días de crecimiento habrá aproximadamente 30 × 106 células, si 5 × 106 fueron originalmente sembradas en el matraz. Normalmente, se utiliza 1 mL de solución de dPBS de 10 × 106 células. Por lo tanto, 3 mL de dPBS solución se necesita para un matraz T75 pasado después de 9-10 días. - Lugar limpio pequeño peso barco y hemocitómetro en campana. Limpiar con etanol al 70% y deje secar en campana durante aproximadamente 5 minutos al aire.
Nota: Se utilizará el barco pesa en pasos 3.17.1. - Recuperar el frasco de las células que serán pasados de la incubadora y traer en el BSC. Incline el matraz suavemente permitiendo que hunda hasta el fondo de los medios de comunicación de las células. Hay aproximadamente 15 mL de medio en el matraz.
- Saque unos 10 mL de medio en porciones de 5 mL (es decir, 5 mL + 5 mL). Coloque este 10 mL de medio en un tubo limpio 15 mL con la etiqueta "CM" para "medio condicionado". Tenga cuidado de no aspirar a cualquiera de las células en los 5 mL restantes de los medios en el frasco; Estas células y 5 mL de medio se someterán al paso 3.8.
- Tomar 3 mL de medio condicionado del tubo "CM" (de paso 3.7) y colocar en un tubo de 15 mL con la etiqueta "solución de inhibidor de tripsina". Esto se utilizará en el paso 3.12. Después del retiro de los 3 mL, hay 7 mL de izquierda de la media condicionada en el tubo de "CM". Apartar el tubo de "CM" hasta el paso 3.9.
- Quite los 5 mL de medios de comunicación y las células restantes en el frasco T75 y coloque en un tubo limpio 15 mL etiquetado como "Células".
- Tome el tubo de "CM" que contiene 7 mL de medio condicionado (del paso 3.7.1) y enjuague el fondo del matraz T75 dos veces con porciones de 3,5 mL de medios condicionados, mediante una pipeta serológica de 5 mL. Después de cada enjuague, coloque las porciones de 3.5 mL en el tubo de "Células". El propósito de este paso es eliminar todos neuroesferas (células) del frasco T75.
- Centrifugar el tubo de "Células" a 100 x g por 5 min a temperatura ambiente. Mientras que las células están girando, obtener glucosa dPBS solución del baño de agua de 37 ° C y añadir la cantidad apropiada de la tripsina y la ADNasa según tabla 2.
- Después de que el tubo de "Células" ha dejado de girar, quite el medio condicionado sobrenadante y transferir al tubo de "CM".
- Tome el tubo con la etiqueta "solución de inhibidor de tripsina" de paso 3.7.1. y el volumen de inhibidor de la tripsina indicado en la tabla 3. Utilizar el mismo volumen de solución de inhibidor de la tripsina como fue utilizado para la solución de tripsina.
- Colocar solución de inhibidor de tripsina en el baño de agua de 37 ° C hasta que se necesite.
- Agregar solución de tripsina al precipitado de células en el tubo de 15 mL y la pipeta hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 5 - 10 veces con una pipeta de 5 mL. Cierre la tapa del tubo e incubar en un baño de agua de 37 ° C por 5 min. Después de 5 minutos, recuperar las células y pipetear arriba y abajo 5 - 10 veces. Luego incubar en el baño de agua de 37 ° C para un adicional de 10-15 minutos.
- En los últimos 5 minutos, hacia la solución de inhibidor de tripsina del BSC.
- Recuperar las células después de paso 2.14 y pipetear las células hacia arriba y hacia abajo hasta que las esferas son completamente disociadas (20 - 30 veces). Inmediatamente añada la solución de inhibidor de la tripsina y la pipeta hacia arriba y abajo 10 veces. Esta solución de células disociadas e inhibidor de la tripsina se denominará la "suspensión de la célula".
- Contar el número de células en la suspensión celular siguiendo los pasos.
- Pipetear 15 μl de azul de tripano pre mezcla (contiene 5 μl de tripano 0.4% azules y 10 μl de dPBS) en un barco de pequeño peso y luego añadir 5 μl de la suspensión de células. Pipetee hacia arriba y hacia abajo 3 - 5 veces para mezclar. Entonces, Pipetear 10 μl de la suspensión celular Azul Trypan en ambos lados de un hemocitómetro cubierto con un cubreobjetos de vidrio.
- Observar las células bajo un microscopio de luz y contar el número total de células en cada una de las redes de cuatro esquinas. Sumar estos números.
- Repita el conteo para el otro lado y promedio de los dos lados juntos.
- Multiplique a este número por 10.000 para dar el número total de células por mL. Multiplique a este número por el número total de mililitros para calcular el número total de células en la suspensión de células. Calcular cuánto volumen de suspensión celular será necesario sembrar 5 millones de células por frasco T75.
Nota: Normalmente, después de 9-10 días, una T75 tendrá 25-30 x 106 células. Por lo tanto, si pases todas las células en frascos nuevos, es necesario un total de 5 a 6 frascos. - Añadir el volumen de suspensión celular calculado en el paso 3.19 a cada matraz T75 para obtener 5 x 106células cada frasco. Si el volumen es menor de 5 mL, añada medio condición adicional para un total de 5 mL. Luego añadir 10 mL de nueva DFHGFPS los medios de comunicación que contiene factores de crecimiento (tabla 1) en el matraz.
- Repita pasos 1.17 y 1.18 y verifique que el frasco se etiqueta con el tipo de células, las fechas, el número de células en el frasco y el número de paso (esto es el número de veces que la célula ha sido pasada). Luego mueva a pasos 4-9.
- Si las células extra necesaria, semilla en un frasco T75 la densidad a 30 x 106células cada frasco durante la noche y congele al día siguiente según el paso 4.
4. hNSC congelación y almacenamiento
- El día después de pases, recuperar el frasco de la incubadora que contiene las células por congelación (de paso 3.19 y 3.22). Inclinar el frasco y quitar todos los medio y las células del lugar en un tubo de 15 mL y frasco. Luego centrifugar el tubo a 216 x g durante 5 minutos.
- Durante el proceso de centrifugación, preparar medio de congelación (tabla 4). Por cada 5 × 106 células preparan 1 mL de medio de congelación. El número de células se determinó en el paso 3.19 determinar cuántas células poner en cada frasco. Este número no cambiará durante la noche.
- Preparar los frascos de cryo-preservar con etiquetas de nombre de la célula, paso, número de celular, iniciales y fecha. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el pellet celular en medio de la congelación por lo que hay 5 x 106 células/mL. Utilizando una pipeta de 5 mL, de alícuota 1 mL por frasco y cierre firmemente (5 x 106 células por vial).
- Coloque los frascos en un recipiente de cryo-preservar con 250 mL de isopropanol (uso máximo de 5 veces por reemplazo de isopropanol). Conservar en congelador de-80 ° C durante la noche y luego se transfieren a un sistema de almacenamiento de información de tanque de nitrógeno líquido.
5. galjanoplastia hNSC adherente para la validación
- El día antes de pases (pasos 3.1-3.22), limpie el BSC como en el paso 2.2 y obtener una placa de 24 pozos y 12 mm cubreobjetos de vidrio estéril.
- Utilizando pinzas, coloque un cubreobjetos solo en la parte inferior de cada pocillo de la placa.
- Cubrir los pocillos que contienen cubreobjetos con 0.01% poly-D-lisina (PDL) en agua estéril e incubar 1 h a 37 ° c. Para una placa de 24 pocillos, use 250 μL de PDL por pozo.
- Retire de la PDL de los pozos y luego cubrir con 1 μg/cm2 laminina/dPBS (250 μL por pozo). Incube la placa durante la noche a 37 ° C. Si no necesita al día siguiente, sellar la placa con parafilm envolviendo el parafilm alrededor de los bordes de la placa y almacenar a 4 ° C.
Nota: Las placas recubiertas con laminina pueden ser almacenadas 2 semanas si sellado con parafilm como cubreobjetos no seque. - Células de paso como se describen en pasos 3.1-3.22 y luego determinan el número de células a las semillas en la placa de 24 pocillos con cubreobjetos recubierto.
- Vaciar exceso laminin de pozos mediante aspiración y enjuague una vez con 0,5 mL de dPBS. La semilla entonces las células en los pozos a una densidad de 0.6-1 x 105 células/cm2 por pocillo. Utilice cualquier célula remanente según pasos 3.16 3.21.
- Atvarious veces durante el cultivo de la placa de 24 pozos, fijar y teñir las células para diversos marcadores de células madre tras paso 9.
6. cebado para obtener neuronas GABA y glutamato
- Paso de las células como se describe en 3.1-3.22 y luego determinar el número de células a las semillas en una placa de 24 pocillos como en el paso 5.6.
- Preparan el día antes de cebado, el cubreobjetos y la placa de la capa como se describe en los pasos 5.1-5.4.
- Día de cebado, recuperar los matraces que contienen células de 2-3 días. Coloque en un tubo de 15 mL y sedimenten las células por centrifugación a 100 x g durante 5 minutos.
- Preparar el medio de cebado de leucemia factor de crecimiento epidérmico factor inhibitorio/laminina (ELL) según la tabla 5.
- Resuspender las células con medio de ELL.
- Semilla suspende las células en una placa de 24 pocillos (siga el paso 5.6).
7. cebado para obtener las neuronas motoras
- Siga los pasos 6.1-6.4.
- Preparar el medio básico del fibroblasto factor de crecimiento/heparina/laminina (FHL) cebado según tabla 6.
- Siga el paso 5.6.
8. infección por el Virus Zika
Nota: ZIKV es altamente sensible a la temperatura, por lo que es imperativo stock ZIKV almacenados a - 80 ° C y congelación/descongelación ciclos se evitan. Seguir trabajando alícuotas en el hielo.
- Células de paso como se describe en los pasos 3.1-3.22. 3 millones de células en total se necesitan sembrar una placa de 24 pozos, por lo tanto cuando pases, poner el número de células necesarias para la infección y la siembra en un matraz cuando pases.
- Si siembra de células en una placa de 24 pocillos para tinción, preparar el cubreobjetos y la placa según pasos 5.1-5.4.
- Después de pases, coloque 1 mL de la suspensión celular de paso 8.2 a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos. Quite el sobrenadante por aspiración.
- Resuspender el precipitado del paso 8.3 en stock ZIKV adquirir una multiplicidad de infección (MOI) de cualquiera de los dos 1 a 10. El volumen de solución ZIKV no debe exceder 0,5 mL. Para el tratamiento de simulacro (células de control), resuspender las células en el mismo volumen y tipo de medio utilizado en la acción ZIKV.
Nota: Infección y preparación stock ZIKV son detallados en una anterior publicación11. También se realizan simulacros infecciones con medio. - Incubar por encima una mezcla de células/ZIKV a 37 ° C por 1 h. Invierta el tubo de 2 - 3 veces y luego Centrifugue la mezcla durante 5 minutos a 216 x g a temperatura ambiente para obtener un precipitado de células. Resuspender el precipitado en dPBS y centrifugar nuevamente por 5min a 216 x g a temperatura ambiente.
- Eliminar el sobrenadante por aspiración, resuspender las células con el medio apropiado y cargar las células infectadas en frasco o placa para el experimento. Si siembra las células en una placa de 24 pocillos Resuspender el precipitado en 12 mL de medio apropiado y luego añadir 500 μL de la suspensión a cada pocillo.
Nota: en este momento mantener las células en medios de crecimiento para observar efectos de ZIKV sobre células madre, o ir a pasos 6 o 7 para estudiar el efecto de ZIKV en el proceso de diferenciación.
9. procedimiento de tinción
- Para fijar las células, eliminar medio, enjuague una vez con 0.5 mL por pozo (placa de 24 pocillos) de solución salina hielo frío con tampón fosfato (PBS).
- Quitar PBS y cubre las células con 0,5 mL de paraformaldehído al 4% en PBS y dejar a temperatura ambiente durante 20-30 min.
- Quite el paraformaldehido y enjuague las células tres veces con 0,5 mL de PBS, dejando el tercer enjuague de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- En este punto deja el PBS en una noche y guardar la placa a 4 ° c o comenzar la coloración después del enjuague de 10 minutos.
- Después del enjuague de PBS de 10 min, bloquean las células durante 45-60 minutos en una posición fija con una solución de 0.5 mL de 5% de suero normal de cabra (NGS), 0.3% albúmina de suero bovino (BSA), 0.25% Tritón X-100 en solución salina tamponada con Tris (TBS). Por ejemplo, para hacer 1 mL de solución uso de bloqueo: 10 μl de 25% Tritón X-100, 50 μl del 100% NGS y 100 μl de BSA 3% mezclan en 840 μl de TBS.
- Durante la etapa de bloqueo, preparar la solución de anticuerpo primario, asegurándose de que todos los reactivos se mantienen en hielo. Para validar hNSCs, proteínas como la Nestin pueden orientarse utilizando el anticuerpo apropiado contra ellos. Para validar la infección ZIKV, usar un anticuerpo contra ZIKV capa proteína11. Para la diferenciación, utilizar marcadores como clase III β-tubulina para identificar poblaciones neuronales, mientras que la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) puede utilizarse para identificar astrocitos. Las concentraciones de anticuerpos primarios se determinan empíricamente dependiendo del proveedor y lote. Hemos utilizado la mayoría anticuerpos de 1: 100 a dilución 1: 2000.
- Centrifugue el anticuerpo primario a 12.000 x g durante 2 min a 4 ° C y luego hacer la dilución; por ejemplo, para hacer una dilución 1: 1000 del anticuerpo, añadir 7.2 μl del anticuerpo deseado en 7,2 mL de 0.25% Tritón X-100 en TBS.
- Añadir aproximadamente 300 μL de solución de anticuerpo a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar las células con el anticuerpo primario en una posición estacionaria durante 2 h a temperatura ambiente o a 4 ° c durante la noche en una posición fija.
- Después de la incubación, lavar las células con 0,5 mL de TBS tres veces a temperatura ambiente durante 10 min en posición estacionaria.
- Centrifugue el anticuerpo secundario a 12.000 x g durante 2 min a 4 ° C, luego diluir en solución de Triton X-100/TBS de 0.25%. Hacer suficiente solución de anticuerpo para añadir 300 μl a cada pocillo. Aquí, diluir el fluorescente de anticuerpos secundaria 1: 500 (figura 3).
- Después de las TBS finales lavado, añadir 300 μL de la solución de anticuerpo secundario a cada pocillo e incubar en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente en posición estacionaria. Partir de este momento, todos los pasos deben ocurrir en un cuarto oscuro.
- Lavar las células 3 veces con TBS durante 10 min en posición estacionaria.
- Durante el último lavado de 10 minutos, diluir el marcador nuclear nuclear DAPI mancha a la concentración recomendada en TBS (típicamente 1:1,000 - 1:5, 000). Hacer suficiente solución para añadir 300 μl a cada pocillo.
- Después del último lavado, añadir 300 μL de solución de DAPI a cada pozo e incubar durante 5 min a temperatura ambiente en posición estacionaria. Luego lave una vez con 0,5 mL de TBS.
- Utilizar un medio de montaje anti-fade para fluorescencia y 1 gota (10-15 μl) por cubreobjetos que se colocará en la diapositiva. Cuidadosamente con unas pinzas quitar el cubreobjetos de los pozos de la placa de 24 pozos y coloque la superficie de la célula sobre la gota de medio de montaje de la diapositiva.
- Una vez que se colocan el cubreobjetos sobre el portaobjetos, coloque el portaobjetos en un plano soporte de diapositivas. Asegúrese de diapositivas de etiqueta va toda la información necesaria para identificar las células en esa diapositiva, luego cubrir el soporte con papel de aluminio para guardar diapositivas protegidos de la luz.
- Almacenar las diapositivas a 4 ° c y deje que el medio de montaje solidificar durante la noche. Al día siguiente, observar la diapositiva usando un microscopio epifluorescente con filtro UV-2E/C (340-380 nm), filtro de GFP HYQ BP (450-490 nm) o Texas Y-2E/C filtro rojo (540-580 nm), un aumento de X 20.
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Representative Results
HNSCs cultivadas en la fase proliferativa crecerá como neuroesferas no adherente (figura 1). Inmediatamente después paso hNSC, habrá muchas células individuales, que se agregan y empiezan a esferas de forma en los próximos días (figura 1A y 1B). Ámbitos saludables deben ser aproximadamente de 1 a 2 mm de diámetro 9-10 días después de un paso (figura 1). Esferas que crecen más grandes que 2 mm desarrollarán un centro oscuro y los factores de crecimiento en el medio no será capaces de llegar a las células en el centro de la esfera, que resulta en la diferenciación no deseada. Ámbitos saludables aparecerá translúcidos y mostrar la pseudo-cilios alrededor de los bordes de la esfera (figura 1).
Neuroesferas sobre una superficie adherente de la galjanoplastia para fines de tinción resultará en el crecimiento de las esferas adherentes (figura 2A). Estas esferas se tocan la superficie de la vasija de la cultura y tienen algunas proyecciones que se extiende sobre la superficie del vaso, manteniendo una esfera central (figura 2A). Cebado y diferenciando las células requieren las células para adherirse a un cubreobjetos en el fondo de una placa de cultivo celular, tal como una placa de 24 pocillos. Siguiendo los pasos de cebado apropiado y adición de medio de diferenciación, las células se extendió por toda la superficie de la vasija de la cultura y crecer como interconectado monocapa de células (figura 2B).
Para o bien confirmar la validez de la cultura hNSC o fenotipo de células diferenciadas, se puede utilizar immunohistochemistry fluorescente. Nestin es un filamento intermedio que se expresa comúnmente en NSCs y puede utilizarse para verificar hNSC cultura (Figura 3A). Para verificar la presencia de neuronas después de la diferenciación, clase III β-tubulina puede utilizarse generalmente para las neuronas de la etiqueta (figura 3B). Aunque el paso de cebado se utiliza para lograr un mayor porcentaje de las neuronas después de la diferenciación, aún habrá astrocitos en la cultura. Proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) puede utilizarse para astrocitos etiqueta para cuantificar qué porcentaje de las células diferenciadas se convirtió en astrocitos o neuronas.
Encontramos que la línea K048 del NSC fue infectada por cepas africanas y asiáticas de ZIKV detectados por tinción inmunofluorescente con un anticuerpo específico ZIKV. Las imágenes representativas se muestran en la figura 4. Infección falsa no provocan un cambio en la morfología hNSC o supervivencia (Figura 4A, 4C). ZIKV tiende a permanecer en la región periférica de un post de un día de la célula infectada una infección de 1 hora, pero la célula entera se llena en 3 a 7 días (Figura 4B4D, 4E). Perceptiblemente, con el mismo Ministerio del interior (0.1), una tasa estimada de 5% de infección en células K048 es substancialmente más baja que ésos divulgaron recientemente ZIKV infección tarifa (hasta un 80%) en piel-inducida humana NSCs7. Este estudio, reporte 80% de infectividad, utilizó el prototipo cepa Africana de ZIKV (MR766) que se puede han adaptado un fenotipo neurotrópico durante más de 140 pasajes en células de cerebro de ratón.
Figura 1: imágenes de campo claro de la cultura hNSC. (A-C) Representante de campo brillante imágenes con 10 aumentos de hNSC días cultura 1, 4 y 9 pases, respectivamente. Barras de escala: 60 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imágenes de campo claro de culturas adherentes. (A) imágenes de campo claro representante adoptadas 10 aumentos de cultura adherente hNSC, 7 días después de la galjanoplastia. (B) imágenes de campo claro representativas tomadas en 10 aumentos de adherente distinguen células después ELL cebado y 9 días de diferenciación. Barras de escala: 60 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: imágenes fluorescentes de culturas diferenciadas y hNSCs. (A) representantes fluorescentes imágenes con 20 aumentos de hNSCs adherente con marcador nuclear DAPI (azul) y marcador de la célula de vástago Nestin (rojo). Barra de escala: 60 μm (B) de imágenes fluorescentes representativas tomadas a 60 aumentos de células diferenciadas con marcador neural βIII-tubulina (verde), fabricante de astrositos GFAP (rojo) y marcador nuclear DAPI (azul). Barras de escala: 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: infección por ZIKV en humanos fetal derivado NSCs. NSC humano tampoco trataron simulado (A y C), inoculadas por 1 hora con una cepa del linaje africano de ZIKV en MOI de 0.1 (B y D), o con una cepa asiática de ZIKV recientemente aislado de mosquitos en México en 2016 (E). Tinción inmunofluorescente detecta etiquetado de anticuerpos ZIKV en NSCs en uno a siete días post inoculación (dpi 1 en B, dpi 7 en D y 3 dpi en E). Escala de barras de 10 μm en A, D y 5 μm en E. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medios DFHGPS para una T75 | 10 mL |
| TPP * | ΜL DE 173 |
| 200 mM L-Glutamin | 50 ΜL |
| 10 mg/mL insulina ** | 25 ΜL |
| factor de crecimiento epidérmico de 20 μg/mL | 10 ΜL |
| 20 μg/mL del factor de crecimiento básico del fibroblasto | 10 ΜL |
| factor de inhibidor de la leucemia de 10 μg/mL | 10 ΜL |
| 5 mg/mL de heparina | 10 ΜL |
| * La mezcla que contiene 100 μg/mL de transferrina, 100 μm putresine, progesterona nM 20 y selenito de sodio de 30 nM. La mezcla se hace de la acción concentrada y alícuotas son almacenadas a-80 ° C y preferablly utilizadas en la preparación de 6 semanas. Las poblaciones concentradas son transferrina 10 mg/mL, 30 mM putrescina, progesterona μm 10 y selenito de sodio μm 15 almacenados a-80 ° c. | |
| ** Insulina se disuelve en 0.01 N hydroen cloruro, filtrado por 0,2 μm baja proteína vinculante filtro y almacenados a 4 ° c hasta 6 semanas. | |
Tabla 1: factores de crecimiento para el nuevo medio de proliferación.
| dPBS * | 1 mLuna | 3 mLb |
| glucosa 10% | 60 ΜL | 180 ΜL |
| 2.5% tripsina | 10 ΜL | 30 ΜL |
| DNasa ** | 5 ΜL | 15 ΜL |
| * Solución tampón fosfato salina de Dulbecco | ||
| ** Desoxirribonucleasa | ||
| una de 10 millones de células | ||
| b para 30 millones de células | ||
Tabla 2: Preparación de la tripsina.
| Medios condicionados | 1 mLuna | 3 mLb |
| Inhibidor de la tripsina | 10 ΜL | 30 ΜL |
| una de 10 millones de células | ||
| b para 30 millones de células |
Tabla 3: Preparación de inhibidor de la tripsina.
| DFHGPS * | 0,7 mLuna | 2.1 mLb |
| FBS ** 20% | 0,2 mL | 0,6 mL |
| DMSO *** 10% | 0,1 mL | 0.3 mL |
| * DMEM, F12, HEPES, glucosa, penicilina-estreptomicina | ||
| ** Suero bovino fetal | ||
| Sulfóxido de dimetilo | ||
| una para 5 millones de células en un frasco | ||
| b para tres frascos, 5 millones de células/vial | ||
Tabla 4: preparación del medio de congelación de.
| DFGHPS * para un pozo en una placa de 24 pocillos | 1 mL |
| TPP ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM L-glutamina | 5 ΜL |
| 10 mg/mL insulina | 2,5 ΜL |
| factor de crecimiento epidérmico de 20 μg/mL | 1 ΜL |
| factor inhibidor de leucemia de 10 μg/mL | 1 ΜL |
| 1 mg/mL laminina | 1 ΜL |
| * Que contenga DMEM, F12, HEPES, glucosa, penicilina-estreptomicina | |
| ** Que contiene 100 μg/mL de transferrina, 100 μm putresine, | |
| 20 nM progesterona y selenito de sodio de 30 nM | |
Tabla 5: Preparación del medio de cebado de ELL.
| DFGHPS * para un pozo en una placa de 24 pocillos | 1 mL |
| TPP ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM L-glutamina | 5 ΜL |
| 10 mg/mL insulina | 2,5 ΜL |
| 20 μg/mL del factor de crecimiento básico del fibroblasto | 0.5 ΜL |
| 5 mg/mL de heparina | 0.5 ΜL |
| 1 mg/mL laminina | 1 ΜL |
| * Que contenga DMEM, F12, HEPES, glucosa, penicilina-estreptomicina | |
| ** Que contiene 100 μg/mL de transferrina, 100 μm putresine, | |
| 20 nM progesterona y selenito de sodio de 30 nM | |
Tabla 6: Preparación del medio de cebado de FHL.
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Discussion
La capacidad de la cultura y manipular hNSCs proporciona una herramienta fundamental que puede ser utilizada para una variedad de propósitos de modelar enfermedades humanas a10,11,12,14, de detección de drogas de alto rendimiento 15,16,17. Muchas preguntas seguían siendo para abordarse como cerebro fetal humano cómo NSC o su progenie es susceptible a ZIKV infección, si diferentes cepas de ZIKV infectan NSCs con igual eficacia, y cómo la infección durante el desarrollo neural produce microcefalia. Hemos utilizado esta cultura hNSC investigar Zika virus asociados neuropatología11,14. Mediante el uso de tres cepas de células aisladas de tres donantes individuales, también somos capaces de comparar las diferencias individuales de susceptibilidad a los déficits neurológicos observados siguientes ZIKV infección11. Una de las limitaciones de esta técnica es la accesibilidad a hNSC muestras y el medio condicionado esencial para el correcto cultivo. Para sortear esta barrera, por favor póngase en contacto con el autor para hacer a una transferencia de material como las células utilizadas en el presente Protocolo no están comercialmente disponibles.
Estudios in vitro usando hNSCs no sólo proporcionan una visión única sobre el comportamiento de células básicas, también proporcionan una excelente plataforma para llevar a cabo investigación preclínica. Sin embargo, los retos técnicos de cultivo hNSCs pueden servir como un obstáculo en la utilización como modelos eficaces y reproducibles. En este protocolo, hemos perfilado los pasos claves y metodologías que pueden utilizarse para reducir la variabilidad en los métodos de cultivo y producción de una cultura de célula de vástago hNSC sano y estable. Una desventaja de usar hNSC desarrolló cultura es que las células son extremadamente sensibles a cualquier estímulo. Incluso con el protocolo detallado anteriormente, es fundamental que preste atención a cuánto se manejan los frascos o platos de hNSCs, como las más sutiles variaciones en el protocolo pueden resultar en cambios en el comportamiento de desarrolló.
La parte más crucial de este papel de métodos es el cóctel de factores de crecimiento y preparación de los diferentes medios de comunicación. Si el tiempo de duplicación de la cultura hNSC es muy bajo, o muchas células adherie a la nave de cultura (cuando debe ser no adherente), el primer paso es asegurar que los factores de crecimiento se utiliza la concentración adecuada y no caducado. Todos los factores de crecimiento en el presente Protocolo tienen una vida útil muy corto una vez descongelada (5-6 días). Además, hemos utilizado factores de crecimiento de múltiples empresas y notado diferencias en la calidad y la concentración necesaria para mantener la cultura. Por lo tanto, altamente recomendamos los factores de crecimiento exactos detallados en la Tabla de materiales. El paso passaging (pasos 3.1-3.22) es también una fuente común de error. Si hay muchas células muertas tras el proceso de disociación, reducir el número de veces de pipeteo arriba y abajo para disociar las células, como demasiada disociación física puede resultar en la muerte celular. Alternativamente, si hay muchos racimos de células siguiendo el paso de la disociación, aumentar el vigor o el número de veces de pipeteo arriba y abajo, como estos grupos que rápidamente se convierten en grandes esferas que no serán siendo viables en la cultura. Si la cultura se mantiene adecuadamente, la infección por ZIKV es relativamente sencilla.
Infección por ZIKV es el tratamiento detallado de este protocolo, es posible utilizar este sistema de cultivo hNSC para una amplia gama de estudios. Este sistema modelo puede utilizarse medicamentos, examinar la susceptibilidad individual, y investigar mecanismos subyacentes de una variedad de enfermedades y trastornos del desarrollo14. Este sistema también es ideal para estudios de genómica, puesto que las células cultivadas no han sido manipuladas genéticamente y mostrar poco a ningunas anormalidades cromosómicas, pasajes hasta 8010,11. Creemos que este sistema de cultivo es ideal para el modelado en vitro como estímulos ambientales tales como infección, drogas, alcohol, toxinas, etc. puede influyan en el desarrollo del sistema nervioso.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los fondos de la John S. Dunn Foundation y el Instituto de infecciones humanas y de la inmunidad de la rama médica de la Universidad de Texas (P.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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