Summary
Este artigo detalha os métodos que são usados para expandir as células-tronco neurais cérebro fetal humano na cultura, bem como diferenciá-los em vários subtipos neuronais e astrócitos, com ênfase na utilização de células-tronco neurais para estudar a infecção pelo vírus Zika.
Abstract
Células-tronco neurais cérebro fetal humano são um sistema único modelo não-geneticamente modificados para estudar o impacto de vários estímulos na neurobiologia do desenvolvimento humano. Prefiro a usar um modelo animal ou células pluripotentes induzidas geneticamente modificados, células-tronco neurais humanas fornecer um sistema eficaz em vitro para examinar os efeitos dos tratamentos, drogas de tela, ou examinar as diferenças individuais. Aqui, nós fornecemos os protocolos detalhados para os métodos utilizados para expandir as células-tronco neurais cérebro fetal humano na cultura com media serum-free, para diferenciá-los em vários subtipos neuronais e astrócitos através de procedimentos diferentes de escorva, para congelar e recuperar Estas células. Além disso, descrevemos um procedimento de usando células-tronco neurais cérebro fetal humano para estudar a infecção pelo vírus Zika.
Introduction
Vírus Zika (ZIKV) é um flavivirus transmitido sexualmente ou por mosquitos vetores Aedes aegypti e Aedes albopictus mosquitos. ZIKV foi recentemente identificada como uma ameaça grave de saúde pública devido à sua facilidade de transmissão e sintomas neurológicos1de afiliados. Um dos mais relativas aos efeitos neurológicos é o desenvolvimento de microcefalia em fetos nascidos de mães grávidas infectadas2,3. A microcefalia é um distúrbio neurológico, onde a cabeça é menor do que o tamanho típico durante o desenvolvimento fetal e ao nascimento, com a circunferência menor que 2 desvios-padrão abaixo da média4. A menor circunferência da cabeça é geralmente acompanhada por uma variedade de comorbidades tais como atrasos no desenvolvimento, convulsões, visão e perda de audição e dificuldade de alimentação.
Estudos recentes têm utilizado modelos animais ou induzida por células-tronco pluripotentes para estudar o efeito da infecção ZIKV em neurodesenvolvimento5,6,7,8. Enquanto estes estudos têm contribuído para o nosso conhecimento de ZIKV, o uso de diferentes espécies ou células geneticamente modificadas podem ser demorado e/ou adicionar variáveis adicionais que podem confundir o efeito da ZIKV no desenvolvimento neural células5, 6 , 7 , 8. no entanto, a dificuldade com a cultura do hNSC, particularmente a cultura de não-aderente neurosphere descrita neste protocolo, é que a cultura é muito sensível aos métodos utilizados para realizar a cultura9. Qualquer alteração em componentes médios, ou mesmo a manipulação física do navio cultura, é suficiente para provocar uma reação de9células. Para solucionar esses problemas, nós desenvolvemos uma cultura humana fetal derivado do cérebro neural células-tronco (hNSCs) em vitro para interrogar mecanicamente o efeito da ZIKV em células-tronco neurais fetais. Usando nosso método, hNSCs foram mantidos por mais de 80 passagens sem alterações fenotípicas aparente10. Além disso, alterações cromossômicas, como trissomia eram um none ou mínimo11. Esta cultura hNSC cresce como uma cultura de não-aderente neurosphere. Uma vantagem do neurospheres é que as esferas criam um nicho ambiental na cultura que é mais reflexiva de nichos na vivo em comparação com as culturas bidimensional9. Outra vantagem deste protocolo é que vários tipos de células podem ser derivados da cultura hNSC, permitindo que um investigador observar o impacto de uma determinada variável na sobrevivência do hNSC e diferenciação. Este protocolo é aplicável a indivíduos que olham para responder perguntas mecanicistas sobre o desenvolvimento do sistema nervoso central ou disfunção. O protocolo seguinte descreve como expandir uma cultura hNSC para infectar com ZIKV e posteriormente, diferenciar o hNSCs para observar o impacto da infecção sobre o processo de diferenciação. Ele também inclui métodos para armazenar hNSCs para o uso a longo prazo e hNSCs se diferenciar em vários tipos de neurônios que permitam a investigação dos défices induzida por ZIKV contribuindo para de malformação do cérebro11. Acreditamos que este protocolo também é de interesse para os investigadores procuram entender o impacto de qualquer estímulo ambiental, tais como infecção ou toxinas na sobrevivência de células-tronco neurais e diferenciação.
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Protocol
Células-tronco neurais humanas foram originalmente derivadas descartados humanas corticais fetais no primeiro trimestre12. Todos os procedimentos de protocolo seguem as diretrizes de ética do University of Texas Medical Branch relativas à utilização de amostras de tecido humano, e as linhas de célula foram aprovadas pelo Comitê de biossegurança institucional.
1. estoque recuperação média de preparação e células-tronco
- Prepare o estoque de meio de cultura (DFHGPS), combinando os reagentes em etapas 1.1.1.-1.1.5.
- Adicione 210 mL de meio Eagle modificado de Dulbecco com a glicose alta e L-glutamina (D). Armazená-lo no 4 ˚ c.
- Adicione 70 mL da mistura de nutrientes F12 do Ham com suplemento de L-glutamina (F). Armazená-lo no 4 ˚ c.
- Adicione 4,2 mL de 15mm tampão HEPES (H) e armazená-lo em temperatura ambiente.
- Adicione 4,2 mL de 10% solução de D-glicose (G) e armazená-lo em temperatura ambiente.
- Adicionar 2,88 mL da solução de penicilina/estreptomicina (PS)... Alíquota da solução estoque em alíquotas de 3 mL e armazenar as alíquotas a-20 ° C até ser necessário.
Nota: A concentração final de penicilina no meio será de 100 unidades/mL, e a concentração de estreptomicina será 100 µ g/mL. Este meio será referido como DFHGPS para o restante do protocolo e deve ser armazenado a 4 ° C, para uso dentro de 1-2 semanas. Se necessário, DFHGPS podem ser ampliados proporcionalmente.
- O dia antes que as células são recuperadas, revestir um balão T75 com 5 mL de meio condicionado, obtidos de culturas anteriores da linha celular hNSC e deixar em uma incubadora de 37 ° C, com 8,5% de dióxido de carbono (CO2) durante a noite.
Nota: Se actualmente cultivo hNSCs, salve o meio que as células têm crescido em durante uma mudança de média. Isso é meio condicionado como ele tem sido "condicionado" pelas células. Médio condicionado pode ser salvos em um tubo de tampa de rosca e armazenado a 4 ° C por aproximadamente 7 dias. Contate o autor correspondente para receber hNSCs. Meio condicionado é preferencial mas não absolutamente necessário, particularmente quando primeiro começando a cultura de hNSCs. - O dia da recuperação, aqueça 20ml de DFHGPS em um tubo de tampa de rosca de 50 mL em um banho de água de 37 ° C durante pelo menos 10 minutos e mantê-lo em banho-maria até que esteja pronto para usar.
- Em um tubo de tampa de rosca 15ml separado, aquecer em banho-maria 37 ° C pelo menos 10 min de 10 mL de DFHGPS e mantê-lo em banho-maria até que esteja pronto para usar na etapa 1.13.
- Recupere um recipiente de gelo e todos os componentes de médias (tabela 1). Descongelar todos os componentes médios no gelo e deixá-los no gelo enquanto se prepara para a mudança de média.
- Obter 5 mL de condicionado estoque médio (armazenada a 4 ° C) e mantê-lo em banho maria a 37 ° C até que esteja pronto para usar na etapa 1.14. Consulte a observação após a etapa 1.2 se existe uma cultura condicionado médio ou corrente humana fetal neural células-tronco.
- Recuperar o tubo de 50 mL tampa de rosca de passo 1.3 e coloque dentro da armário de biossegurança (BSC). Transferir 10 mL de DFHGPS para um novo tubo de tampa de rosca 15 mL e em seguida, coloque o tubo de 50 mL contendo os restante 10 mL de meio DFHGPS de volta em banho-maria a 37 ° C.
- Obter um cryo-frasco de hNSCs armazenados em nitrogênio líquido. Consulte a observação após a etapa 1.2 se não há nenhuma cultura de células-tronco neurais fetal humana atual.
Nota: Células-tronco neurais humanas foram originalmente derivadas de cérebros fetais humanos descartados12 e mantidas em cultura sem modificações genéticas10. 5 × 106 células devem ser descongeladas e banhadas em um balão de T75. Cada frasco de cryo-deve conter 5 × 106 células; Portanto, carece de um frasco por frasco. - Descongelar um frasco de células em banho-maria a 37 ° C, invertendo o frasco cada 10 s por aproximadamente 1 min ou até que o gelo é derretido e o conteúdo do frasco é completamente líquido. Não mergulhe o frasco inteiro sob a água para evitar a contaminação potencial.
- No BSC, use uma micro P1000-pipeta para aspirar a solução da célula descongeladas e adicioná-lo drop-wise para o tubo de 15 mL da etapa 1.7, contendo 10 mL de DFHGPS. Para adicionar a solução de células descongeladas drop-wise, lentamente pressione o êmbolo para que apenas uma gota ou duas é liberada de uma só vez. Enquanto isso, agite o tubo de 15 mL para permitir uma mistura rápida.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante, certificando-se de manter o centrifugado.
- Durante a etapa de 1,11, recupere o tubo de 50 mL contendo os 10 mL restante da etapa 1.7. Após a centrifugação, resuspenda o pellet de célula no 10 mL DFHGPS e centrifugar novamente a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Durante a centrifugação final, prepare o novo meio de crescimento pela seguinte tabela 1 para adicionar fatores de crescimento para os 10 mL do meio DFHGPS da etapa 1.4 (tabela 1) no BSC. Deixe a nova mídia que contém fatores de crescimento no BSC até estar pronto para usar.
- Recuperar o balão T75 da etapa 1.2 e descarte o meio condicionado revestindo o balão por aspiração. Em seguida, adicione a 5 mL de mídia condicionadas da etapa 1.6. para o balão com uma pipeta sorológica. Tenha cuidado para não arranhar a parte inferior do frasco.
- Recuperar o tubo de células de centrífuga e descartar o sobrenadante por aspiração, deixando o centrifugado intacta.
- Resuspenda o pellet celular em 10 mL de novas mídias da etapa 1.13 usando uma pipeta sorológica 5ml e pipetagem subindo e descendo várias vezes. Adicione a suspensão no balão de T75 revestido da etapa 1.14. Use os restante 5 mL para lavar o tubo que continha o centrifugado e em seguida, adicionar esses 5 mL no balão também.
- Rock o balão T75 e volta 3 vezes para garantir que as células são distribuídas uniformemente entre o balão. Verifique se que a tampa do frasco é solta para permitir o fluxo de ar. Sob um microscópio de luz observar as células, fazer anotações e tirar fotos se possível.
Nota: As células devem ser translúcida e esférica. Faça uma nota se existem células que opaco escuro, de olhar, ou que tenham pensionistas assimétricas como isto pode indicar a morte celular. Assista também para qualquer contaminação bacteriana ou fúngica, como a mídia, tornando-se na cor amarela. - Coloque o frasco de células em uma incubadora de 37 ° C, com 8,5% de CO2.
Nota: Usar 8,5% em vez de 5.0% CO2 para manter o pH deste meios de cultura livre de soro na faixa de 7.1-7.4.
2. hNSC mudança média
Nota: Mudar o médio a cada 3-4 dias.
- Gire sobre o BSC e limpe cuidadosamente com etanol a 70%. Observe as células sob um microscópio de luz.
Nota: Faça anotações sobre a aparência das células e tamanhos de esfera. Três dias depois da recuperação ou passagem, células cluster juntos... e começam a formar neurospheres não-aderente.
Cuidado: Se células aderem ao fundo do balão, a cultura precisa ser descartada como aderência de célula aumentará diferenciação prematura e células será incapazes de manter um estado de tronco. Se houver muitas células no frasco, as células podem formar grandes esferas (mais de 2 mm de diâmetro), nesse caso, células no centro da esfera começará a diferenciar devido à falta de acesso a fatores de crescimento a médio. Se forem observadas as esferas maiores que 1 mm de diâmetro, células podem ser passados (passos 3.1-3.22). - Siga as etapas 1.4 e 1.5 e prepare-se 10 mL de meio fresco (consulte a etapa 1.13).
- Balão de inclinação para o lado, permitindo que as esferas afundar até o fundo do frasco.
- Remova 5 mL de mídia condicionadas da parte superior do meio em pool com uma pipeta sorológica 5ml, tomando cuidado para não aspirar qualquer neurospheres. Coloque os 5 mL de mídia acondicionados em um tubo limpo 15 mL.
- Retire o balão, novamente com cuidado, evitando as esferas, um adicional 5 mL de mídia condicionadas e coloque os 5 mL no mesmo tubo de 15mL.
- Adicione 10 mL de novas mídias da etapa 2.2 para os restante 5 mL de mídia condicionadas e células no frasco. Definir o balão no chão e observar células com um microscópio de luz.
- Se parece que as células têm sido aspiradas durante a coleta do meio condicionado, gire o meio condicionado a 100 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Ressuspender as células que se acumulam na parte inferior em 1 mL de meio condicionado e em seguida, adicioná-los para o frasco de cultura.
- Armazene a 10 mL de mídia condicionada não utilizadas da escadaria 2.5/2.6 no 4 ˚ c em um tubo de 15 mL tampa de rosca.
- Repita as etapas 1.17/1.18.
3. hNSC passagem
Nota: hNSCs deve ser a passagem todos os dias de 9-11 se células crescem normalmente, como tempo de duplicação da população é de aproximadamente 3 dias13.
- Se expandir os NSCs para um balão de novo, certifique-se de todos os novos frascos são revestidos como na etapa 1.2.
- Limpar o BSC como no passo 2.1 e realizar as etapas 1.4 e 1.5.
- Prepare o suporte como na etapa 1.13. Cada frasco de T75 requer 10 mL de meio. Para vários frascos de T75 multiplique 10 mL de mídia pelo número de frascos.
- Prepare 1 ou 3 mL de tampão fosfato salino (dPBS) de Dulbecco e glicose e lugar em um banho de água de 37 ° C para aquecer por 10 min. (para solução de tripsina) de acordo com os volumes na tabela 2. Não adicione tripsina ou DNase neste momento. DNase pode ser necessária para quebrar qualquer DNA libertado as células mortas devido à dissociação celular mecânicos ou químicos.
Nota: Para um balão de T75 passada após 9-10 dias de crescimento haverá cerca de 30 × 106 células, se 5 × 106 originalmente foram semeadas no frasco. Normalmente, 1 mL de solução de dPBS é usado para 10 × 106 células. Portanto, 3 mL de solução de dPBS é necessário para um balão de T75 passada após 9-10 dias. - Lugar limpo pequeno pesar o barco e hemocytometer na capa. Limpar com álcool etílico 70% e deixe secar na capa por aproximadamente 5 min.
Nota: O barco de pesagem será usado em etapas 3.17.1. - Recupere o balão de células que vão ser passadas da incubadora e trazer para o BSC. Incline o frasco suavemente, permitindo que as células afundar até o fundo da mídia em pool. Há cerca de 15 mL de mídia no frasco.
- Remova cerca de 10 mL de mídia em porções de 5 mL (ou seja, 5 mL + 5 mL). Coloque este 10ml de mídia em um tubo limpo 15ml rotulado "CM" para "meio condicionado". Tenha cuidado para não aspirar qualquer uma das células que se estabeleceu nos restante 5 mL de mídia no frasco; Estas células e 5 mL de mídia serão submetidos ao passo 3.8.
- Tomar 3 mL de mídia condicionada do tubo "CM" (da etapa 3.7) e coloque em um tubo de 15 mL rotulado "solução do inibidor de tripsina". Isso será usado na etapa 3.12. Após a remoção do mL 3, há 7 mL de mídia condicionado esquerda no tubo "CM". Reserve o tubo "CM" até passo 3.9.
- Retire a 5 mL de mídia e as células remanescentes no frasco T75 e coloque em um tubo limpo 15ml rotulado "Células".
- Pegue o tubo de "CM", contendo 7 mL de mídia condicionada (da etapa 3.7.1) e lave a parte inferior do frasco T75 duas vezes com porções de 3,5 mL de mídia condicionadas, usando uma pipeta sorológica 5ml. Depois de cada lavagem, coloque as porções de 3,5 mL para o tubo de "Células". A finalidade desta etapa é retirar o balão T75 todos neurospheres (células).
- Centrifugar o tubo de "Células" a 100 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Enquanto as células estão girando, obter a solução de dPBS/glicose do banho-maria a 37 ° C e adicionar a quantidade apropriada de tripsina e DNase de acordo com a tabela 2.
- Após o tubo de "Células" parou de girar, remover todo o meio condicionado sobrenadante e transferir para o tubo de "CM".
- Pegue o tubo rotulado "solução de inibidor de tripsina" da etapa 3.7.1. e adicionar o volume do inibidor de tripsina, indicada na tabela 3. Use o mesmo volume de solução de inibidor de tripsina, como foi usado para a solução de tripsina.
- Coloque a solução de inibidor de tripsina em banho de água a 37 ° C até ser necessário.
- Adicionar a solução de tripsina ao centrifugado no tubo de 15 mL e pipetar acima e para baixo aproximadamente 5 - 10 vezes com uma pipeta de 5 mL. Feche a tampa do tubo e incubar em banho-maria 37 ° C por 5 min. Depois de 5 min, recuperar as células e pipetar para cima e para baixo 5 - 10 vezes. Então incube em banho de água a 37 ° C por um adicional 10-15 min.
- Nos último 5 min, mova a solução do inibidor de tripsina para o BSC.
- Recuperar as células, após a conclusão da etapa 2.14 e pipetar as células acima e para baixo até que as esferas são completamente dissociadas (20 - 30 vezes). Em seguida, adicione imediatamente a solução do inibidor de tripsina e pipeta acima e para baixo 10 vezes. Esta solução de células dissociadas e inibidor de tripsina será referida como a "suspensão de células".
- Conte o número de células na suspensão de célula seguindo as etapas.
- Pipetar 15 µ l de pré-mistura de azul de Trypan (contendo 5 µ l de 0,4% Trypan azul e 10 µ l de dPBS) num barco pequeno pesar e em seguida, adicione 5 µ l da suspensão celular. Pipetar para cima e para baixo 3 - 5 vezes para misturar. Então, pipeta 10 µ l da suspensão Trypan azul/celular em ambos os lados de um hemocytometer coberto com uma lamela de vidro.
- Observar as células sob um microscópio de luz e conte o número total de células em cada um dos quatro canto grades. Adicione esses números juntos.
- Repita a contar para o outro lado e média os dois lados juntos.
- Multiplique esse número por 10.000 para dar o número total de células por mL. Multiplique esse número pelo número total de mililitros para calcular o número total de células na suspensão de célula. Calcule quanto volume de suspensão de células serão necessários para 5 milhões de células por T75 balão de sementes.
Nota: Normalmente, depois de 9-10 dias, um T75 terá 25-30 × 106 células. Portanto, se a passagem de todas as células em frascos novos, um total de 5-6 frascos é necessária. - Adicione o volume da suspensão de células calculada na etapa 3,19 cada balão de T75 para obter 5 × 106células por balão. Se o volume for inferior a 5 mL, adicione meio condição adicional para perfazer um total de 5 mL. Em seguida, adicione 10 mL de novo DFHGFPS mídia contendo fatores de crescimento (tabela 1) para o balão.
- Repita as etapas 1.17 e 1.18 e garantir que o frasco é rotulado com o tipo de células, as datas, o número de células no frasco e o número da passagem (este é o número de vezes que a célula tem sido passada). Em seguida, mova para as etapas 4-9.
- Se necessário, semente extra células em um frasco de T75 a densidade até 30 × 106células por balão durante a noite e congelar no dia seguinte de acordo com a etapa 4.
4. hNSC congelamento e armazenamento
- O dia depois da passagem, recupere o balão da incubadora que contém as células para congelamento (da etapa 3.19 e 3,22). Incline o frasco e remova todas as médias e as células da garrafa e coloque em um tubo de 15 mL. Centrifugar o tubo a 216 x g por 5 min.
- Durante o processo de centrifugação, prepare meio de congelação (tabela 4). Para cada 5 × 106 células Prepare-se 1 mL de meio de congelação. O número de células foi determinado na etapa 3.19 ao determinar quantas células para colocar em cada frasco. Este número não mudará durante a noite.
- Prepare cryo-preserve frascos com rótulos de célula de nome, número de passagem, número de telemóvel, iniciais e data. Após a centrifugação, remover o sobrenadante por aspiração e ressuspender o sedimento celular no meio de congelação que existem 5 × 106 células/mL. Utilizando uma pipeta de 5 mL, alíquota de 1 mL por frasco e selo firmemente (5 × 106 células por frasco).
- Colocar os frascos em um recipiente de crio-preservação com 250 mL de isopropanol (uso máximo de 5 vezes por substituição de isopropanol). Armazenar em freezer-80 ° C durante a noite e depois transferir para um sistema de armazenamento do tanque de nitrogênio líquido.
5. chapeamento hNSC aderente para validação
- No dia anterior passagem (etapas 3.1-3,22), limpar o BSC como no passo 2.2 e obter uma placa de 24 e as lamelas de 12 milímetros de vidro estéril.
- Usando a pinça, coloque uma lamela única no fundo de cada poço da placa.
- Revestimento dos poços contendo lamínulas com 0.01% poli-D-lisina (PDL) em água estéril e incubar durante 1 h a 37 ˚ c. Para uma placa de 24, use 250 μL de PDL por bem.
- Remover o PDL de poços e depois revestir com 1 µ g/cm2 laminina/dPBS (250 μL por poço). Incubar a placa durante a noite a 37 ° C. Se não for necessário no dia seguinte, selar a placa com parafilm encapsulando o parafilm em torno das bordas da placa e armazenar a 4 ° C.
Nota: Placas revestidas com laminina podem ser armazenadas 2 semanas se selado com parafilm enquanto lamínulas não seque. - As células de passagem como descrito nos passos 3.1-3.22 e em seguida, determinar o número de células a semente para a placa de 24 com lamelas revestidas.
- Remover qualquer excesso de laminina solução de poços através de aspiração e lave uma vez com 0,5 mL de dPBS. Então as sementes células nos poços em uma densidade de 0,6-1 x 105 células/cm2 por bem. Use as células restantes de acordo com passos 3.16-3.21.
- Atvarious vezes durante a cultura de placa 24, corrigir e mancha as células de vários marcadores de células-tronco, seguindo o passo 9.
6. preparação para obter neurônios GABA e glutamato
- Passagem das células conforme descrito em 3.1-3.22 e em seguida, determinar o número de células a semente em uma placa de 24 etapa 5.6.
- O dia antes de aprontar, prepare as lamínulas e casaco placa conforme descrito nas etapas 5.1-5.4.
- No dia de escorva, recupere os frascos contendo células de 2-3 dias. Pelota as células por centrifugação a 100 x g por 5 min e coloque em um tubo de 15 mL.
- Prepare o suporte de escorva de fator inibitório/laminina (ELL) de fator de crescimento epidérmico/leucemia de acordo com a tabela 5.
- Ressuspender as células com ELL médio.
- Semente suspendeu as células em uma placa de 24 (siga os passos 5.6).
7. a preparação para obter os neurônios motores
- Siga os passos 6.1-6.4.
- Prepare o meio de escorva (FHL) de laminina/heparina/fator de crescimento fibroblástico básico de acordo com a tabela 6.
- Siga o passo 5.6.
8. infecção pelo vírus Zika
Nota: ZIKV é altamente sensível à temperatura, portanto, é imperativo que o estoque ZIKV são armazenados no - 80 ° C e congelamento/descongelamento ciclos são evitados. Continue trabalhando alíquotas no gelo.
- Células de passagem como descrito nos passos 3.1-3.22. 3 milhões de células no total são necessários para semear uma placa de 24, portanto quando passagem, colocar o número de células necessárias para a infecção e propagação num balão, quando de passagem.
- Se a propagação de células em uma placa de 24 para coloração, prepare as lamelas e placa de acordo com passos 5.1-5.4.
- Após a passagem, coloque 1 mL de suspensão de células da etapa 8.2 em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e centrifugar a 200 x g, à temperatura ambiente por 5 min. Em seguida, retire o sobrenadante por aspiração.
- Resuspenda o pellet de passo 8.3 em estoque ZIKV para adquirir uma multiplicidade de infecção (MOI) de qualquer 1 a 10. O volume de solução ZIKV não deve exceder 0,5 mL. Para tratamento simulado (células de controle), Ressuspender as células no mesmo volume e tipo de meio utilizado em estoque ZIKV.
Nota: Infecção e preparação ZIKV são detalhados em um anterior publicação11. Simulado infecções também são realizadas com o meio. - Incube acima mistura de célula/ZIKV a 37 ° C por 1 h. inverta o tubo 2 - 3 vezes e então centrifugar mistura durante 5 min à x 216 g à temperatura ambiente para obter um centrifugado. Resuspenda o pellet em dPBS e centrifugar novamente por 5 min a 216 x g, à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante por aspiração, Ressuspender as células com o meio adequado e carregar células infectadas em balão ou placa necessária para o experimento. Se semeando as células em uma placa de 24 resuspenda o pellet em 12 mL de meio adequado e em seguida, adicione 500 μL da suspensão a cada poço.
Nota: neste ponto ou manter as células em meios de crescimento para observar os efeitos de ZIKV sobre células-tronco, ou ir para as etapas 6 ou 7 para estudar o efeito de ZIKV no processo de diferenciação.
9. o procedimento de coloração
- Para corrigir as células, remover médio, lave uma vez com 0,5 mL por poço (placa de 24) de gelo frio fosfato salino (PBS).
- Remover a PBS e cobrir as células com 0,5 mL de paraformaldeído 4% em PBS e deixar em temperatura ambiente por 20-30 min.
- Remova o paraformaldeído e enxágue células três vezes com 0,5 mL de PBS, deixando o terceiro enxágue de PBS na durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Neste momento deixar a PBS em uma noite e armazenar a placa no 4 ˚ c ou começar a coloração após o enxágue de 10 min.
- Após o enxágue 10min PBS, bloquear as células por 45-60 min em posição estacionária com uma solução de 0,5 mL de soro de cabra normal de 5% (NGS), 0,3% albumina de soro bovino (BSA), 0.25% Triton X-100 em salino Tris (TBS). Por exemplo, tornar-se 1 mL de bloquear o uso de solução: 10 µ l de 25% Triton X-100, 50 µ l de 100% NGS e 100 µ l de 3% BSA misturado em 840 µ l de TBS.
- Durante a etapa de bloqueio, prepare a solução de anticorpo primário, certificando-se de que todos os reagentes são mantidos no gelo. Para validar o hNSCs, as proteínas tais como Nestin podem ser direcionadas utilizando o anticorpo adequado contra eles. Para validar a infecção ZIKV, use um anticorpo contra ZIKV casaco proteína11. Para diferenciação, use marcadores como classe III β-tubulina para identificar populações neuronais, enquanto a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) pode ser usada para identificar os astrócitos. As concentrações de anticorpos primários são determinadas empiricamente dependendo do fornecedor e monte. Nós usamos a maioria dos anticorpos de 1: 100 para diluição de 1: 2000.
- Centrifugue o anticorpo primário a 12.000 x g por 2 min a 4 ° C e em seguida, fazer uma diluição; por exemplo, para fazer uma diluição de 1: 1000 de anticorpo, adicione 7,2 µ l do anticorpo desejado em 7,2 mL de 0,25% Triton X-100 na TBS.
- Adicionar aproximadamente 300 µ l de solução de anticorpo para cada poço de uma placa de 24 e incube as celulas com anticorpo primário em posição estacionária por 2h, à temperatura ambiente ou no 4 ˚ c durante a noite em uma posição estacionária.
- Após a incubação, lave as células com 0,5 mL de TBS três vezes à temperatura ambiente durante 10 minutos cada, em uma posição estacionária.
- Centrifugue o anticorpo secundário a 12.000 x g por 2 min a 4 ° C e, em seguida, diluir em solução de 0.25% Triton X-100/TBS. Fazer bastante solução de anticorpo para adicionar 300 µ l de cada poço. Aqui, dilua a 1: 500 fluorescente anticorpos secundários (Figura 3).
- Depois de lavar os finais TBS, adicione 300 µ l da solução de anticorpo secundário a cada poço e incubar no escuro por 1h à temperatura ambiente em uma posição estacionária. De agora em diante, todas as etapas devem ocorrem em um quarto escuro.
- Lave as células três vezes com TBS durante 10 minutos cada, em uma posição estacionária.
- Durante a última lavagem de 10 min, dilua o marcador nuclear nuclear DAPI mancha na concentração recomendada na TBS (tipicamente 1:1,000 - 1:5, 000). Faça bastante solução para adicionar 300 µ l de cada poço.
- Após a lavagem final, adicionar 300 µ l de solução DAPI a cada poço e incubar durante 5 min à temperatura ambiente em uma posição estacionária. Em seguida, lave uma vez com 0,5 mL de TBS.
- Use um meio de montagem antidesbotamento por fluorescência e 1 gota (10-15 µ l) por lamela que será colocada no slide. Cuidadosamente, use uma pinça para remover lamelas dos poços da placa 24 e coloque a superfície da célula para baixo sobre a queda média de montagem no slide.
- Uma vez que as lamelas são colocadas no slide, coloque o slide em um slide-suporte liso. Certifique-se de slides etiqueta será todas as informações relevantes necessárias para identificar as células que slide e, em seguida, cubra o titular com papel alumínio para manter os slides, protegidos da luz.
- Armazenar os slides no 4 ˚ c e permitir que o meio de montagem solidificar durante a noite. No dia seguinte, observe o slide usando um microscópio de epifluorescente com filtro UV-2E/C (340-380 nm), filtro de GFP HYQ BP (450-490 nm) ou Y/C-2E Texas filtro vermelho (540-580 nm), ampliação de 20 X.
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Representative Results
HNSCs cultivadas em fase proliferativa crescerá como neurospheres não-aderente (Figura 1). Imediatamente após a passagem do hNSC, haverá muitas células individuais, que irão agregar e começar a esferas de forma nos próximos dias (figura 1A e 1B). As esferas saudáveis devem ser aproximadamente 1-2 mm de diâmetro 9-10 dias após uma passagem (Figura 1). Esferas que crescem mais do que 2 mm irão desenvolver um centro escuro e os fatores de crescimento a médio e não será capazes de atingir as células no centro da esfera, resultando em diferenciação indesejada. As esferas saudáveis irão aparecer translúcidas e exibir cílios pseudo em torno das bordas da esfera (Figura 1).
Chapeamento do neurospheres sobre uma superfície aderente para fins de coloração irá resultar no crescimento das esferas aderentes (Figura 2A). Estas esferas vão tocar a superfície do navio cultura e ter algumas projeções, estendendo-se sobre a superfície do vaso, mantendo uma esfera central (Figura 2A). Escorva e diferenciar as células exigem as células para aderir a um deslizamento da tampa na parte inferior de uma placa de cultura de células, tais como uma placa de 24. Na sequência das etapas de preparação adequada e adição de meio de diferenciação, as células serão espalhados em toda a superfície do navio cultura e crescer como interconectada monocamada de células (Figura 2B).
Para confirmar também a validade da cultura hNSC ou fenótipo de células diferenciadas, imuno-histoquímica fluorescente pode ser usado. Nestin é um filamento intermediário, normalmente expressado em NSCs e pode ser usado para verificar a cultura hNSC (Figura 3A). Para verificar a presença de neurônios após diferenciação, classe III β-tubulina geralmente pode ser usado para rótulo os neurônios (Figura 3B). Embora a etapa de preparação é usada para atingir um percentual maior de neurônios após diferenciação, ainda haverá astrócitos na cultura. Proteína ácida fibrilar glial (GFAP) pode ser usado para astrócitos da etiqueta, a fim de quantificar, qual porcentagem de células diferenciadas tornou-se astrócitos ou neurônios.
Nós achamos que a linha K048 de NSCs foi infectada por cepas de africanas e asiáticas de ZIKV detectada pela coloração imunofluorescente com um anticorpo específico de ZIKV. As imagens representativas são mostradas na Figura 4. Simulado infecção não provocar uma mudança na morfologia do hNSC ou sobrevivência (Figura 4A, 4C). ZIKV tende a permanecer na região periférica de um post de um dia de célula infectada de uma infecção de 1 hora, mas preenche a célula inteira em 3 a 7 dias (Figura 4B4D, 4E). Visivelmente, com a mesma MOI (0,1), uma taxa de infecção de 5% estimado em células K048 é substancialmente mais baixa do que aqueles relataram recentemente ZIKV infecção taxa (até 80%) em humanos induzida por pele NSCs7. Neste estudo, relatando a infecciosidade de 80%, usou o protótipo cepa Africano de ZIKV (MR766) que pode ter adaptado um fenótipo neurotrópica durante mais de 140 passagens nas células do cérebro de rato.
Figura 1: imagens de campo brilhante da cultura hNSC. (A-C) Imagens de campo brilhante representante tiradas na ampliação de 10x de dias de cultura 1, 4 e 9 hNSC depois da passagem, respectivamente. Escala de barras: 60 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagens de campo brilhante das culturas aderentes. (A) imagens do representante de campo brilhante tiradas no ampliação de 10x da cultura aderente hNSC, 7 dias após o chapeamento. (B) imagens de campo brilhante representante tiradas na ampliação de 10x de aderente diferenciadas células seguindo ELL escorva e 9 dias de diferenciação. Escala de barras: 60 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens fluorescentes de culturas diferenciadas e hNSCs. (A) representante fluorescentes imagens tiradas em ampliação de 20 X de aderentes hNSCs manchadas com marcador nuclear, DAPI (azul) e marcador de células-tronco Nestin (vermelhas). Barra de escala: 60 µm (B) imagens fluorescentes tiradas na ampliação de X 60 de células diferenciadas, manchado com marcador neural βIII-tubulina (verde), fabricante de astrocyte GFAP (vermelho) e marcador nuclear DAPI (azuis) representante. Barras de escala: 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: infecção ZIKV em humanos fetal derivado do cérebro NSCs. NSCs humanas também foram tratados simulado (A e C), inoculados por 1 hora com uma estirpe de linhagem Africana de ZIKV no MOI de 0.1 (B e D), ou com uma estirpe asiática do ZIKV recentemente isolado de mosquitos no México em 2016 (E). A coloração imunofluorescente detecta rotulagem de anticorpos ZIKV em NSCs na inoculação de post de um a sete dias (1 dpi em B, 7dpi em D e 3 dpi em mi). Escala de barras 10 µm em A-D e 5 µm em E. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Mídia DFHGPS para um T75 | 10 mL |
| TPPS * | Μ L 173 |
| 200 mM L-Glutamin | 50 Μ l |
| 10 mg/mL insulina * * | 25 Μ l |
| 20 µ g/mL fator de crescimento epidérmico | 10 Μ l |
| fator de crescimento fibroblástico básico de 20 µ g/mL | 10 Μ l |
| fator de inibidor de leucemia de 10 µ g/mL | 10 Μ l |
| 5 mg/mL heparina | 10 Μ l |
| * Mistura contendo 100 µ g/mL, transferrina, 100 µM putresine, 20 nM progesterona e Selenito de sódio 30 nM. A mistura é feita a partir de ações concentradas e alíquotas são armazenadas a-80 ° C e preferablly utilizadas na preparação de 6 semanas. Os estoques concentrados são transferrina 10mg/mL, putrescina 30mm, 10 progesterona µM e Selenito de sódio 15 µM armazenado a-80 ˚ c. | |
| * * A insulina é dissolvida em 0,01 N hydroen cloreto, filtrada através de filtro de ligação 0,2 µM baixa proteína e armazenados no 4 ˚ c por até 6 semanas. | |
Tabela 1: fatores de crescimento para o novo meio de proliferação.
| dPBS * | 1 mLum | 3 mLb |
| 10% de glicose | 60 Μ l | 180 Μ l |
| 2,5% tripsina | 10 Μ l | 30 Μ l |
| DNase * * | 5 Μ l | 15 Μ l |
| * Fosfato-salino de Dulbecco | ||
| * * Desoxirribonuclease | ||
| uma para 10 milhões de células | ||
| b por 30 milhões de células | ||
Tabela 2: Preparação de tripsina.
| Condicionado de mídia | 1 mLum | 3 mLb |
| Inibidor de tripsina | 10 Μ l | 30 Μ l |
| uma para 10 milhões de células | ||
| b por 30 milhões de células |
Tabela 3: Preparação do inibidor de tripsina.
| DFHGPS * | 0,7 mLum | 2,1 mLb |
| FBS * * 20% | 0,2 mL | 0,6 mL |
| DMSO * * * 10% | 0,1 mL | 0,3 mL |
| * DMEM, F12, HEPES, glicose, penicilina-estreptomicina | ||
| * * Fetal soro bovino | ||
| Dimetil sulfóxido | ||
| um para 5 milhões de células em um frasco | ||
| b para três tubos de ensaio, 5 milhões de células/frasco | ||
Tabela 4: preparação do meio de congelamento de.
| DFGHPS * para um poço em uma placa de 24 | 1 mL |
| TPPS * * | 17.3 Μ l |
| 200 mM L-glutamina | 5 Μ l |
| 10 mg/mL de insulina | 2,5 Μ l |
| 20 µ g/mL fator de crescimento epidérmico | 1 Μ l |
| fator inibitório de leucemia de 10 µ g/mL | 1 Μ l |
| 1 mg/mL laminina | 1 Μ l |
| * Contendo DMEM, F12, HEPES, glicose, penicilina-estreptomicina | |
| * * Contendo 100 µ g/mL, transferrina, 100 µM putresine, | |
| 20 nM progesterona e Selenito de sódio 30 nM | |
Tabela 5: Preparação do meio de escorva ELL.
| DFGHPS * para um poço em uma placa de 24 | 1 mL |
| TPPS * * | 17.3 Μ l |
| 200 mM L-glutamina | 5 Μ l |
| 10 mg/mL de insulina | 2,5 Μ l |
| fator de crescimento fibroblástico básico de 20 µ g/mL | 0,5 Μ l |
| 5 mg/mL heparina | 0,5 Μ l |
| 1 mg/mL laminina | 1 Μ l |
| * Contendo DMEM, F12, HEPES, glicose, penicilina-estreptomicina | |
| * * Contendo 100 µ g/mL, transferrina, 100 µM putresine, | |
| 20 nM progesterona e Selenito de sódio 30 nM | |
Tabela 6: Preparação do meio de escorva FHL.
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Discussion
A capacidade de cultura e manipular hNSCs fornece uma ferramenta crítica que pode ser usada para uma variedade de finalidades da modelagem de doenças humanas para10,11,12,14, de despistagem de drogas de alto rendimento 15,16,17. Muitas perguntas continuaram a ser abordadas como cérebro fetal como humano NSCs ou seus descendentes são suscetíveis a ZIKV infecção, se diferentes cepas de ZIKV infectam NSCs com igual eficiência e como infecção durante o desenvolvimento neural resulta na microcefalia. Nós usamos esta cultura hNSC para investigar Zika vírus associado neuropatologia11,14. Usando três linhagens de células isoladas de três doadores individuais, também somos capazes de comparar as diferenças individuais de susceptibilidade para os déficits neurológicos observados seguintes ZIKV infecção11. Uma das limitações desta técnica é a acessibilidade às amostras do hNSC e o condicionado meio essencial para a cultura adequada. Para contornar essa barreira, favor contate o autor correspondente para providenciar uma transferência de material, como as células utilizadas neste protocolo não estão disponíveis comercialmente.
Estudos in vitro usando hNSCs não só fornecem uma visão única sobre o comportamento de células-tronco básico, eles também fornecem uma excelente plataforma para realizar pesquisas pré-clínicas. No entanto, os desafios técnicos de cultivo hNSCs podem servir como um obstáculo em usá-los como modelos eficazes e reprodutíveis. Neste protocolo, descrevemos as etapas-chave e metodologias que podem ser usadas para reduzir a variabilidade nos métodos de cultivo e produzem uma cultura de células-tronco hNSC saudável e estável. Uma desvantagem do uso hNSC neurosphere cultura é que as células são extremamente sensíveis a quaisquer estímulos. Mesmo com o protocolo detalhado acima, é essencial para prestar atenção quanto os frascos ou pratos de hNSCs são tratados, como as mais sutis variações no protocolo podem resultar em mudanças no comportamento neurosphere.
A parte mais crucial deste trabalho de métodos é o coquetel de fatores de crescimento e preparação dos diferentes meios de comunicação. Se o tempo de duplicação da cultura hNSC é muito baixo, ou muitas células adherie ao navio da cultura (quando deveria ser não-aderente), o primeiro passo é garantir que os fatores de crescimento sendo utilizados são a concentração adequada e não expirado. Todos os factores de crescimento neste protocolo têm uma vida útil muito curta, uma vez descongelada (5-6 dias). Além disso, temos usado os fatores de crescimento de várias empresas e notei as diferenças na qualidade e na concentração necessária para manter a cultura. Portanto, recomendamos altamente usando os fatores de crescimento exatos detalhados na Tabela de materiais. O passo passaging (etapas 3.1-3,22) também é uma fonte comum de erro. Se houver muitas células mortas, seguindo o processo de dissociação, reduza o número de vezes de pipetagem de cima e para baixo para dissociar as células, como demais dissociação física pode resultar em morte celular. Alternativamente, se houver muitos aglomerados de células após a etapa de dissociação, aumento do vigor ou o número de vezes de pipetagem para cima e para baixo, como estes clusters vai rapidamente tornar-se grandes esferas que não permanecerá viáveis na cultura. Se a cultura for mantida adequadamente, a infecção com ZIKV é relativamente simples.
Enquanto a infecção ZIKV é o tratamento detalhado no presente protocolo, é possível usar este sistema de cultura hNSC para uma ampla gama de estudos. Este sistema de modelo pode ser usado para drogas da tela, examinar a susceptibilidade individual e investigar os mecanismos subjacentes de uma variedade de doenças e disfunções no desenvolvimento14. Este sistema também é ideal para estudos genômicos, desde que as células cultivadas não tem sido manipuladas geneticamente e mostram pouca ou nenhuma anormalidade cromossômica, mesmo até 80 passagens10,11. Acreditamos que este sistema de cultura é ideal para modelagem em vitro como estímulos ambientais, tais como infecção, drogas, álcool, toxinas, etc pode influenciam o desenvolvimento do sistema nervoso.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por fundos do S. John Dunn Foundation e do Instituto para infecções humanas e imunidade da University of Texas Medical Branch (PW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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