Summary
In dit artikel een overzicht van de methoden die worden gebruikt om uit te breiden van de foetale hersenen neurale stamcellen in cultuur, evenals hoe om hen te onderscheiden in verschillende neuronale subtypen en astrocyten, met de nadruk op het gebruik van neurale stamcellen te bestuderen Zika virusinfectie.
Abstract
Menselijke foetale hersenen neurale stamcellen vormen een uniek model van niet-genetisch gemodificeerde systeem te bestuderen van de impact van verschillende stimuli op menselijke developmental neurobiologie. Eerder dan een dierlijk model of genetisch gemodificeerde geïnduceerde pluripotente cellen gebruikt, bieden menselijke neurale stamcellen een effectieve in vitro -systeem om te onderzoeken wat de gevolgen van behandelingen, scherm drugs, of het onderzoeken van individuele verschillen. Hier bieden wij de gedetailleerde protocollen voor methoden die worden gebruikt om uit te breiden van de foetale hersenen neurale stamcellen in cultuur met serum-vrije media, om hen te onderscheiden in verschillende neuronale subtypen en astrocyten via verschillende priming procedures, en om te bevriezen en herstellen deze cellen. Daarnaast beschrijven we een procedure van het gebruik van neurale stamcellen van menselijke foetale hersenen te bestuderen Zika virusinfectie.
Introduction
Zika-virus (ZIKV) is een flavivirus of seksueel, en door de mug vectoren Aedes aegypti en Aedes albopictus muggen. ZIKV onlangs werd geïdentificeerd als een bedreiging van de volksgezondheid ernstig te wijten aan het gemak van transmissie en neurologische symptomen1aangesloten. Een van de meest betreffende neurologische effecten is de ontwikkeling van microcefalie in foetussen geboren zwangere geïnfecteerde moeders2,3. Microcefalie is een neurologische aandoening waar het hoofd kleiner is dan de typische grootte tijdens de foetale ontwikkeling en bij de geboorte, met de omtrek van minder dan 2 standaarddeviaties onder de gemiddelde4. De kleinere hoofdomtrek gaat vaak gepaard met allerlei comorbidities zoals ontwikkelingsstoornissen vertragingen, toevallen, visie en gehoorverlies en voederen van moeilijkheid.
Recente studies hebben dierlijke modellen gebruikt of geïnduceerde pluripotente stamcellen te bestuderen van het effect van ZIKV besmetting van neurologische5,6,7,8. Terwijl deze studies hebben bijgedragen aan onze kennis van ZIKV, het gebruik van verschillende soorten of genetisch gemodificeerde cellen kunnen tijdrovend zijn en/of voeg extra variabelen die kunnen verwarren het effect van ZIKV op de ontwikkeling van neurale cellen5, 6 , 7 , 8. het probleem met de hNSC cultuur, met name de niet-aanhanger neurosphere beschreven in dit protocol is echter dat de cultuur zeer gevoelig voor de gebruikte methoden is voor het voeren van de cultuur-9. Wijzigingen in middelgrote componenten, of zelfs de fysieke verwerking van het vaartuig van de cultuur, is genoeg om het uitlokken van een reactie van de cellen9. Om deze kwesties te behandelen, ontwikkeld wij een cultuur van menselijke foetale hersenen-afgeleide neurale stamcellen (hNSCs) in vitro te ondervragen mechanistically het effect van ZIKV op foetale neurale stamcellen. Met onze methode, werden hNSCs voor meer dan 80 passages zonder duidelijk fenotypische wijzigingen10onderhouden. Bovendien chromosomale wijzigingen zoals Trisomie waren ofwel geen of minimale11. Deze cultuur hNSC groeit als een niet-aanhanger neurosphere cultuur. Een voordeel van neurospheres is dat de sferen creëren een unieke ecologische niche in cultuur die is meer reflectie van in vivo niches in vergelijking met tweedimensionale culturen9. Een ander voordeel van dit protocol is dat meerdere celtypes kunnen worden afgeleid uit de hNSC-cultuur, waardoor een onderzoeker aan het observeren van de invloed van een bepaalde variabele op hNSC overleving en differentiatie. Dit protocol is van toepassing op personen die op zoek om mechanistische vragen met betrekking tot de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel of disfuncties te beantwoorden. Het volgende protocol wordt beschreven hoe een hNSC cultuur te infecteren met ZIKV, en vervolgens het onderscheiden van de hNSCs om te zien hoe de gevolgen van de besmetting van de differentiatie-proces uit te breiden. Het bevat ook methoden voor het opslaan van hNSCs voor langdurig gebruik, en om te onderscheiden hNSCs in verschillende soorten neuronen waarmee verder onderzoek naar ZIKV-geïnduceerde tekorten bij te dragen tot de hersenen malformatie11. Wij geloven dat dit protocol is eveneens van belang aan onderzoekers willen begrijpen de impact van eventuele milieu stimulus zoals infectie of toxine op neurale stamcellen overleving en differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke neurale stamcellen waren oorspronkelijk afgeleid van afgedankte menselijke foetale cortexes in het eerste trimester12. Alle procedures van het protocol voldoet aan de Universiteit van Texas Medical Branch ethische richtlijnen betreffende het gebruik van menselijk weefselmonsters, en de cellijnen werden goedgekeurd door de institutionele Commissie van de bioveiligheid.
1. middelgrote voorbereiding en stamcel herstel
- Bereiden kweekmedium voorraad (DFHGPS) door het combineren van de reagentia in stappen 1.1.1.-1.1.5.
- Voeg 210 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Medium met hoge glucose en L-glutamine (D). Bewaar het bij 4 ˚C.
- Voeg 70 mL Ham de F12 nutriënt mix met L-glutamine supplement (F). Bewaar het bij 4 ˚C.
- Voeg 4.2 mL 15 mM HEPES-Buffer (H) en bij kamertemperatuur bewaren.
- Voeg 4.2 mL 10% oplossing van D-glucose (G) en op te slaan bij kamertemperatuur.
- Voeg 2.88 mL penicilline/streptomycine (PS) oplossing... Aliquot de stockoplossing in 3 mL aliquots en slaan de aliquots bij-20 ° C totdat het nodig is.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van penicilline in het medium zal 100 eenheden/mL, en de concentratie van streptomycine zullen 100 µg/mL. Dit medium zal worden verwezen als DFHGPS voor de rest van het protocol en moet worden bewaard bij 4 ° C voor gebruik binnen 1-2 weken. Indien nodig, kan DFHGPS worden opgeschaald proportioneel.
- De dag voordat de cellen worden teruggevorderd, jas een T75 kolf met 5 mL van geconditioneerde medium, verkregen uit de vorige culturen van de cellijn van hNSC, en laat in een incubator 37 ° C met 8,5% kooldioxide (CO2) overnachting.
Opmerking: Als momenteel kweken hNSCs, slaat u het medium dat cellen hebben gegroeid gedurende een middellange verandering. Dit is geconditioneerde medium zoals het is "geconditioneerd" door de cellen. Geconditioneerde medium kan worden opgeslagen in de buis van een schroefdop en opgeslagen bij 4 ° C voor ongeveer 7 dagen. Neem contact op met de overeenkomstige auteur te ontvangen hNSCs. Geconditioneerde medium heeft de voorkeur maar niet absoluut nodig is, met name wanneer eerst begint de cultuur van hNSCs. - De dag van herstel, 20 mL van de DFHGPS in een tube van 50 mL schroefdop in een waterbad 37 ° C gedurende ten minste 10 minuten warm en bewaar deze in het waterbad tot klaar voor gebruik.
- In een aparte 15 mL schroefdop buis, 10 mL van de DFHGPS in een waterbad 37 ° C gedurende ten minste 10 minuten warm en bewaar deze in het waterbad tot klaar voor gebruik in stap 1.13.
- Ophalen van een container van ijs en alle middelgrote onderdelen (tabel 1). Alle middelgrote componenten op het ijs ontdooien en laat ze op het ijs terwijl de voorbereiding van de middellange verandering.
- Verkrijgen van 5 mL geconditioneerde middellange voorraad (opgeslagen bij 4 ° C) en bewaar deze in een waterbad 37 ° C tot klaar voor gebruik in stap 1.14. Zie de opmerking na stap 1.2 als er geen cultuur van geconditioneerde middellange of huidige menselijke foetale neurale stamcellen.
- De tube van 50 mL schroefdop ophalen stap 1.3 en plaats deze in de bioveiligheid kabinet (BSC). Pipetteer 10 mL van de DFHGPS in een nieuwe schroefdop-tube van 15 mL en plaats vervolgens het 50 mL tube met de overblijvende 10 mL van DFHGPS medium weer in het waterbad 37 ° C.
- Het verkrijgen van een cryo-flacon van hNSCs die in vloeibare stikstof zijn opgeslagen. Zie de opmerking na stap 1.2 als er geen huidige menselijke foetale neurale stamcellen cultuur.
Opmerking: Menselijke neurale stamcellen waren oorspronkelijk afgeleid van afgedankte menselijke foetale hersenen12 en onderhouden in cultuur zonder genetische modificaties10. 5 × 10-6 cellen moeten worden ontdooid en vergulde op een T75 kolf. Elke cryo-flacon dient 5 × 10-6 cellen; Daarom is één flesje per kolf nodig. - Ontdooi een flesje van cellen in het waterbad 37 ° C door het omkeren van de flacon elke 10 s voor ongeveer 1 min of totdat het ijs is gesmolten en de inhoud van de flacon volledig vloeibaar zijn. Dompel niet het hele flesje onder water om mogelijke besmetting te voorkomen.
- In het Comité voor Bankentoezicht, gebruik een P1000 micro-Pipet de ontdooide cell oplossing gecombineerd en het drop-wise aan de tube van 15 mL toevoegen in stap 1.7, met 10 mL DFHGPS. Als u wilt toevoegen de ontdooide cell oplossing drop-wise, langzaam druk naar beneden op de plunjer zodat slechts een druppel of twee tegelijk wordt vrijgegeven. Ondertussen, swirl de tube van 15 mL zodat een snelle mengsel.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, ervoor zorgend om het behouden van de cel-pellet.
- Tijdens stap 1.11, halen de tube van 50 mL met de overblijvende 10 mL uit stap 1.7. Resuspendeer de pellet van de cel in de 10 mL DFHGPS en centrifuge na het centrifugeren, weer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Tijdens de laatste spin, bereiden het nieuwe groeimedium door volgende tabel 1 toe te voegen van groeifactoren aan de 10 mL van DFHGPS medium uit stap 1.4 (tabel 1) in de BSC. Laat het nieuwe medium met factoren die de groei in de BSC tot klaar voor gebruik.
- De kolf T75 ophalen stap 1.2 en gooi het geconditioneerde medium coating van de kolf door aspiratie. Voeg dan de 5 mL van geconditioneerde media vanaf stap 1.6. aan op de maatkolf met behulp van een precisiepipet serologische. Wees voorzichtig niet te krabben van de onderkant van de kolf.
- De buis van cellen ophalen uit de centrifuge en verwijder het supernatant door aspirating, en de cel pellet intact.
- Resuspendeer cel pellet in 10 mL van de nieuwe media vanaf stap 1.13 met behulp van een serologische 5 mL-pipet en pipetteren op en neer meerdere malen. Voeg de schorsing aan de gecoate T75 maatkolf uit stap 1.14. Gebruik de resterende 5 mL te spoelen van de buis die de cel pellet en voegt u deze 5 mL in de kolf zo goed.
- Rock de kolf T75 heen en weer 3 keer om ervoor te zorgen dat de cellen worden gelijkmatig verdeeld over de kolf. Zorg ervoor dat het GLB van de kolf is los te staan van de luchtstroom. Onder een lichte Microscoop observeren van de cellen, notities maken en nemen afbeeldingen indien mogelijk.
Opmerking: De cellen moeten kijken doorschijnend en sferisch. Noteer als er cellen die blik donker, ondoorzichtig, of hebt asymmetrische boarders aangezien dit op celdood duiden kan. Kijk ook voor schimmel- of bacteriële verontreiniging, zoals de media steeds geel van kleur. - Plaats de kolf van cellen in een incubator 37 ° C met 8,5% CO2.
Opmerking: Gebruik 8,5% in plaats van 5,0% CO2 om de pH van deze voedingsbodems serumvrij in het bereik van 7.1-7.4.
2. hNSC Medium wijzigen
Opmerking: Wijzig medium elke 3-4 dagen.
- Zet de BSC en grondig reinigen met 70% ethanol. Cellen onder een lichte Microscoop te observeren.
Opmerking: Notities maken op het uiterlijk van de cellen en bol maten. Drie dagen na herstel of een geselecteerde passage, zal cellen cluster samen en beginnen te vormen van niet-aanhanger neurospheres.
Let op: Als cellen zich aan de onderkant van de kolf houden, de cultuur zal moeten worden verwijderd, terwijl de naleving van de cel voorbarig differentiatie toenemen zal en cellen zullen niet in staat om een stam-status te behouden. Als er te veel cellen in de kolf, de cellen kunnen vormen grote bollen (groter dan 2 mm diameter) in welk geval, cellen in het midden van de bol zal beginnen te onderscheiden gebrek aan toegang tot factoren die de groei in het medium. Als terreinen groter dan 1 mm diameter worden waargenomen, kunnen de cellen 3.1-3.22 gepasseerd (stappen). - Volg stap 1.4 en 1.5, en bereiden van 10 mL verse voedingsbodem (zie stap 1.13).
- Tilt kolf aan de zijkant, waardoor sferen te zinken naar de bodem van de kolf.
- 5 mL geconditioneerde media verwijderen vanaf de bovenkant van de gebundelde medium gebruik van serologische Pipetteer 5 mL, verzorgen niet om een neurospheres gecombineerd. Plaats de 5 mL van geconditioneerde media in een schone 15 mL-buis.
- Een extra 5 mL geconditioneerde media uit de kolf opnieuw zorgvuldig het vermijden van de bollen, verwijderen en plaatsen van de 5 mL in de dezelfde tube van 15mL.
- Voeg 10 mL van de nieuwe media vanaf stap 2.2 tot de resterende 5 mL van geconditioneerde media en cellen in de kolf. Stel de kolf naar beneden flat en observeren van de cellen onder een lichte Microscoop.
- Indien cellen hebben zijn aanzuiging tijdens collectie van geconditioneerde medium blijkt, draai het geconditioneerde medium bij 100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen die zich aan de onderkant in 1 mL van geconditioneerde medium ophopen, en ze vervolgens toevoegen aan de cultuur-kolf.
- De 10 mL ongebruikte geconditioneerde media uit stappen 2.5/2.6 op 4 ˚C opslaan in een tube van 15 mL schroefdop.
- Herhaal stappen 1.17/1.18.
3. hNSC Passage
Opmerking: hNSCs moet de passage elke 9-11 dagen als cellen groeien normaal gesproken, als populatieverdubbelingstijd is ongeveer 3 dagen13.
- Als uitbreiding van de NSCs in een maatkolf van nieuwe, zorg ervoor dat alle nieuwe kolven zoals in stap 1.2 zijn bekleed.
- Reinig de BSC als in stap 2.1, en voeren stap 1.4 en 1.5.
- Medium zoals in stap 1.13 voor te bereiden. Elke kolf T75 vereist 10 mL van medium. Voor meerdere T75 kolven, vermenigvuldigt u 10 mL van media door aantal kolven.
- Bereiden 1 of 3 mL van de Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (dPBS) en glucose in een waterbad 37 ° C te warm voor 10 min (voor de oplossing van de trypsine) volgens de volumes in tabel 2. Voeg geen trypsine of DNase op dit moment. DNase mogelijk moet breken DNA vrijgelaten uit de dode cellen als gevolg van mechanische of chemische cel dissociatie.
Opmerking: Voor een T75 kolf gepasseerd na 9-10 dagen van de groei zal er ongeveer 30 × 106 cellen, als 5 × 10-6 oorspronkelijk op de kolf geplaatste werden. 1 mL van de oplossing dPBS wordt meestal gebruikt voor 10 × 10-6 cellen. Daarom is 3 mL dPBS oplossing nodig voor een T75 kolf gepasseerd na 9-10 dagen. - Plaats schone kleine wegen boot en hemocytometer in de kap. Schoon met 70% ethanol en laat lucht droog in kap voor ongeveer 5 min.
Opmerking: De weeg-boot zal worden gebruikt in stappen 3.17.1. - Ophalen van de kolf van cellen die uit de incubator zal worden gepasseerd en brengen het Comité voor Bankentoezicht. Tilt kolf zacht waardoor cellen te zinken naar de bodem van de gebundelde media. Er is ongeveer 15 mL media in de kolf.
- Verwijderen ongeveer 10 mL van de media in porties van 5 mL (d.w.z. 5 mL + 5 mL). Breng deze 10 mL van de media in een schone 15 mL-buis met het label "CM" voor "geconditioneerde medium". Wees voorzichtig niet te gecombineerd de cellen vestigde zich in de resterende 5 mL van de media in de kolf; deze cellen en 5 mL van de media zal worden onderworpen aan stap 3.8.
- Neem 3 mL van geconditioneerde media uit de "CM" buis (uit stap 3.7) en leg in een tube van 15 mL met het label "trypsine remmer oplossing". Dit zal worden gebruikt in stap 3.12. Na verwijdering van de 3 mL is er 7 mL geconditioneerde media links in de buis "CM". Zet de buis "CM" opzij tot stap 3.9.
- Verwijder de 5 mL van media en cellen blijven in de kolf T75, en plaats in een schone 15 mL-buis met het label "Cellen".
- Neem de "CM" buis met 7 mL geconditioneerde media (uit stap 3.7.1) en spoel de bodem van de T75 kolf tweemaal met porties van geconditioneerde media, met behulp van een serologische 5 mL-pipet 3,5 mL. Na elke spoeling de 3,5 mL porties in de "Cellen" buis te plaatsen. Het doel van deze stap is om alle neurospheres (cellen) van de kolf T75.
- Centrifugeer de "Cellen" buis bij 100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Terwijl cellen zijn spinnen, dPBS/glucose oplossing verkrijgen waterbad 37 ° C en de juiste hoeveelheid trypsine en DNase volgens tabel 2toe te voegen.
- Nadat de "Cellen" buis is gestopt met spinnen, verwijdert u alle het geconditioneerde medium supernatant en overbrengen in de buis "CM".
- Neem de buis met het label "trypsine remmer oplossing" uit stap 3.7.1. en toevoegen van de hoeveelheid trypsine remmer aangegeven in tabel 3. Gebruik dezelfde hoeveelheid trypsine remmer oplossing zoals werd gebruikt voor de oplossing van de trypsine.
- Plaats trypsine remmer oplossing in het waterbad 37 ° C totdat het nodig is.
- Trypsine oplossing aan de cel pellet in de tube van 15 mL toevoegen en Pipetteer omhoog en omlaag ongeveer 5 - 10 keer met een 5 mL-pipet. Sluit de dop van de tube en broeden in een waterbad 37 ° C gedurende 5 minuten. Na 5 min, ophalen van de cellen en op en neer Pipetteer 5 - 10 keer. Vervolgens broeden in het waterbad 37 ° C voor een extra 10-15 min.
- In de laatste 5 min, de oplossing van de Inhibitor van de omwenteling trypsine naar de BSC te verplaatsen.
- De cellen ophalen nadat stap 2.14 voltooid is en Pipetteer de cellen op en neer totdat bollen zijn volledig losgekoppeld (20 - 30 keer). Dan Voeg onmiddellijk de trypsine remmer oplossing en Pipetteer op en neer 10 keer. Deze oplossing van gedissocieerde cellen en trypsine remmer zal worden verwezen als de "celsuspensie".
- Het aantal cellen in de celsuspensie door stap.
- Pipetteer 15 µL van pre mengsel Trypan Blue (met 5 µL van 0,4% Trypan blauwe en 10 µL van dPBS) op een kleine wegen-boot, en voeg vervolgens 5 µL van de celsuspensie. Pipetteer omhoog en omlaag 3 - 5 keer te mengen. Daarna Pipetteer 10 µL van de Trypan blauw/celsuspensie op beide zijden van een hemocytometer bedekt met een dekglaasje glas aan.
- De cellen onder een lichte Microscoop observeren en tellen het totale aantal cellen in elk van de vier hoek rasters. Deze getallen bij elkaar optelt.
- Herhaal voor de andere kant tellen en gemiddelde van de twee zijkanten samen.
- Dit getal vermenigvuldigt met 10.000 te geven van het totale aantal cellen per mL. Dit getal vermenigvuldigt met het totale aantal milliliter voor het berekenen van het totale aantal cellen in de celsuspensie. Bereken hoeveel volume van celsuspensie nodig zullen zijn om het zaad van 5 miljoen cellen per T75 kolf.
Opmerking: Doorgaans na 9-10 dagen, een T75 zal hebben 25-30 × 106 cellen. Daarom, als passaging alle cellen in de nieuwe kolven, een totaal van 5-6 flacons nodig is. - Voeg de hoeveelheid celsuspensie berekend in stap 3.19 aan elke maatkolf T75 te verkrijgen 5 × 10-6cellen per kolf toe. Als het volume minder dan 5 mL is, voeg extra voorwaarde medium te halen tot een totaal van 5 mL. Voeg vervolgens 10 mL van nieuwe DFHGFPS media met groeifactoren (tabel 1) aan op de maatkolf.
- Herhaal stap 1.17 en 1.18 en zorgen dat de kolf wordt aangeduid met het type van cellen, de datums, het aantal cellen in de kolf en het nummer van de passage (dit is het aantal keren dat de cel heeft zijn gepasseerd). Ga naar stap 4-9.
- Als nodig, zaad extra cellen in één T75 erlenmeyer op de dichtheid tot 30 × 106cellen per kolf 's nachts en bevriezen van de volgende dag volgens stap 4.
4. hNSC invriezen en opslag
- De dag na passaging, halen de kolf uit de incubator met de cellen die voor bevriezing (uit stap 3.19 en 3.22). Kantelen van de kolf en verwijder alle medium en cellen van de kolf en de plaats in een tube van 15 mL. Centrifugeer vervolgens de buis bij 216 x g gedurende 5 min.
- Tijdens het proces van centrifugeren, bereiden bevriezing gemiddeld (tabel 4). Voor elke 5 × 10 bereiden6 cellen 1 mL van bevriezing medium. Het aantal cellen is in stap 3.19 vastgesteld bij het bepalen van hoeveel cellen om te zetten in elke kolf. Dit nummer zal 's nachts niet veranderd.
- Bereiden cryo-preserve flesjes met labels van celnaam, passage nummer, celaantal, initialen en datum. Na het centrifugeren, bovendrijvende vloeistof verwijderen door aspiratie en resuspendeer de pellet van de cel in de bevriezing van medium zodat er 5 × 106 cellen/mL. Met behulp van een 5 mL-Pipet, aliquoot 1 mL per flacon en zegel strak (5 × 106 cellen per flacon).
- Plaats flesjes in de container van een cryo-preserve met 250 mL isopropanol (max gebruik van 5 keer per vervanging van isopropanol). Bewaren in de vriezer-80 ° C's nachts en het overdragen aan een systeem voor opslag van vloeibare stikstof tank.
5. plating aanhangend hNSC voor validatie
- Eergisteren passaging (stappen 3.1-3,22), reinig de BSC als in stap 2.2, en verkrijgen van een 24-well plaat en steriele glas 12 mm coverslips.
- Plaats een interne dekglaasje aan met pincet, aan de onderkant van elk putje van de plaat.
- De putjes met cover slips met 0,01% poly-D-lysine (PDL) jas in steriel water en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ˚C. Gebruik voor een 24-well plaat, 250 μL van PDL per putje.
- Verwijder de PDL uit de putten en vervolgens jas met 1 µg/cm2 laminin/dPBS (250 μl per putje). Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C. Als dit niet nodig de volgende dag, het zegel van de plaat met parafilm door inwikkeling de parafilm rond de randen van de plaat en bewaren bij 4 ° C.
Opmerking: Platen bedekt met laminin kunnen worden opgeslagen tot 2 weken als verzegeld met parafilm zolang cover slips doen niet droog. - Passage cellen als beschreven in stap 3.1-3.22, en vervolgens het bepalen van het aantal cellen op zaad dat in de 24-well plaat met gecoate coverslips.
- Verwijder alle overtollige laminin oplossing uit putten door middel van aspiratie en eenmaal spoel met 0,5 mL dPBS. Vervolgens zaad cellen in de putten bij een dichtheid van 0,6-1 x 105 cellen/cm2 per putje. Alle resterende cellen volgens stappen 3.16-3,21 gebruiken.
- Atvarious momenten tijdens de 24-well plaat cultuur, vast en vlekken van de cellen voor diverse stamcel markeertekens na stap 9.
6. Zelfaanzuigende verkrijgen van GABA en glutamaat neuronen
- Passage van de cellen zoals beschreven in 3.1-3.22, en controleer het aantal cellen te zaad in een 24-well plaat stap 5.6.
- Eergisteren priming, bereiden de cover slips en vacht plaat zoals beschreven in stappen 5.1-5.4.
- Ophalen op priming dag, de kolven met 2-3-daagse cellen. Plaats in een tube van 15 mL- and -pellet de cellen door centrifugatie bij 100 x g gedurende 5 min.
- Voorbereiden van de epidermale groeifactor/leukemie remmende factor/laminin (ELL) priming medium volgens tabel 5.
- Resuspendeer de cellen met ELL medium.
- Zaad opgeschort cellen in een 24-well plaat (Volg stap 5.6).
7. priming verkrijgen van motorische neuronen
- Stappen 6.1-6.4.
- Het fundamentele fibroblast groeifactor/heparine/Laminin (FHL) priming medium volgens tabel 6voor te bereiden.
- Volg stap 5.6.
8. Zika Virus infectie
Opmerking: ZIKV is zeer gevoelig voor temperatuur, dus het is noodzakelijk dat ZIKV voorraad, worden opgeslagen bij - 80 ° C en bevriezen/ontdooien cycli worden vermeden. Blijven werken aliquots op ijs.
- De cellen van de passage zoals beschreven in stappen 3.1-3.22. 3-4 miljoen cellen in totaal nodig zijn om het zonebeheer van een 24-well plaat, dus toen passaging, het aantal cellen die nodig zijn voor infectie en zaaien in een kolf als passaging.
- Als de cellen zaaien in een 24-well plaat voor vlekken, de coverslips en de plaat volgens stappen 5.1-5.4 voorbereiden.
- Na passaging, plaats 1 mL celsuspensie uit stap 8.2 in een tube van 1,5 mL microcentrifuge, en centrifuge bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant door aspiratie.
- Resuspendeer de pellet in stap 8.3 in ZIKV aandelen te verwerven van een veelheid van infectie (MOI) van beide 1 tot 10. Het volume van de oplossing van de ZIKV mag niet meer dan 0,5 mL. Resuspendeer de cellen in de dezelfde omvang en type medium gebruikt in ZIKV voorraad voor mock behandeling (cellen).
Opmerking: ZIKV stock voorbereiding en infecties worden beschreven in een eerdere publicatie11. Mock infecties zijn ook uitgevoerd met medium. - Incubeer boven cel/ZIKV mengsel bij 37 ° C voor 1 h. omkeren de buis 2 - 3 keer, en vervolgens Centrifugeer mengsel gedurende 5 minuten bij 216 x g bij kamertemperatuur te verkrijgen van een cel-pellet. Resuspendeer de pellet in dPBS en Centrifugeer nogmaals gedurende 5 min bij 216 x g bij kamertemperatuur.
- De bovendrijvende vloeistof verwijderen door aspiratie, resuspendeer de cellen met geschikte voedingsbodem en laden van geïnfecteerde cellen in de kolf of plaat die nodig zijn voor het experiment. Als de cellen zaaien in een 24-well plaat resuspendeer de pellet in 12 mL van een geschikte voedingsbodem, en vervolgens voegt 500 μL van schorsing aan elk putje.
Opmerking: op dit moment behouden de cellen in groei media te observeren van de effecten van ZIKV op stamcellen of ga door naar stappen 6 of 7 te bestuderen van het effect van ZIKV op het proces van de differentiatie.
9. kleuring procedure
- Om dit te corrigeren de cellen verwijderen medium, eenmaal spoel met 0,5 mL per putje (24-well plaat) ijs koud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- PBS, verwijderen en dek cellen met 0,5 mL 4% paraformaldehyde in PBS en laat op kamertemperatuur voor 20-30 min.
- Verwijder de paraformaldehyde en spoel de cellen drie keer met 0,5 mL PBS, verlaten de derde PBS spoelen op gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Op dit punt laat de PBS's nachts en opslaan van de plaat duikt met 4 ˚C, of beginnen kleuring na de 10 min spoelen.
- Na de 10 min PBS spoelen, blokkeren de cellen gedurende 45-60 minuten in een stilstaande positie met een 0,5 mL oplossing van 5% normale geit serum (NGS), 0,3% bovien serumalbumine (BSA), 0,25% Triton X-100 in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS). Bijvoorbeeld, om 1 mL van het blokkeren van oplossing gebruik: 10 µL van 25% Triton X-100, 50 µL van 100% NGS en 100 µL van 3% BSA gemengd in 840 µL van eetlepels
- Tijdens de blokkerende stap, bereiden de primair antilichaam oplossing, ervoor te zorgen dat alle reagentia worden gehouden op het ijs. Voor de validatie van hNSCs, kunnen eiwitten zoals Nestin worden uitgevoerd met behulp van het juiste antilichaam tegen hen. Om te valideren ZIKV infectie, een antilichaam tegen ZIKV vacht eiwit11te gebruiken. Voor differentiatie, door markers zoals class III β-tubuline te gebruiken om te identificeren van neuronale populaties terwijl gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) kan worden gebruikt voor het identificeren van astrocyten. De concentratie van primaire antilichamen zijn empirisch bepaald afhankelijk van leverancier en veel. We hebben de meeste antilichamen van 1:100 naar 1:2000 verdunning gebruikt.
- Centrifugeer het primaire antilichaam bij 12.000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C en breng een verdunning; bijvoorbeeld om een verdunning van de 1:1000 van antilichaam voegt 7.2 µL van gewenste antilichaam in 7,2 mL van 0,25% Triton X-100 in eetlepels
- Voeg ongeveer 300 µL van antilichaam oplossing aan elk putje van de plaat van een 24-well en Incubeer de cellen met primair antilichaam in een stilstaande positie gedurende 2 uur op kamertemperatuur of 4 ˚C overnachting in een stilstaande positie.
- Na de incubatie, wassen cellen met 0,5 mL van TBS driemaal bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een stilstaande positie.
- Centrifugeer het secundaire antilichaam bij 12.000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C, en vervolgens verdund in 0,25% Triton X-100/TBS oplossing. Maakt genoeg antilichaam oplossing 300 µL toevoegen aan elk putje. Hier, Verdun de fluorescerende secundaire antilichamen 1:500 (Figuur 3).
- Nadat de laatste TBS wassen, 300 µL van het secundair antilichaam-oplossing toevoegen aan elk putje en broeden in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een stilstaande positie. Vanaf dit punt, moeten alle stappen plaatsvinden in een donkere kamer.
- Wassen van de cellen drie keer met TBS gedurende 10 minuten in een stilstaande positie.
- Tijdens de laatste 10 min wash, Verdun de nucleaire markering DAPI nucleaire vlek bij de aanbevolen concentratie in TBS (meestal 1:1,000 - 1:5, 000). Maakt genoeg oplossing 300 µL toevoegen aan elk putje.
- Na de definitieve wash, voeg 300 µL van DAPI oplossing aan elk putje en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een stilstaande positie. Daarna een keer wassen met 0,5 mL eetlepels
- Gebruik een anti-fade montage medium voor fluorescentie en 1 druppel (10-15 µL) per dekglaasje aan die zal worden geplaatst op de dia. Zorgvuldig gebruik pincet te verwijderen van coverslips uit de putten 24-well plaat en plaats het celoppervlak neer op de gemiddelde daling van de montage op de dia.
- Zodra de coverslips worden geplaatst op de dia, plaats u de dia in een platte dia-houder. Zorg ervoor dat etiket dia's zal alle relevante informatie die nodig is om te identificeren van de cellen op dat dia, dan dekken de houder met aluminiumfolie om te houden van de dia's beschermd tegen licht.
- De dia's op 4 ˚C opslaan en laat de montage middellange tot 's nachts stollen. De volgende dag, acht de dia met behulp van een Microscoop epifluorescerende met UV-2E/C filter (340-380 nm), GFP HYQ BP filter (450-490 nm) of Y-2E/C Texas rood filter (540-580 nm), 20 X vergroting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gekweekte hNSCs in hun proliferatieve fase zal groeien als niet-aanhanger neurospheres (Figuur 1). Onmiddellijk na hNSC passage, zal er veel individuele cellen, die zal aggregaat en begint te formulier bollen in de komende paar dagen (figuur 1A en 1B). Gezonde bollen moet ongeveer 1-2 mm diameter 9-10 dagen na een passage (Figuur 1 c). Bollen die groter zijn dan 2 mm groeien zal ontwikkelen een donkere center en de factoren die de groei in het medium zal niet zitten kundig voor de cellen in het midden van de bol, wat resulteert in ongewenste differentiatie bereiken. Gezonde bollen zal verschijnen doorschijnend en pseudo-cilia rond de randen van de bol (Figuur 1 c) weer te geven.
Neurospheres op een aanhangend oppervlak plating voor kleuring doeleinden zal resulteren in de groei van aanhangend bollen (figuur 2A). Deze terreinen zal raken het oppervlak van het schip van de cultuur en hebben sommige prognoses strekken op het oppervlak van het vaartuig, terwijl het handhaven van een centrale bol (figuur 2A). Priming en differentiatie van cellen vereisen de cellen zich te houden aan een cover slip aan de onderkant van een cel cultuur plaat, zoals een 24-well-plate. Na de juiste priming stappen en de toevoeging van differentiatie medium, zal de cellen verdeeld over het oppervlak van het schip van de cultuur en groeien als onderling verbonden enkelgelaagde van cellen (figuur 2B).
Controleer of de geldigheid van de hNSC cultuur of fenotype van gedifferentieerde cellen, kan fluorescerende immunohistochemistry worden gebruikt. Nestin is een tussenliggende gloeidraad, meestal uitgedrukt in NSCs en kan worden gebruikt om te controleren of de hNSC cultuur (figuur 3A). Om te controleren of de aanwezigheid van neuronen na differentiatie, kan klasse III β-tubuline over het algemeen worden gebruikt om label neuronen (figuur 3B). Hoewel de priming stap is bedoeld voor het bereiken van een hoger percentage van neuronen na differentiatie, zal er nog steeds worden astrocyten in de cultuur. Gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) kan worden gebruikt om de astrocyten van de label om te kwantificeren welk percentage van gedifferentieerde cellen werd astrocyten of neuronen.
We vonden dat de lijn van de K048 van NSCs watertje septisch tegen zowel de Aziatische als de Afrikaanse stammen van ZIKV gedetecteerd door immunefluorescentie kleuring met een specifiek antilichaam ZIKV. De representatieve beelden worden weergegeven in Figuur 4. Mock infectie heeft niet het uitlokken van een verandering in hNSC morfologie of survival (figuur 4A, 4 C). ZIKV neigt te blijven in de perifere regio van een geïnfecteerde cel één dag post een 1-uur-infectie, maar vult de hele cel 3 tot 7 dagen (figuur 4B4 D, 4E). Merkbaar, met de dezelfde MOI (0.1), een geschatte besmettingsgraad van 5% in de K048 cellen is aanzienlijk lager dan die onlangs gemeld ZIKV infectie maximalehartslag (tot 80%) in de menselijke huid-geïnduceerde NSCs7. Deze studie, rapportage van 80% infectiviteit, gebruikt het prototype Afrikaanse stam van ZIKV (MR766) die een neurotrope fenotype tijdens meer dan 140 passages in muis hersencellen kan hebben aangepast.
Figuur 1: helder veld beelden van hNSC cultuur. (A-C) Representatieve helder veld foto's genomen op 10 X vergroting van hNSC cultuur 1, 4 en 9 dagen na passaging, respectievelijk. Schaal bars: 60 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: heldere veld beelden van aanhangend culturen. (A) representatieve helder veld foto's genomen op 10 X vergroting van aanhangend hNSC cultuur, 7 dagen na de beplating. (B) de vertegenwoordiger helder veld beelden genomen bij 10 X vergroting van aanhanger gedifferentieerde cellen na ELL priming en 9 dagen van differentiatie. Schaal bars: 60 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: TL beelden van hNSCs en gedifferentieerde culturen. (A) representatieve fluorescerende foto's genomen op 20 X vergroting van aanhangend hNSCs gekleurd met nucleaire markeringen, DAPI (blauw) en cel van de stam marker Nestin (rood). Schaal bar: 60 µm (B) vertegenwoordiger fluorescerende foto's genomen op 60 X vergroting van gedifferentieerde cellen gekleurd met neurale marker βIII-tubuline (groen), Astrocyt maker GFAP (rood) en nucleaire marker DAPI (blauw). Schaal bars: 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: ZIKV infectie in menselijke foetale hersenen-afgeleide NSCs. Menselijke NSCs werden ofwel Mock behandeld (A en C), geënt gedurende 1 uur met een stam van Afrikaanse afkomst van ZIKV bij de MOI 0.1 (B en D), of met een Aziatische stam van ZIKV onlangs geïsoleerd van muggen in Mexico in 2016 (E). Immunefluorescentie kleuring detecteert labeling van antilichamen van de ZIKV in NSCs op een tot zeven dagen post inoculatie (1 dpi in B, 7dpi in D en 3 dpi in E). Schaal 10 µm/omlaagbalken in A-D en 5 µm in E. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| DFHGPS media voor één T75 | 10 mL |
| TPPS * | 173 ΜL |
| 200 mM L-Glutamin | 50 ΜL |
| 10 mg/mL insuline ** | 25 ΜL |
| 20 µg/mL epidermale groeifactor | 10 ΜL |
| 20 µg/mL Basic fibroblast groeifactor | 10 ΜL |
| 10 µg/mL leukemie remmer factor | 10 ΜL |
| 5 mg/mL heparine | 10 ΜL |
| * Mengsel met 100 µg/mL transferrine, 100 µM-putresine, 20 nM progesteron en 30 nM Natriumseleniet. Het mengsel is gemaakt van geconcentreerde voorraden, en aliquots worden opgeslagen bij-80 ° C en preferablly gebruikt binnen 6 weken voorbereiding. De geconcentreerde voorraden zijn 10 mg/mL transferrine, 30 mM als putrescine, 10 µM progesteron en 15 µM Natriumseleniet opgeslagen bij-80 ˚C. | |
| ** Insuline wordt opgelost in 0,01 N hydroen chloride, gefilterd door 0,2 µM laag eiwitgehalte bindende filter, hanteren en opslaan in 4 ˚C tot 6 weken. | |
Tabel 1: groeifactoren voor nieuwe proliferatie Medium.
| dPBS * | 1 mLeen | 3 mLb |
| 10% glucose | 60 ΜL | 180 ΜL |
| 2,5% trypsine | 10 ΜL | 30 ΜL |
| DNase ** | 5 ΜL | 15 ΜL |
| * Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing | ||
| ** Deoxyribonuclease | ||
| een voor 10 miljoen cellen | ||
| b voor 30 miljoen cellen | ||
Tabel 2: Voorbereiding van trypsine.
| Geconditioneerde media | 1 mLeen | 3 mLb |
| Trypsine-remmers | 10 ΜL | 30 ΜL |
| een voor 10 miljoen cellen | ||
| b voor 30 miljoen cellen |
Tabel 3: Bereiding van trypsine-remmer.
| DFHGPS * | 0,7 mLeen | 2.1 mLb |
| FBS ** 20% | 0,2 mL | 0,6 mL |
| DMSO *** 10% | 0,1 mL | 0.3 mL |
| * DMEM met F12, HEPES, glucose, penicilline-streptomycine | ||
| ** Foetale runderserum | ||
| Dimethylsulfoxide | ||
| een voor 5 miljoen cellen in één flesje | ||
| b voor drie flesjes, 5 miljoen cellen/injectieflacon | ||
Tabel 4: bereiding van bevriezing medium.
| DFGHPS * voor een goed in een 24-well-plate | 1 mL |
| TPPS ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM L-glutamine | 5 ΜL |
| 10 mg/mL insuline | 2.5 ΜL |
| 20 µg/mL epidermale groeifactor | 1 ΜL |
| 10 µg/mL leukemie remmende factor | 1 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * Bevattende DMEM, F12, HEPES, glucose, penicilline-streptomycine | |
| ** Waarin 100 µg/mL transferrine, 100 µM putresine, | |
| 20 nM progesteron en 30 nM Natriumseleniet | |
Tabel 5: Bereiding van ELL priming medium.
| DFGHPS * voor een goed in een 24-well-plate | 1 mL |
| TPPS ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM L-glutamine | 5 ΜL |
| 10 mg/mL insuline | 2.5 ΜL |
| 20 µg/mL basis fibroblast groeifactor | 0,5 ΜL |
| 5 mg/mL heparine | 0,5 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * Bevattende DMEM, F12, HEPES, glucose, penicilline-streptomycine | |
| ** Waarin 100 µg/mL transferrine, 100 µM putresine, | |
| 20 nM progesteron en 30 nM Natriumseleniet | |
Tabel 6: Bereiding van FHL priming medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mogelijkheid om cultuur en manipuleren van hNSCs biedt een kritische tool die worden voor allerlei doeleinden gebruikt kan van het modelleren van ziekten bij de mens aan hoge doorvoer drug screening van10,11,12,14, 15,16,17. Veel vragen worden aangepakt zoals hoe menselijke foetale hersenen NSCs bleef of hun nageslacht zijn gevoelig aan ZIKV besmetting, of verschillende stammen van ZIKV NSCs met gelijke efficiëntie infecteren, en hoe de infectie tijdens de ontwikkeling van de neurale resulteert in microcefalie. Wij zijn gewend dat deze hNSC cultuur onderzoeken Zika virus geassocieerde Neuropathologie11,14. Met behulp van drie soorten cellen geïsoleerd uit drie individuele donoren, kunnen we ook individuele verschillen aan gevoeligheid voor de neurologische tekorten waargenomen volgende ZIKV infectie11moeten worden vergeleken. Een van de beperkingen van deze techniek is de toegankelijkheid van hNSC monsters en het geconditioneerde medium essentieel is voor de juiste cultuur. Om te omzeilen deze barrière, neem contact op met de overeenkomstige auteur te regelen van een materiële overdracht als de cellen die worden gebruikt in dit protocol niet commercieel beschikbaar zijn.
In vitro studies met hNSCs niet alleen unieke inzicht geven in de cel van de stam van het fundamentele gedrag, ze vormen ook een uitstekend platform om pre-klinisch onderzoek te verrichten. Echter, de technische uitdagingen van het kweken van hNSCs kunnen fungeren als een belemmering in het gebruik ervan als doeltreffend en reproduceerbare modellen. In dit protocol hebben we belangrijke stappen en methodologieën die kunnen worden gebruikt voor het verminderen van de variabiliteit in het kweken van methoden en opleveren van een gezond en stabiel hNSC cel van de stam cultuur geschetst. Een nadeel van het gebruik van hNSC neurosphere cultuur is dat de cellen uiterst gevoelig voor alle prikkels zijn. Zelfs met het gedetailleerde protocol hierboven is het cruciaal voor aandacht besteden aan hoeveel de kolven of gerechten van hNSCs worden behandeld, want de subtiele variaties op het protocol leiden veranderingen in het gedrag van de neurosphere tot kunnen.
De meest cruciale onderdeel van deze methoden papier is de cocktail van groeifactoren en voorbereiding van de verschillende media. Als de verdubbeling tijd van de hNSC-cultuur zeer laag is, of veel cellen adherie aan het vaartuig van de cultuur (wanneer ze moeten niet-aanhanger), de eerste stap is om ervoor te zorgen dat de factoren die de groei wordt gebruikt de juiste concentratie en niet is verlopen. Alle factoren die de groei in dit protocol hebben een zeer korte houdbaarheid eenmaal ontdooid (5-6 dagen). Wij hebben daarnaast gebruikt van factoren die de groei van meerdere bedrijven en merkte verschillen in de kwaliteit en concentratie nodig om te houden van de cultuur. Daarom raden we met behulp van de exacte groeifactoren gedetailleerd in de Tabel van de materialen. De passaging stap (stap 3.1-3.22) is ook een gemeenschappelijke oorzaak van fout. Als er veel dode cellen na de dissociatie, verminderen het aantal tijden van pipetteren op en neer om zich te distantiëren van de cellen, want teveel fysieke dissociatie leiden celdood tot kan. Als alternatief, als er vele clusters van cellen na de dissociatie stap, verhoging van de kracht of de aantal keren van pipetteren op en neer, als deze clusters zal snel worden grote bollen die niet levensvatbaar zijn in cultuur zal blijven. Als de cultuur goed onderhouden is, is infectie met ZIKV relatief eenvoudig.
Terwijl ZIKV infectie de behandeling gedetailleerde in dit protocol is, is het mogelijk deze hNSC cultuur om systeem te gebruiken voor een breed scala van studies. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om drugs scherm, individuele gevoeligheid onderzoeken en onderzoeken van de onderliggende mechanismen van allerlei ziekten en ontwikkelingsstoornissen14. Dit systeem is ook ideaal voor genomische studie omdat de gekweekte cellen zijn niet genetisch gemanipuleerd en weinig tot geen chromosomale afwijkingen, zelfs tot 80 passages10,11 tonen. Wij zijn van mening dat deze cultuur systeem is ideaal voor modellering in vitro hoe milieu prikkels zoals infectie, drugs, alcohol, toxinen, etc. kan invloed hebben op de ontwikkeling van het zenuwstelsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door fondsen van de John S. Dunn Foundation en het Instituut voor menselijke besmettingen en immuniteit van de Universiteit van Texas Medical Branch (PW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
