Summary
I denne artikel beskrives de metoder, der bruges til at udvide menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller i kultur, samt hvordan at differentiere dem i forskellige neuronal undertyper og astrocytter, med en vægt på brugen af neurale stamceller til at studere Zika virusinfektion.
Abstract
Menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller er et unikt ikke-genetisk modificerede modelsystem at studere virkningerne af forskellige stimuli på menneskelige udviklingsmæssige neurobiologi. Snarere end benytter en dyremodel eller genetisk modificerede inducerede pluripotente celler, giver humane neurale stamceller en effektiv in vitro- system for at undersøge virkningerne af behandlinger, skærmen narkotika, eller undersøge individuelle forskelle. Her, leverer vi detaljerede protokoller for metoder, der anvendes til at udvide menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller i kultur med serumfrit-medier, at differentiere dem i forskellige neuronal undertyper og astrocytter via forskellige priming procedurer, og at fryse og inddrive disse celler. Desuden, vi beskriver en procedure for at bruge menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller til at studere Zika virusinfektion.
Introduction
Zika virus (ZIKV) er en flavivirus overføres seksuelt, eller af myg vektorer Aedes aegypti og Aedes albopictus myg. ZIKV blev for nylig udpeget som en trussel mod alvorlige folkesundheden på grund af sin brugervenlighed transmission og tilknyttede neurologiske symptomer1. En af mest vedrørende neurologiske effekter er udviklingen af microcephalus i fostre født til inficerede gravide2,3. Microcephalus er en neurologiske udvikling lidelse, hvor hovedet er mindre end den typiske størrelse under fosterudviklingen og ved fødslen, med omkreds er mindre end 2 standardafvigelser under den gennemsnitlige4. Den mindre hovedomkreds er ofte ledsaget af en bred vifte af co-morbiditet udviklingsmæssige forsinkelser, anfald, vision og høretab og fodring problemer.
Nylige undersøgelser har brugt dyremodeller eller induceret pluripotente stamceller til at studere effekten af ZIKV infektion på nervesystemets udvikling5,6,7,8. Mens disse undersøgelser har bidraget til vores viden om ZIKV, brug af forskellige arter eller genetisk modificerede celler kan være tidskrævende og/eller tilføje yderligere variabler, der kan forvirre effekten af ZIKV på celler udvikling af neurale5, 6 , 7 , 8. vanskeligheder med hNSC kultur, især ikke-tilhænger neurosphere kultur beskrevet i denne protokol, er imidlertid, at kulturen er meget følsomme over for de metoder, der anvendes til at gennemføre kultur9. Enhver ændring i mellemstore komponenter, eller endog den fysiske håndtering af kultur fartøj, er nok til at fremkalde en reaktion fra celler9. For at løse disse problemer, udviklet vi en in vitro- humane fostrets hjerne-afledte neurale stamceller (hNSCs) kultur at mekanisk afhøre effekten af ZIKV på føtal neurale stamceller. Bruge vores metode, blev hNSCs opretholdt i over 80 passager uden tilsyneladende fænotypiske forandringer10. Derudover kromosomale ændringer som trisomi var enten ingen eller minimal11. Denne hNSC kultur vokser som en ikke-tilhænger neurosphere kultur. En fordel ved neurospheres er, at områderne skabe en unik miljømæssige niche i kultur, der er mere reflekterende i vivo nicher i forhold til to-dimensionelle kulturer9. En anden fordel ved denne protokol er, at flere celletyper kan være afledt fra hNSC kulturen, muliggør en investigator at observere effekten af en given variabel på hNSC overlevelse og differentiering. Denne protokol finder anvendelse på personer, der søger for at besvare mekanistiske spørgsmål vedrørende udvikling af centralnervesystemet eller dysfunktion. Følgende protokol beskriver hvordan du kan udvide en hNSC kultur for at inficere med ZIKV, og efterfølgende differentiere hNSCs for at observere virkningen af infektion på differentiering proces. Det omfatter også metoder til at gemme hNSCs for langvarige skik og differentiere hNSCs i forskellige typer for neuroner, der tillader yderligere undersøgelse af ZIKV-induceret underskud bidrager til hjernen misdannelse11. Vi mener, at denne protokol er også af interesse for efterforskere forsøger at forstå konsekvenserne af eventuelle miljømæssige stimuli som infektion eller toksiner på neurale stamceller overlevelse og differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelige neurale stamceller blev oprindeligt stammer fra kasserede menneskelige fostrets cortexes i den første trimester12. Alle procedurer i protokollen overholder University of Texas Medical gren etiske retningslinjer vedrørende brugen af menneskelige vævsprøver, og cellelinjer blev godkendt af Udvalget om institutionelle biosikkerhed.
1. bestanden medium forberedelse og stamceller opsving
- Forberede næringssubstratet lager (DFHGPS) ved at kombinere reagenser i trin 1.1.1.-1.1.5.
- Tilføje 210 mL Dulbeccos modificerede Eagle Medium med høje glukose og L-glutamin (D). Gemme det på 4 ˚C.
- Tilføje 70 mL Hams F12 næringsstof mix med L-Glutamin supplement (F). Gemme det på 4 ˚C.
- Tilføje 4,2 mL af 15 mM HEPES Buffer (H), og opbevar den ved stuetemperatur.
- Tilføje 4,2 mL 10% D-glucose løsning (G), og opbevar den ved stuetemperatur.
- Tilsættes 2,88 mL penicillin/streptomycin (PS)... Alikvot stamopløsning i 3 mL alikvoter og gemme alikvoter ved-20 ° C indtil det skal bruges.
Bemærk: Den endelige koncentration af penicillin i mediet bliver 100 enheder/mL, og koncentrationen af streptomycin vil være 100 µg/mL. Dette medie vil blive omtalt som DFHGPS for den resterende del af protokollen og skal opbevares ved 4 ° C til brug inden for 1-2 uger. Hvis det er nødvendigt, kan DFHGPS skaleres proportionelt.
- Dagen før celler er genoprettet, pels T75 kolben med 5 mL af konditioneret medium, fremstillet af tidligere kulturer hNSC cellelinje og forlader i et 37 ° C kuvøse med 8,5% kuldioxid (CO2) natten over.
Bemærk: Hvis i øjeblikket dyrkning hNSCs, gemme det medium, der celler har voksende i under en medium forandring. Dette er konditioneret medium, som det er blevet "konditioneret" af celler. Konditioneret medium kan gemmes i et skruelåg rør og opbevares ved 4 ° C i ca. 7 dage. Kontakt den tilsvarende forfatteren for at modtage hNSCs. Konditioneret medium foretrækkes, men ikke absolut nødvendige, især når først starter kulturen af hNSCs. - Dag i opsving, varm 20 mL af DFHGPS i en 50 mL skruelåg rør i et 37 ° C vandbad i mindst 10 min og holde det i vandbad indtil klar til brug.
- I en separat 15 mL skruelåg rør, varm 10 mL af DFHGPS i et 37 ° C vandbad i mindst 10 min og holde det i vandbad indtil klar til brug i trin 1.13.
- Hente en beholder med is og alle mellemstore komponenter (tabel 1). Tø alle mellemstore komponenter på isen og efterlade dem på isen mens forberedelserne til medium ændringen.
- Få 5 mL af konditioneret medium stock (opbevares ved 4 ° C) og holde det i et 37 ° C vandbad indtil klar til brug i trin 1.14. Se note efter trin 1.2, hvis der er ingen aircondition medium eller nuværende menneskelige føtal neurale stamceller kultur.
- Hente 50 mL skruelåg tube fra trin 1.3 og placere den i biosikkerhed kabinet (BSC). Overfør 10 mL af DFHGPS ind i en ny 15 mL skruelåg rør, og derefter placere 50 mL tube som indeholder de resterende 10 mL af DFHGPS medium tilbage i 37 ° C vandbad.
- Opnå en cryo-hætteglas af hNSCs gemt i flydende kvælstof. Se note efter trin 1.2, hvis der er ingen aktuelle menneskelige føtal neurale stamceller kultur.
Bemærk: Menneskelige neurale stamceller blev oprindeligt stammer fra kasserede menneskelige fostrets hjerne12 og vedligeholdes i kultur uden genetiske modifikationer10. 5 × 106 celler bør optøet og belagt på en T75 kolbe. Hver cryo-hætteglas bør indeholde 5 × 106 celler; Derfor er et hætteglas pr. flaske nødvendig. - Optø et hætteglas af celler i 37 ° C vandbad af invertere hætteglasset hver 10 s i ca. 1 min. eller indtil isen er smeltet og indholdet af hætteglasset er helt flydende. Ikke dykke hele hætteglasset under vand for at undgå risikoen for kontaminering.
- I BSC, skal du bruge en P1000 mikro-pipette Opsug den optøede celle løsning og tilføje det Dråbevist til 15 mL tube fra trin 1.7, som indeholder 10 mL af DFHGPS. For at tilføje optøede celle løsning Dråbevist, langsomt Tryk ned på stemplet således at kun en dråbe eller to er udgivet på én gang. I mellemtiden, swirl 15 mL tube for at tillade en hurtig blanding.
- Der centrifugeres cellesuspension ved 200 x g i 5 min ved stuetemperatur. Supernatanten og sørg for at bevare den celle pellet.
- Under trin 1.11, hente 50 mL tube indeholder de resterende 10 mL fra trin 1.7. Efter centrifugering, resuspenderes celle i 10 mL DFHGPS og centrifugeres igen ved 200 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Under den sidste spin, forberede nye vækstmediet af følgende tabel 1 at tilføje vækstfaktorer DFHGPS medium 10 ml fra BSC skridt 1.4 (tabel 1). Lad det nye medie, der indeholder vækstfaktorer i BSC indtil klar til brug.
- Hente T75 kolben fra trin 1.2 og kassér konditioneret medium belægning kolben ved aspiration. Derefter tilsættes 5 mL af konditioneret medier fra trin 1,6. kolben ved hjælp af en serologisk pipette. Vær omhyggelig med ikke at ridse i bunden af kolben.
- Hente røret af celler fra centrifugen og supernatanten ved sugning, forlader cellen pellet intakt.
- Resuspend celle pellet i 10 mL af nye medier fra trin 1.13 ved hjælp af 5 mL serologisk pipette og pipettering op og ned flere gange. Tilføje suspension coated T75 kolben fra trin 1.14. Brug de resterende 5 mL at skylle røret, der indeholdt celle pellet, og Tilføj derefter disse 5 mL til i kolben.
- Rock T75 kolben frem og tilbage 3 gange for at sikre, at cellerne er jævnt fordelt over kolben. Sørg for fælles landbrugspolitik af kolben er løs for at tillade luft flow. Under et lysmikroskop observere cellerne, gøre notater og tage billeder, hvis muligt.
Bemærk: Cellerne bør ser gennemskinnelig og kugleformet. Tjene en note, hvis der er celler at look mørk, uigennemsigtig, eller har asymmetrisk pensionærer, da dette kan indikere celledød. Også holde øje med eventuelle svampe- eller bakteriel forurening, som medierne bliver gul i farven. - Kolben celler i et 37 ° C kuvøse med 8,5% CO2.
Bemærk: Bruger 8,5% i stedet for 5,0% CO2 for at opretholde pH i dette serumfrit kultur medie i rækken af 7.1-7,4.
2. hNSC Medium forandring
Bemærk: Ændre medium hver 3-4 dage.
- Tænd BSC og rense grundigt med 70% ethanol. Observere celler under et lysmikroskop.
Bemærk: Gøre notater på udseendet af cellerne og sfære størrelser. Tre dage efter genopretning eller passage, vil celler klynge sammen og begynde at danne ikke-tilhænger neurospheres.
Forsigtig: Hvis celler overholder bunden af kolben, skal kulturen til at blive kasseret som celle tilslutning vil stige for tidlig differentiering og celler vil være i stand til at opretholde en stilk tilstand. Hvis der er for mange celler i kolben, cellerne kan danne store kugler (større end 2 mm i diameter) i hvilket tilfælde, celler i centrum af kuglen vil begynde at differentiere på grund af manglende adgang til vækstfaktorer i mediet. Hvis områder større end 1 mm i diameter er observeret, kan celler være passaged (trin 3.1-3.22). - Følg trin 1.4 og 1.5, og forberede 10 mL frisk medium (Se trin 1.13).
- Tilt kolbe til side, så kugler til at synke til bunds i kolben.
- Fjern 5 mL af konditioneret medier fra toppen af poolede medium ved hjælp af 5 mL serologisk pipette, pas på ikke for at Aspirér nogen neurospheres. Placer 5 mL af konditioneret medier ind i en ren 15 mL rør.
- Fjerne en ekstra 5 mL af konditioneret medier fra kolben, igen omhyggeligt undgår kugler, og placere 5 mL i den samme 15mL tube.
- Tilsættes 10 mL af nye medier fra trin 2.2 til de resterende 5 mL af konditioneret medier og celler i kolben. Sæt kolben fladt ned og observere celler under et lysmikroskop.
- Hvis det viser sig celler har været indsugning under indsamlingen af konditioneret medium, spin konditioneret medium på 100 x g i 5 min ved stuetemperatur. Genopslæmmes eventuelle celler, der ophobes på bunden i 1 mL af konditioneret medium, og føj dem derefter til kultur kolben.
- Gemme ubrugte konditioneret medier fra trappe 2,5/2.6 på 4 ˚C 10 mL i en 15 mL skruelåg tube.
- Gentag trin 1.17/1.18.
3. hNSC Passage
Bemærk: hNSCs skal være passage hver 9-11 dage hvis celler vokse normalt, som befolkningen fordobling tid er ca 3 dage13.
- Hvis udvide NSCs ind i en ny kolbe, Sørg for, at er alle nye kolber belagt i trin 1.2.
- Ren BSC som i trin 2.1, og udføre trin 1.4 og 1.5.
- Forberede medium som i trin 1.13. Hver T75 kolbe kræver 10 mL af medium. For flere T75 kolber, formere 10 mL af medierne efter antallet af kolberne.
- Forberede enten 1 eller 3 mL af Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (dPBS) og glukose og sted i et 37 ° C vandbad til at varme i 10 min (for trypsin løsning) Ifølge mængder i tabel 2. Tilføj ikke trypsin eller DNase på dette tidspunkt. DNase kan være nødvendigt at nedbryde enhver DNA frigivet fra de døde celler på grund af mekaniske eller kemiske celle dissociation.
Bemærk: For en T75 kolben passaged efter 9-10 dage af vækst der bliver ca 30 × 106 celler, hvis 5 × 106 blev oprindeligt seedede på kolben. 1 mL af dPBS løsning bruges typisk til 10 × 106 celler. Derfor, 3 mL af dPBS løsning er nødvendig for en T75 kolben passaged efter 9-10 dage. - Sted ren små veje båd og hemocytometer i emhætten. Rengør med 70% ethanol og lad lufttørre i hood i ca 5 min.
Bemærk: Vejer båden vil blive brugt i trin 3.17.1. - Hente kolbe af celler, der vil være passaged fra rugemaskinen og bringe i BSC. Tilt kolbe forsigtigt tillader cellerne at synke til bunds i de poolede medier. Der er ca. 15 mL medier i kolben.
- Fjerne ca. 10 mL af medier i 5 mL portioner (dvs. 5 mL + 5 mL). Placer denne 10 mL af medier ind i en ren 15 mL rør mærket "CM" til "konditioneret medium". Vær omhyggelig med ikke at Aspirér nogen af de celler, der bosatte sig i de resterende 5 mL af medier i kolben; disse celler og 5 mL af medier vil blive udsat for trin 3.8.
- Tag 3 mL af konditioneret medier fra "CM" tube (fra trin 3.7) og sted i en 15 mL rør mærket "trypsin hæmmer løsning". Dette vil blive brugt i trin 3.12. Efter fjernelse af 3 mL er der 7 mL konditioneret medier tilbage i "CM" rør. Braklægning "CM" røret indtil trin 3.9.
- Fjern 5 mL af medier og celler forbliver i T75 kolbe, og anbringes i en ren 15 mL tube mærket "Celler".
- Tage "CM" rør indeholdende 7 mL af konditioneret medier (fra trin 3.7.1) og skyl i bunden af T75 kolben to gange med 3,5 mL portioner af konditioneret medier, ved hjælp af 5 mL serologisk pipette. Efter hvert skyl, skal du placere 3,5 mL portioner ind i "Celler" rør. Formålet med dette trin er at fjerne alle neurospheres (celler) fra T75 kolben.
- Der centrifugeres "Celler" røret på 100 x g i 5 min ved stuetemperatur. Mens celler er spinning, få dPBS/glucose løsning fra 37 ° C vandbad og tilføje den passende mængde af trypsin og DNase ifølge tabel 2.
- Efter "Celler" tube har stoppet spinning, fjerne alle konditioneret medium supernatanten og overføre til "CM" rør.
- Tag det rør mærket "trypsin hæmmer løsning" fra trin 3.7.1. og tilføje volumen af trypsin hæmmer angivet i tabel 3. Brug den samme mængde af trypsin hæmmer løsning, som blev brugt til trypsin løsning.
- Placer trypsin hæmmer løsning i 37 ° C vandbad indtil det skal bruges.
- Tilføje trypsin løsning til celle træpiller i 15 mL tube og pipetteres op og ned omkring 5 - 10 gange med 5 mL pipette. Luk hætten af røret og Inkuber i et 37 ° C vandbad i 5 min. Efter 5 min, hente cellerne og pipetteres op og ned 5 - 10 gange. Derefter inkuberes i 37 ° C vandbad i en yderligere 10-15 min.
- Flyt trypsin hæmmer løsning i de sidste 5 min, til BSC.
- Hente cellerne efter trin 2.14 er komplet og afpipetteres cellerne op og ned indtil kugler er helt adskilt (20 - 30 gange). Derefter straks tilføje trypsin hæmmer løsning og pipetteres op og ned 10 gange. Denne løsning af dissocierede celler og trypsin hæmmer vil blive omtalt som "cellesuspension".
- Tæl antallet af celler i en cellesuspension ved at følge trin.
- Afpipetteres 15 µL af Trypan blå pre blanding (indeholdende 5 µL af 0,4% Trypan blå og 10 µL af dPBS) en lille vejer båden, og derefter tilsættes 5 µL af cellesuspension. Pipetteres op og ned 3 - 5 gange til mix. Derefter afpipetteres 10 µL af Trypan blå/cellesuspension på begge sider af et hemocytometer dækket med et glas coverslip.
- Observere celler under et lysmikroskop og tæller antallet af celler i hver af de fire hjørne gitre. Tilføje disse tal sammen.
- Gentag optællingen for anden siden og gennemsnitlig de to sider sammen.
- Multiplicer dette nummer af 10.000 at give antallet af celler pr. mL. Multiplicer dette nummer af det samlede antal milliliter til at beregne det samlede antal celler i en cellesuspension. Beregne hvor meget mængden af cellesuspension vil være nødvendigt at frø 5 millioner celler pr. T75 kolbe.
Bemærk: Efter 9-10 dage, en T75 vil har typisk 25-30 × 106 celler. Derfor, hvis passaging alle celler i nye flasker, i alt 5-6 flasker er nødvendig. - Tilføje volumen af cellesuspension beregnet i trin 3.19 til hver T75 kolbe at opnå 5 × 106celler pr. flaske. Hvis diskenheden er mindre end 5 mL, tilføje yderligere betingelse medium til at gøre op til i alt 5 mL. Derefter Kolben tilsaettes 10 mL af nye DFHGFPS medier indeholdende vækstfaktorer (tabel 1).
- Gentag trin 1.17 og 1.18 og sikre, at kolben er mærket med typen celler, datoer, antallet af celler i kolben og passage antallet (dette er antallet gange cellen har været passaged). Derefter gå til trin 4-9.
- Hvis nødvendigt, frø ekstra celler ind i en T75 kolben på tætheden op til 30 × 106celler pr. kolbe natten over, og fryse den næste dag efter trin 4.
4. hNSC frysning og opbevaring
- Dagen efter passaging, hente kolben fra rugemaskinen der indeholder celler til frysning (fra trin 3.19 og 3.22). Vippe kolben og fjerne alle medium og celler fra kolben og sted i en 15 mL tube. Derefter centrifugeres tube på 216 x g i 5 min.
- Under centrifugering skal forberede indefrysning medium (tabel 4). For hver 5 × 10 forberede6 celler 1 mL af indefrysning medium. Antallet af celler blev fastsat i trin 3.19 når bestemme hvor mange celler til at sætte i hver kolbe. Dette tal vil ikke have ændret natten over.
- Forberede cryo-Bevar hætteglas med etiketter af cellenavn, passage nummer, celle nummer, initialer og dato. Efter centrifugering, Fjern supernatanten ved aspiration og genopslæmmes celle pellet i frysning medium, således at der er 5 × 106 celler/mL. Bruger 5 mL pipette, alikvot 1 mL pr. hætteglas og segl stramt (5 × 106 celler pr. hætteglas).
- Anbring hætteglas i en cryo-Bevar beholder med 250 mL isopropanol (max forbrug 5 gange pr. udskiftning af isopropanol). Gemme i-80 ° C fryser natten over, og derefter overføre til et flydende kvælstof tank storagesystem.
5. plating vedhængende hNSC for godkendelse
- Dagen før passaging (trin 3.1-3.22), ren BSC som i trin 2.2, og opnå en 24-godt plade og sterilt glas 12 mm coverslips.
- Brug af pincet, placere en enkelt coverslip i bunden af hvert hul i pladen.
- Coat de brønde, der indeholder dækning underkjoler med 0,01% poly-D-lysin (PDL) i sterilt vand og Inkuber i 1 time på 37 ˚C. For en 24-godt plade, skal du bruge 250 μL af PDL pr. brønd.
- Fjerne PDL fra brøndene, og derefter pels med 1 µg/cm2 laminin/dPBS (250 μl pr. brønd). Inkuber plade natten over ved 37 ° C. Hvis ikke behov for den næste dag, forsegle pladen med parafilm af indpakning parafilm rundt i kanten af pladen og opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: Plader overtrukket med laminin kan lagres til 2 uger hvis forseglet med parafilm så længe coveret underkjoler ikke tør. - Passage celler som beskrevet i trin 3.1-3.22, og derefter bestemme antallet af celler til frø i 24-godt pladen med coated coverslips.
- Fjern eventuelle overskydende laminin løsning fra brønde gennem aspiration, og skyl en gang med 0,5 mL af dPBS. Derefter seed celler i brønde med en tæthed på 0,6-1 x 105 celler/cm2 pr. brønd. Bruge enhver resterende celler efter trin 3.16-3.21.
- Atvarious gange under den 24-godt plade kultur, fix og plette celler til forskellige stamceller markører efter trin 9.
6. selvansugende for at opnå GABA og glutamat neuroner
- Passage celler som beskrevet i 3.1-3.22, og derefter bestemme antallet af celler til frø til en 24-godt plade som i trin 5.6.
- Dagen før grunding, forberede dække underkjoler og frakke plade som beskrevet i trin 5.1-5.4.
- Priming dag, hente kolber med 2-3-dages celler. Sted i en 15 mL tube og sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 100 x g i 5 min.
- Forberede epidermal vækstfaktor/leukæmi hæmmende faktor/laminin (ELL) priming medium ifølge tabel 5.
- Resuspend celler med ELL medium.
- Frø suspenderet celler ind i en 24-godt plade (Følg trin 5.6).
7. priming at opnå motoriske neuroner
- Følg trin 6.1-6.4.
- Forberede basic fibroblast vækstfaktor/Heparin/Laminin (FHL) priming medium ifølge tabel 6.
- Følg trin 5.6.
8. Zika Virus infektion
Bemærk: ZIKV er meget følsomme over for temperatur, så det er bydende nødvendigt, at ZIKV materiel opbevares ved - 80 ° C og fryse/optøning cyklusser undgås. Holde arbejde delprøver på is.
- Passage celler som beskrevet i trin 3.1-3.22. 3-4 millioner celler i alt er nødvendige for at frø en 24-godt plade, derfor når passaging, sætter antallet af celler brug for infektion og såning i en kolbe, når passaging.
- Hvis såning celler ind i en 24-godt plade til farvning, forberede coverslips og plade efter trin 5.1-5.4.
- Efter passaging, skal du placere 1 mL cellesuspension fra trin 8.2 til en 1,5 mL microcentrifuge rør, og der centrifugeres ved 200 x g ved stuetemperatur i 5 min. Derefter Fjern supernatanten ved aspiration.
- Resuspend pellet fra trin 8.3 på ZIKV lager til at erhverve en mangfoldighed af infektion (MOI) i enten 1 til 10. Mængden af ZIKV løsning bør ikke overstige 0,5 mL. Mock behandling (kontrol celler), resuspend celler i samme mængde og type af mediet bruges på ZIKV lager.
Bemærk: ZIKV stock forberedelse og infektion er nærmere beskrevet i en tidligere publikation11. Mock infektioner er også udført med medium. - Ruger over celle/ZIKV blanding ved 37 ° C for 1 h. Vend røret 2 - 3 gange, og derefter centrifugeres blandingen i 5 min på 216 x g ved stuetemperatur til at fremskaffe en celle pellet. Resuspend pellet i dPBS og centrifugeres igen i 5 min på 216 x g ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten ved aspiration, resuspend celler med passende medium, og indlæse inficerede celler i kolben eller plade til eksperimentet. Hvis såning cellerne i en 24-godt plade resuspenderes i 12 mL af passende medium, og derefter tilføje 500 μL af suspension til hver brønd.
Bemærk: på dette tidspunkt enten opretholde celler i vækst medier til at observere effekter af ZIKV på stamceller, eller gå til trin 6 eller 7 at studere effekten af ZIKV på differentiering proces.
9. farvning procedure
- For at løse cellerne, fjerne medium, skylles en gang med 0,5 mL pr. brønd (24-godt plade) af is kold fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Fjern PBS, og dække celler med 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD i PBS og forlade ved stuetemperatur for 20-30 min.
- Fjerne PARAFORMALDEHYD og skyl celler tre gange med 0,5 mL PBS, forlader den tredje PBS skyl på i 10 min. ved stuetemperatur.
- På dette tidspunkt enten forlader PBS om natten og gemme plade på 4 ˚C, eller begynde farvning efter 10 min. Skyl.
- Efter 10 min PBS skylles, blokere cellerne i 45-60 min i stationær stilling med en 0,5 mL opløsning af 5% normal ged serum (NGS), 0,3% bovint serumalbumin (BSA), 0,25% Triton X-100 i Tris-bufferet saltvand (TBS). For eksempel, at gøre 1 mL blokerende løsning brug: 10 µL af 25% Triton X-100, 50 µL af 100% NGS og 100 µL af 3% BSA blandet i 840 µL af TBS.
- Under trinnet blokerende forberede den primære antistof løsning, og sørg for alle reagenser opbevares på is. Til validering af hNSCs, kan proteiner som Nestin rettes ved hjælp af den relevante antistof mod dem. For at validere ZIKV infektion, bruge et antistof mod ZIKV frakke protein11. For differentiering, skal du bruge markører som klasse III β-tubulin for at identificere neuronal populationer, mens glial fibrillære sure protein (GFAP) kan bruges til at identificere astrocytter. Koncentrationerne af primære antistoffer bestemmes empirisk afhængigt af leverandør og masse. Vi har brugt de fleste antistoffer fra 1: 100 til 1: 2000 fortynding.
- Centrifugeres den primære antistof på 12.000 x g i 2 min. ved 4 ° C, og derefter foretage en fortynding; f.eks. for at gøre en 1:1000 fortynding af antistof, tilføje 7,2 µL af ønskede antistof til 7,2 mL 0,25% Triton X-100 i TBS.
- Tilsæt ca 300 µL antistof løsning til hver brønd med en 24-godt plade, og Inkuber celler med primær antistof i stationær stilling i 2 timer ved stuetemperatur eller på 4 ˚C overnatning i stationær stilling.
- Efter inkubation, vaske cellerne med 0,5 mL af TBS tre gange ved stuetemperatur i 10 min i en stationær position.
- Centrifugeres den sekundær antistof på 12.000 x g i 2 min. ved 4 ° C, derefter fortyndes i 0,25% Triton X-100/TBS løsning. Gøre nok antistof løsning for at tilføje 300 µL til hver brønd. Her, fortyndes fluorescerende sekundære antistoffer 1: 500 (figur 3).
- Efter de endelige TBS vaske, tilsæt 300 µL af opløsningen sekundær antistof til hver brønd og Inkuber i mørke i 1 time ved stuetemperatur i en stationær position. Fra dette punkt på skal alle trin finde sted i et mørkt rum.
- Cellerne vaskes tre gange med TBS for 10 min i en stationær position.
- I løbet af de sidste 10 min vask, fortyndes den nukleare markør DAPI nukleare pletten til den anbefalede koncentration i TBS (typisk 1:1,000 - 1:5, 000). Gøre nok løsning for at tilføje 300 µL til hver brønd.
- Efter den sidste vask, tilsæt 300 µL af DAPI løsning til hver brønd og Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur i en stationær position. Derefter vaskes en gang med 0,5 mL af TBS.
- Bruge en anti-fade montering medium til fluorescens og 1 dråbe (10-15 µL) pr. coverslip, der vil blive lagt på diaset. Omhyggeligt bruge pincet til at fjerne coverslips fra 24-godt plade brønde og placere celleoverfladen ned på montering medium drop på diaset.
- Når coverslips er placeret på diaset, skal du placere diaset i en flad diasholderen. Sørg for at mærke dias vil alle relevante oplysninger nødvendige for at identificere celler på diaset, derefter dække indehaveren med aluminiumsfolie for at holde dias beskyttet mod lys.
- Gemme diasene på 4 ˚C og tillade montering medium at størkne natten over. Den følgende dag, observere dias ved hjælp af en epifluorescerende mikroskop med UV-2E/C filter (340-380 nm), normal god landbrugspraksis HYQ BP filteret (450-490 nm) eller Y-2E/C Texas rødt filter (540-580 nm), 20 X forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kulturperler hNSCs i deres proliferativ fase vil vokse som ikke-tilhænger neurospheres (figur 1). Umiddelbart efter hNSC passage, vil der være mange individuelle celler, som vil samle og begynde at form kugler i de næste par dage (figur 1A og 1B). Sunde områder bør være ca 1-2 mm i diameter 9-10 dage efter en passage (figur 1 c). Kugler, der vokser sig større end 2 mm vil udvikle en mørk center og vækstfaktorer i mediet vil ikke kunne nå cellerne i centrum af den kugle, der resulterer i uønskede differentiering. Sund kugler vises gennemsigtigt og vise pseudo cilia omkring kanterne af området (figur 1 c).
Plating neurospheres på en vedhængende overflade til farvning formål vil resultere i vækst af vedhængende kugler (figur 2A). Disse kugler vil berøre overfladen af kultur fartøj og har nogle fremskrivninger strækker ud på overfladen af fartøjet, samtidig opretholde en central kugle (figur 2A). Priming og differentiere cellerne kræver celler til at overholde en cover slip i bunden af en celle kultur plade, såsom en 24-godt plade. Efter egnede grunding trin og tilsætning af differentiering medium, vil cellerne spredt over hele overfladen af kultur fartøj og vokse som sammenkoblede éncellelag af celler (figur 2B).
Du kan enten bekræfte gyldigheden af hNSC kulturen eller Fænotypen af differentierede celler, kan fluorescerende Immunhistokemi bruges. Nestin er en mellemliggende glødetrådens almindeligvis udtrykt i NSCs og kan bruges til at kontrollere hNSC kultur (figur 3A). For at kontrollere tilstedeværelsen af neuroner efter differentiering, bruges klasse III β-tubulin generelt til at afmærke neuroner (figur 3B). Selv om priming trin bruges til at opnå en højere procentdel af neuroner efter differentiering, vil der stadig være astrocytter i kulturen. Glial fibrillære sure protein (GFAP) kan bruges til at afmærke astrocytter for at kvantificere hvilken procentdel af differentierede celler blev astrocytter eller neuroner.
Vi fandt, at K048 linjen i NSCs var inficeret af afrikanske og asiatiske stammer af ZIKV opdaget af immunfluorescent farvning med et specifikt ZIKV antistof. Repræsentative billederne er vist i figur 4. Mock infektion ikke fremkalde en ændring i hNSC morfologi eller overlevelse (figur 4A, 4 C). ZIKV tendens til at bo i den perifere region af en inficeret celle en dag post en 1-times infektion, men fylder hele cellen på 3-7 dage (figur 4B4 D, 4E). Mærkbart, med den samme MOI (0,1), en anslået 5% infektion sats i K048 celler er betydeligt lavere end dem, der for nylig rapporteret ZIKV infektion sats (op til 80%) i human hud-induceret NSCs7. Denne undersøgelse, rapportering 80% smitteevne, brugt prototype afrikanske stamme af ZIKV (MR766), der kan have tilpasset en neurotropic fænotype under over 140 passager i mus hjerneceller.
Figur 1: lysfelt billeder af hNSC kultur. (A-C) Repræsentative lysfelt billeder taget ved 10 X forstørrelse af hNSC kultur 1, 4 og 9 dage efter passaging, henholdsvis. Skalere barer: 60 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: lysfelt billeder af vedhængende kulturer. (A) repræsentative lysfelt billeder taget ved 10 X forstørrelse af vedhængende hNSC kultur, 7 dage efter plating. (B) repræsentative lysfelt billeder taget ved 10 X forstørrelse af tilhænger differentierede celler efter ELL priming og 9 dage af differentiering. Skalere barer: 60 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fluorescerende billeder af hNSCs og differentieret kulturer. (A) repræsentative fluorescerende billeder taget ved 20 X forstørrelse af vedhængende hNSCs farves med nukleare markør, DAPI (blå) og stamceller markør Nestin (rød). Skalalinjen: 60 µm (B) repræsentative fluorescerende billeder taget ved 60 X forstørrelse af differentierede celler farves med neurale markør βIII-tubulin (grøn), astrocyte maker GFAP (rød) og nukleare markør DAPI (blå). Skalere barer: 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ZIKV infektion i menneskelige fostrets hjerne-afledte NSCs. Menneskelige NSCs blev enten falsk behandlet (A og C), podes i 1 time med en afrikansk afstamning stamme af ZIKV på MOI af 0,1 (B og D), eller med en asiatisk stamme af ZIKV seneste isoleret fra myg i Mexico i 2016 (E). Immunfluorescent farvning registrerer mærkning af ZIKV antistoffer i NSCs på en til syv dage post podning (1 dpi i B, 7dpi i D og 3 dpi i E). Skala barer 10 µm i A-D og 5 µm i E. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| DFHGPS media for én T75 | 10 mL |
| TPPS * | 173 ΜL |
| 200 mM L-Glutamin | 50 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin ** | 25 ΜL |
| 20 µg/mL Epidermal vækstfaktor | 10 ΜL |
| 20 µg/mL Basic fibroblast vækstfaktor | 10 ΜL |
| 10 µg/mL leukæmi hæmmer faktor | 10 ΜL |
| 5 mg/mL Heparin | 10 ΜL |
| * Blanding indeholdende 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine, 20 nM progesteron og 30 nM natrium selenite. Blandingen er lavet af koncentreret bestande, og delprøver opbevares ved-80 ° C og preferablly anvendes inden for 6 uger forberedelse. De koncentrerede bestande er 10 mg/mL transferrin, 30 mM putrescine, 10 µM progesteron og 15 µM natrium selenite gemt på-80 ˚C. | |
| ** Insulin opløses i 0,01 N hydroen chlorid, filtreret gennem 0,2 µM lavt proteinindhold bindingsfilter, og opbevares ved 4 ˚C i op til 6 uger. | |
Tabel 1: vækstfaktorer for nye spredning Medium.
| dPBS * | 1 mLen | 3 mLb |
| 10% glukose | 60 ΜL | 180 ΜL |
| 2,5% trypsin | 10 ΜL | 30 ΜL |
| DNase ** | 5 ΜL | 15 ΜL |
| * Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning | ||
| ** Deoxyribonuclease | ||
| en for 10 millioner celler | ||
| b for 30 millioner celler | ||
Tabel 2: Forberedelse af trypsin.
| Konditioneret medier | 1 mLen | 3 mLb |
| Trypsin hæmmer | 10 ΜL | 30 ΜL |
| en for 10 millioner celler | ||
| b for 30 millioner celler |
Tabel 3: Forberedelse af trypsin hæmmer.
| DFHGPS * | 0,7 mLen | 2.1 mLb |
| FBS ** 20% | 0,2 mL | 0,6 mL |
| DMSO *** 10% | 0,1 mL | 0,3 mL |
| * DMEM, F12, HEPES, glukose, penicillin-streptomycin | ||
| ** Føtal bovint serum | ||
| Dimethylsulfoxid | ||
| en for 5 millioner celler i et hætteglas | ||
| b for tre hætteglas, 5 millioner celler/hætteglas | ||
Tabel 4: forberedelse af indefrysning medium.
| DFGHPS * for et godt i en 24-godt plade | 1 mL |
| TPPS ** | 17,3 ΜL |
| 200 mM L-glutamin | 5 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin | 2,5 ΜL |
| 20 µg/mL Epidermal vækstfaktor | 1 ΜL |
| 10 µg/mL leukæmi hæmmende faktor | 1 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * Indeholdende DMEM, F12, HEPES, glukose, penicillin-streptomycin | |
| ** Indeholdende 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine, | |
| 20 nM progesteron og 30 nM natrium selenite | |
Tabel 5: Forberedelse af ELL priming medium.
| DFGHPS * for et godt i en 24-godt plade | 1 mL |
| TPPS ** | 17,3 ΜL |
| 200 mM L-glutamin | 5 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin | 2,5 ΜL |
| 20 µg/mL basic fibroblast vækstfaktor | 0,5 ΜL |
| 5 mg/mL Heparin | 0,5 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * Indeholdende DMEM, F12, HEPES, glukose, penicillin-streptomycin | |
| ** Indeholdende 100 µg/mL Transferrin, 100 µM putresine, | |
| 20 nM progesteron og 30 nM natrium selenite | |
Tabel 6: Forberedelse af FHL priming medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til at kultur og manipulere hNSCs giver et kritisk værktøj, der kan bruges til mange forskellige formål fra modellering menneskelig sygdom at høj overførselshastighed stof screening10,11,12,14, 15,16,17. Mange spørgsmål forblev for at blive behandlet som hvordan menneskelige fostrets hjerne NSCs eller deres afkom er modtagelige for ZIKV infektion, om forskellige stammer af ZIKV inficere NSCs med samme effektivitet, og hvordan infektion under neurale udvikling resulterer i mikrocefali. Vi har brugt denne hNSC kultur til at undersøge Zika virus forbundet neuropatologiske11,14. Ved hjælp af tre stammer af celler isoleret fra tre individuelle donorer, er vi også mulighed for at sammenligne individuelle forskelle i forhold til modtagelighed for den neurologiske underskud observeret følgende ZIKV infektion11. En af begrænsningerne af denne teknik er adgangen til hNSC prøver og konditioneret medium afgørende for ordentlig kultur. For at omgå denne hindring, kontakt venligst de tilsvarende forfatteren for at arrangere en væsentlig overførsel som de celler, der bruges i denne protokol ikke er kommercielt tilgængelige.
In vitro undersøgelser ved hjælp af hNSCs ikke kun giver unikt indblik i grundlæggende stamcelle adfærd, de giver også en fremragende platform til at foretage præ-klinisk forskning. Men de tekniske udfordringer ved dyrkning hNSCs kan tjene som en hindring i at bruge dem som effektiv og reproducerbare modeller. I denne protokol, har vi skitseret vigtigste skridt og metoder, som kan bruges til at reducere variation i dyrkning metoder og give en sund og stabil hNSC stamceller kultur. En ulempe ved at bruge hNSC neurosphere kultur er, at cellerne er ekstremt følsomme over for alle stimuli. Selv med den detaljerede protokollen ovenfor er det kritisk at betale meget opmærksom på hvor meget håndteres kolber eller retter af hNSCs, som de fineste variationer på protokollen kan medføre ændringer i neurosphere adfærden.
Den mest afgørende del af denne metoder papir er cocktailen af vækstfaktorer og forberedelse af de forskellige medier. Hvis den fordobling tid af hNSC kulturen er meget lav, eller mange celler adherie til kultur fartøj (når de skal være ikke-tilhænger), det første skridt er at sikre, at de vækstfaktorer, der bliver brugt er den passende koncentration og ikke er udløbet. Alle vækstfaktorer i denne protokol har en meget kort holdbarhed når optøet (5-6 dage). Derudover har vi brugt vækstfaktorer fra flere firmaer og lagde mærke til forskelle i kvalitet og koncentration, der kræves for at opretholde kulturen. Derfor, vi varmt anbefale at bruge de nøjagtige vækstfaktorer detaljeret i Materialer tabel. De passaging trin (trin 3.1-3.22) er også en fælles kilde til fejl. Hvis der er mange døde celler efter dissociation proces, reducere antallet af gange af pipettering op og ned for at adskille cellerne, som for meget fysisk dissociation kan føre til celledød. Alternativt, hvis der er mange klynger af celler efter trinnet dissociation, stigning vigor eller antal gange af pipettering op og ned, som disse klynger vil hurtigt blive store kugler, der ikke forbliver levedygtige i kultur. Hvis kultur er korrekt vedligeholdt, er infektion med ZIKV relativt ligetil.
Mens ZIKV infektion er behandlingen detaljeret i denne protokol, er det muligt at bruge denne hNSC kultur system for en bred vifte af undersøgelser. Denne modelsystem kan bruges til at screene narkotika, undersøge individuel modtagelighed og undersøge underliggende mekanismer af en række sygdomme og udviklingsforstyrrelser14. Dette system er også ideel til genomisk undersøgelser, da de dyrkede celler ikke er blevet genetisk manipuleret og vise lidt at ingen kromosomafvigelser, helt op til 80 passager10,11. Vi mener, at denne kultur system er ideelt til modellering i vitro hvordan miljømæssige stimuli som infektion, narkotika, alkohol, toksiner, etc. kan påvirke udviklingen af nervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra John S. Dunn Foundation og Institut for Human infektioner og immunitet af University of Texas Medical gren (P.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
