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Developmental Biology

Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

doi: 10.3791/56919 Published: January 2, 2018

Summary

Complexidade dos sistemas na vivo torna difícil distinguir entre a ativação e a inibição do receptor do entalhe por trans- e cis-ligantes, respectivamente. Aqui, apresentamos um protocolo baseado em vitro ensaios de agregação de célula para avaliação qualitativa e semi-quantitativa da vinculação de entalhe de Drosophila Trans-ligantes vs cis-ligantes.

Abstract

Entalhe de sinalização é um sistema de comunicação célula-célula evolutivamente conservada usado amplamente no desenvolvimento animal e manutenção de adulta. Interação do receptor Notch com ligantes de vizinhas células induz a ativação da via de sinalização (trans-ativação), enquanto a interação com ligantes da mesma célula inibe a sinalização (cis-inibição). Equilíbrio adequado entre trans-ativação e cis-inibição ajuda a estabelecer os níveis ideais de entalhe sinalização em alguns contextos durante o desenvolvimento do animal. Por causa dos domínios de expressão sobreposição de entalhe e seus ligantes em muitos tipos de células e a existência de mecanismos de feedback, estudando os efeitos de uma determinada modificação pós-traducional na trans- contra cis-interações de entalhe e seus ligantes na vivo é difícil. Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de células de Drosophila S2 em célula-agregação ensaios para avaliar os efeitos de derrubar um modificador de via Notch na ligação de entalhe para cada ligante trans e cis. Células S2 estàvel ou transitoriamente transfectadas com um vetor de entalhe-expressando são misturadas com células expressando cada ligante de entalhe (S2-Delta ou S2-Serrate). Trans-ligação entre o receptor e ligantes resulta na formação de agregados de células heterotypic e é medido em termos de número de agregados por mL, composto de > 6 células. Para examinar o efeito inibitório do cis-ligantes, S2 células expressando co entalhe e cada ligante são misturadas com células S2-Delta ou S2-Serrate e o número de agregados é quantificado como descrito acima. A diminuição relativa do número de agregados devido à presença de cis-ligantes fornece uma medida de cis-ligand-mediados por inibição da trans-ligação. Estes ensaios simples podem fornecer dados semi quantitativos sobre os efeitos de manipulações genéticas ou farmacológicos na ligação de entalhe para seus ligantes e podem ajudar a decifrar os mecanismos moleculares subjacentes os efeitos na vivo de tais manipulações na sinalização Notch.

Introduction

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Canônico de sinalização Notch é um mecanismo de comunicação de curto alcance de célula para célula que exige contato físico dos vizinhos células para facilitar a interação entre receptores Notch e seus ligantes1. Interação do receptor do entalhe (presente na superfície das células do sinal de recepção) com ligantes (presentes na superfície de sinal-enviando células) inicia sinalização Notch e é conhecida como trans-ativação2. Por outro lado, a interação entre entalhe e seus ligantes na mesma cela leva à inibição da via de entalhe de e é conhecida como cis-inibição3. O equilíbrio entre trans- e cis-interações é necessária para garantir o ideal Notch ligante-dependentes, sinalização4. Drosófila tem um receptor do entalhe e dois ligantes (Delta e Serrate) ao contrário de mamíferos, que têm quatro receptores Notch e cinco ligantes [irregulares 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 e DLL4]5. Tendo esta simplicidade, o modelo de Drosophila oferece a facilidade para dissecar/estudo os efeitos dos modificadores de percurso em interações de entalhe-ligante e, posteriormente, na sinalização Notch. Em determinados contextos durante o desenvolvimento animal (incluindo desenvolvimento de asa em drosófila), ambos de cis- e trans-interações envolvidas para alcançar a sinalização adequada do entalhe e célula de destino1,6 . É importante distinguir os efeitos dos modificadores de via Notch nestes contextos na cis- e trans-interações de entalhe com seus ligantes.

Nosso grupo relatado anteriormente que a adição de um resíduo de hidrato de carbono chamado xilose de Drosophila entalhe negativamente regula entalhe sinalização em determinados contextos, incluindo asa desenvolvimento7. Perda de Souza (a enzima que xylosylates entalhe) leva a um fenótipo de "perda da veia da asa"7. Mais recentemente, experimentos de dosagem de gene e clonal análise foram utilizados para mostrar que perda de Souza realça recordando, mediada por Delta entalhe. Para distinguir se a sinalização reforçada de entalhe em mutantes de Souza é um resultado da diminuição da cis-inibição ou aumento trans-ativação, estudos de gravidez ectópica superexpressão de ligantes Notch em discos imaginária asa larval usando o driver de dpp-GAL4 foram realizadas. Estas experiências fornecidas provas sugerindo que Shams regula trans-ativação de entalhe por Delta sem afetar o entalhe cis-inibição por ligantes8. No entanto, feed-back regulamentos e efeitos de ligantes endógenos podem complicar a interpretação dos estudos de superexpressão ectópica1,6,9.

Para resolver esse problema, células de Drosophila S210 foram usados, que preveem um sistema simples em vitro entalhe-ligante interação estudos11,12. Células de S2 não express endógena do receptor do entalhe e Delta ligante11 e expressar um nível baixo de serrilhado,13, que não afeta o entalhe-ligante agregação experimentos8. Portanto, as células S2 podem estàvel ou transitoriamente transfected por entalhe e/ou ligantes individuais (Delta ou Serrate) para gerar células que expressam exclusivamente o receptor do entalhe ou um dos seus ligantes ou uma combinação deles. Mistura de células do entalhe-expressando S2 com ligante-expressando resultados de células S2 na formação de agregados heterotypic mediada pelo receptor-ligante ligação11,12,14. Quantificação da formação agregada fornece uma medida da trans-vinculação entre entalhe e seus ligantes15 (Figura 1). Da mesma forma, as células de S2 podem ser co transfectadas com ligantes Notch e Delta ou Serrate (ou seja, cis-ligantes). Cis-ligantes nestas células S2 entalhe-expressando revogar a vinculação do entalhe com trans-ligantes e resultado em diminuição da formação agregado8,12,14. A diminuição relativa na formação de agregados causada por cis-ligantes fornece uma medida do efeito inibitório do cis-ligantes na ligação entre o entalhe e trans-ligantes (Figura 2). Nesse sentido, os ensaios de agregação celular foram utilizados para examinar o efeito de perda de xylosylation trans- e cis-interações entre entalhe e seus ligantes.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para ensaios de agregação de célula objetivou avaliar a vinculação do entalhe com trans-ligantes e sua inibição pelo cis-ligantes utilizando células de Drosophila S2. Como exemplo, podemos fornecer os dados que nos permitiram determinar o efeito de entalhe xylosylation na ligação entre o entalhe e trans-Delta8. Estes ensaios simples fornecem uma avaliação semi-quantitativa do entalhe-ligante interações em vitro e ajudam a determinar os mecanismos moleculares subjacentes os efeitos na vivo de modificadores de via Notch.

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Protocol

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1. preparação do RNA encalhado dobro (dsRNA) para Knockdown de Souza

  1. Amplificação por PCR dos produtos
    1. Use o DNA genômico do selvagem-tipo branco amarelo (y w) e pAc5.1-EGFP como modelo e os seguintes pares de cartilha para amplificar os fragmentos de DNA usados na síntese de dsRNA. Use o seguinte perfil térmico de PCR: desnaturação (95 ° C, 30 s), recozimento (58 ° C, 30 s) e extensão (72 ° C, 1 min).
      Reforçada a proteína verde fluorescente (EGFP) dsRNA Cartilhas (5' - 3')-
      Primeira demão para diante-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Reverter a primeira demão-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams dsRNA Cartilhas (5' - 3')-
      Primeira demão para diante-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Reverter a primeira demão-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Nota: EGFP dsRNA é usado como controle negativo.
  2. Gel-purifica os produtos de reação em cadeia (PCR) polimerase usando um kit de purificação de gel de comerciais de acordo com o protocolo do fabricante.
  3. Execute em vitro transcrição usando um produto comercial capaz de transcrever de um promotor T7 de acordo com o protocolo do fabricante.
  4. Purificar o dsRNA usando um kit de purificação de RNA de acordo com o protocolo do fabricante e armazenar a-80 ° C.
  5. Avalie a eficiência de Souza knockdown usando as seguintes etapas (1.5.1-1.5.5).
    1. Contagem das células manualmente usando um hemocytometer e placa 5 x 105 S2 células em cada poço de um 6 bem placa em 1 mL/bem do meio do Schneider suplementado com 10% soro Fetal bovino (FBS) e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
    2. Adicione 7,5 µ g de EGFP- ou logros dsRNA a cada poço e incubar a 25 ° C por 24 h.
    3. Colheita do controle (EGFP dsRNA-tratados) e logros dsRNA-tratados S2 células pipetando gentil seguido de granulação para baixo por centrifugação a 1.000 x g por 5 min a 25 ° C e o processo de isolamento do RNA usando um kit de extração de RNA de acordo com protocolo do fabricante.
    4. Quantificar o RNA usando um espectrofotômetro e processo 100 ng do RNA para o 1 passo qRT-PCR utilizando reagentes comerciais qPCR e primer/sondas e o seguinte perfil térmico de PCR: desnaturação (95 ° C, 15 s) e recozimento/extensão (60 ° C, 1 min).
      Nota: Consulte a Tabela de materiais , para obter informações sobre os conjuntos de primer/sonda e o instrumento utilizado para experimentos de Souza e controle qRT-PCR nestes estudos.
    5. Calcule os níveis de mRNA relativo Souza usando o 2ΔΔCT método16.

2. avaliação da ligação entre o receptor do entalhe e Trans-ligantes

  1. Prepare o sinal de recepção células (S2 expressando o receptor do entalhe).
    1. Contar as células manualmente usando um hemocytometer e placa de 5 x 105 S2 e estáveis células S2-entalhe em cada poço de uma placa de 6 em 1 mL/bem do meio do Schneider suplementado com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
      Nota: Para as células S2-entalhe, que estão disponíveis de Drosophila genómica Resource Center (DGRC), metotrexato 200 nM na mídia. Para preparar uma solução stock de metotrexato de 0,5 mM, primeiro prepare uma solução de metotrexato 20 mM em 250 µ l de 1 M de NaOH. Em seguida, diluir esta solução a 0,5 mM na solução salina tampão de fosfato 1 M e em-20 ° C. Nas células de S2-entalhe, expressão da proteína Notch está sob o controle do promotor metalotioneína Drosophila do vetor de PGTO .
    2. Adicione 7,5 µ g do dsRNA a cada poço e incubar a 25 ° C por 24 h.
    3. Adicione 0,7 mM CuSO4 para induzir a expressão de entalhe e incubar a 25 ° C por 3 dias.
      Nota: CuSO4 é usado para induzir a expressão de proteínas controlado pelo promotor metalotioneína.
  2. Prepare o envio de sinal de células (célula S2 expressando Delta ou Serrate ligantes).
    1. Contar as células manualmente usando um hemocytometer e placa ~ 5 x 106 estável S2-Delta ou S2-SerrateTom células em cada poço de uma placa de 6 em 1 mL/poço do meio do Schneider suplementado com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
      Nota: Adicione 200 metotrexato nM para células S2-Delta e 100 µ g/mL hptII para células S2-SerrateTom na mídia. Expressão do Delta e serrilhadoTom— uma versão funcional, tomate-Tag do serrilhado12— está sob Drosophila metalotioneína promotor do vetor de PGTO .
    2. Adicione 0,7 mM CuSO4 para induzir a expressão de ligantes e incubar a 25 ° C por 3 h.
  3. Execute a agregação entre as células-envio de sinal e o sinal de recepção.
    1. Colher o S2 dsRNA-tratados (controle) e células de S2-entalhe por pipetagem suave e placa de 2.5 x 105 células/poço em uma placa de 24 após a contagem manual por hemocytometer.
    2. Adicionar 5 x 105 estável Delta-S2 S2-SerrateTom células ou em um volume total de 200 µ l de meio do Schneider (suplementado com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina).
      Nota: Todas as células de S2 manipulação (incluindo tratamento de chapeamento, indução e dsRNA) foi feito sob uma armário de biossegurança.
    3. Coloque a placa em um agitador orbital a 150 rpm (942,48 rad/min).
    4. Depois de 1 min, misturar o conteúdo de cada poço e levar 20 µ l para contagem do número de agregados.
      1. Ao mesmo tempo tome uma imagem representativa sob microscópio composto invertido usando ampliação de 10x (objetivo PLL 10/0.25).
      2. Contar manualmente os agregados (> 6 células) usando um hemocytometer.
    5. Coloque a placa de um agitador.
    6. Repita a aquisição da imagem e a contar depois de 5 min e 15 min de agregação.
  4. Realizar a quantificação de trans-ligação.
    1. Calcule o número de agregados por mL entre células S2 e S2-Delta ou S2-SerrateTom células como um controle de fundo.
    2. Calcular o número de agregados por mL entre entalhe em S2 e S2-Delta ou S2-SerrateTom células (magnitude de trans-vinculação).

3.Avaliação da inibição da ligação entre o entalhe e Trans-ligantes por Cis-ligantes

  1. Prepare células de sinal de recepção.
    1. Placa de 5 x 105 S2 células em cada poço de uma placa de 6 em 1 mL/bem do meio do Schneider suplementado com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
    2. Adicione 7,5 µ g do dsRNA a cada poço e incubar a 25 ° C por 24 h.
    3. Co transfect as células dsRNA-tratados com pBluescript e PMT-entalhe11 (DGRC) sozinho ou com Entalhe em PGTO e pMT-Delta11 (DGRC) ou pMT-Serrate17 para um total Concentração de DNA de 2 µ g/bem usando um reagente de transfeccao comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
      Nota: pBluescript é usado como um controle. As células transfectadas co serão chamadas S2-entalhe & Deltatransitória ou S2-entalhe & Serratetransitória de células daqui por diante.
    4. Incube as células S2 transfectadas transitoriamente a 25 ° C por 24 h.
    5. Adicione 0,7 mM CuSO4 para induzir a expressão de entalhe e ligantes e incubar a 25 ° C por 3 dias.
  2. Prepare o envio de sinal células conforme descrito no ponto 2.2.
  3. Execute a agregação entre as células de sinal-envio e recebimento de sinal conforme descrito na seção 2.3.
  4. Quantificar a inibição de trans-ligação por cis-ligantes.
    1. Calcule o número de agregados por mL entre células S2 e S2-Delta ou S2-Serrate células como um controle de fundo.
    2. Quantificar a magnitude da inibição pelo cis-ligantes como segue.
      1. Defina A como número de agregados entre S2-entalhetransitória e células S2-Delta.
      2. Definir B como número de agregados entre células S2 transitoriamente co transfected com entalhe e Delta (S2-entalhe & Deltatransitória) e células S2-Delta.
      3. Calcular a agregação relativa C = (B x 100) /A
      4. Calcular a magnitude de inibição por cis- ligante (Delta ou Serrate) como 100 – C.
        Nota: como exemplo, se a agregação relativa é 45% e, em seguida, cis-ligantes são considerados para inibir o trans-vinculação de 55%.

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Representative Results

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As nossas observações na vivo sugeriram que a perda dos resultados xylosyltransferase gene Souza em ganho de entalhe sinalização devido ao aumentado mediada por Delta trans-ativação de entalhe sem afetar o cis-inibição da Entalhe por ligantes8. Para testar esta noção, realizaram-se ensaios de agregação em vitro celular. Primeiro, Souza expressão nas células S2 foi derrubado usando Souza dsRNA. EGFP dsRNA foi usado como controle. Eficiência de nocaute (KD) foi examinada por PCR em tempo real e foi mostrada para ser superior a 80%8. Em seguida, a ligação do receptor do entalhe com trans-Delta em cima de Souza KD foi examinado usando ensaios de agregação. A agregação entre as células S2-entalhe e S2-Delta foi examinada em vários pontos de tempo após a mistura-los. Agregação entre células simples de S2 e S2-Delta células foi tomada como controle de fundo. A Figura 3 mostra o gráfico indicando o número de agregados formado em diferentes pontos (1, 5, 15 e 30 min) o tempo após a mistura. Um aumento acentuado foi observado no número de agregados entre 1 e 5 min. depois, o número de agregados continuado a aumentar até 30 min em um ritmo mais lento. Portanto, formação de agregados foi fotografada em 1, 5 e 15 min e o número de agregados foi quantificado após 5min de mistura.

A figura 4A mostra imagens representativas da célula ensaios de agregação entre células estáveis de entalhe em S2 e S2-Delta para avaliar os efeitos de Souza KD na ligação entre o receptor do entalhe e trans-Delta. Imagens mostram a agregação em pontos três vezes (1, 5 e 15 min). Para controle de fundo, simples células de S2 (tratadas com logros dsRNA) foram misturadas com células S2-Delta. Células de S2-entalhe dsRNA-tratados EGFP formaram agregados com células S2-Delta, que aumentam em número com o tempo. Em contrapartida, Souza dsRNA-tratados células S2-entalhe formaram agregados mais rápido, e os agregados eram maiores e em maior número do que o controle ones (Figura 4B). Isto indicou que diminuir os níveis de Souza aumenta o trans-vinculação de entalhe com Delta8.

Para examinar se Shams regula o efeito inibitório do cis-ligantes na ligação entre o entalhe e trans-Delta, estabelecemos primeiro essa expressão co de entalhe e Delta em receber o sinal celular pode diminuir a agregação de célula mediada por entalhe e trans-Delta. Figura 5A mostra o gráfico indicando o número de agregações formadas entre Delta-S2 e S2-entalhe & célulastransiente de Delta com diferentes quantidades de cis-Delta. Transfecting quantidades iguais de expressão de receptores Notch e Delta construções em células S2 drasticamente diminui o número de agregações formadas entre estas células e células S2-Delta. Além disso, diminuindo a quantidade de cis-Delta resulta em um aumento do número de agregados, indicando que no intervalo de entalhe /cis-rácios de Delta usados nestes ensaios, cis-Delta pode inibir a ligação entre o entalhe e Trans-Delta de forma dose-dependente. Desde o entalhe em S2 &transitória células Delta expressam tanto entalhe e Delta, eles podem formar agregados homotypic independentemente das células S2-Delta. Para examinar se a formação de homotypic agrega entre S2-entalhe &transitória células Delta podem ser um fator de confundimento no cis-ensaios de inibição, mostrados na Figura 5A, nós misturado estas células com células S2 e quantificado o agregados. Figura 5B mostra o número de agregados formados após a mistura de células S2 com entalhe em S2 & célulastransiente de Delta expressando vários entalhe /cis-rácios de Delta. Observou-se um número bastante pequeno de homotypic agregados em comparação com heterotypic agregados, como mostrado na Figura 5A . Podemos concluir que estes ensaios de agregação fielmente medem o efeito de cis-Delta na ligação entre o entalhe e trans-Delta.

Em seguida examinamos o efeito de Souza KD na capacidade inibitória de cis-Delta. Para este fim, a agregação entre Delta-S2 e S2-entalhe &transitória células Delta foi examinado. A figura 6A mostra imagens representativas de agregação entre células Delta-S2 e S2-entalhetransitória (controle) ou S2-entalhe &transitória células Delta. S2-Delta EGFP dsRNA-tratados S2-entalhetransitória células e formaram agregados, que aumentam em número com o tempo, semelhante com a agregação entre S2-Delta e estável S2-entalhe células (Figura 4). Notavelmente, misturando S2-Delta e S2-entalhe & pilhastransiente de Delta co transfectadas com quantidades iguais de plasmídeos e Delta-expressão de receptores Notch formaram menos agregados tanto EGFP KD e logros KD, sugerindo que diminuindo o nível de Shams não afeta a capacidade de cis-Delta para bloquear o entalhe /trans-ligação Delta. Para avaliar melhor os efeitos de Souza KD na atividade de cis-Delta, a magnitude da inibição pelo cis-Delta foi medido calculando o percentual de agregação relativa sobre uma gama de entalhe /cis-Delta conforme explicado na seção 3.4.2 os rácios. Quantificação de agregação relativa mostrou uma inibição comparável de agregação EGFP e logros tratamento de dsRNA (Figura 6B). Juntas, estas observações sugerem fortemente que promove a perda de xylosylation trans-ligação sem afetar a cis-inibição8e fornecem um mecanismo molecular para o fenótipo de perda de veia asa observado em shams mutantes.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática de ensaio de agregação de célula para Trans-ligação. Diagrama mostrando a indução do receptor (S2-entalhe) e ligante (S2-Delta ou S2-Serrate) expressando S2 células por 0,7 mM CuSO4. Indução de ambas as células S2 é seguida pela mistura, que tende a fazer agregados. Estes agregados (> 6 células) são fotografado e quantificado.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Representação esquemática de ensaio de agregação de células para avaliar Cis-inibição. S2 células transitoriamente foram transfectadas com PGTO-Notch (S2-Ntransitória), Entalhe em PGTO e pMT-Delta (S2-entalhe & Deltatransitória), ou PMT-entalhe e pMT-Serrate (S2-entalhe & Serrilhadotransitória). Após a indução por 0,7 mM CuSO4 e mistura com células de S2-Delta, agrega (> 6 células) são quantificados. Inibição por cis-ligantes é medido em termos de percentual de agregação relativa na presença e na ausência de cada CEI-ligante. Os efeitos do cis-ligantes na ligação entre o entalhe e trans-serrilhado pode ser determinada pela mistura das células transfectadas transitoriamente com células S2-SerrateTom (não mostradas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: agregação entre entalhe em S2 e S2 ou células S2-Delta em diferentes pontos do tempo. Gráfico mostra o número de agregados por mL em pontos diferentes do tempo (1, 5, 15 e 30 min) entre os indicado tipos de células. Barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM) de três repetições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Célula de agregação mediada por entalhe e trans-Delta. (A) imagens mostram agregação em pontos diferentes do tempo (1, 5 e 15 min). Agregação entre Souza dsRNA-tratados células simples S2 e S2-Delta células foi tomada como controle de fundo. Shams- dsRNA Tratado S2-entalhe células mostram um aumento no número e tamanho dos agregados comparado ao dsRNA-tratados de EGFP (controle) células S2-entalhe após a mistura com células de S2-Delta. Barra de escala = 100 µm. (B) quantificação do número de célula agrega maior que 6 células após 5min de agregação. Barras de erro indicam SEM. * P < 0,01 (One-Way de análise de variância (ANOVA)). Foram realizadas três repetições com três repetições independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Cis-Delta inibe a célula em que agregar formação mediada por entalhe e trans-Delta de forma dose-dependente. (A) o gráfico mostra a agregação (em termos de número de agregados/mL) entre células Delta-S2 e S2 células transfectadas transitoriamente com diferentes proporções de vetores de expressão para entalhe e cis-Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 e 1:0. 1). Barras de erro indicam SEM. * P < 0,01 (One-Way ANOVA). Foram realizadas três repetições com três repetições independentes. Observe que diminuindo o nível de cis-Delta resulta em um aumento na agregação, provavelmente devido à reduzida cis-inibição. (B) gráfico mostrando agregação homotypic (em termos de número de agregados por mL) em células S2 transitoriamente transfected com diferentes proporções de entalhe e Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 e 1:0. 1) e misturado com células simples de S2. Barras de erro indicam o número de SEM. de agregados é muito menor do que o número de agregados heterotypic formado entre Delta-S2 e S2-entalhe &transitória células Delta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Knockdown de Souza não afeta a atividade inibitória de cis-Delta. (A) mostrado são imagens representativas do efeito de Souza KD na cis-Delta-mediados por inibição da agregação celular mediada por entalhe /trans-ligação Delta. Imagens mostram agregação em pontos diferentes do tempo (1, 5 e 15 min). Agregação entre Souza dsRNA-tratados células simples S2 e S2-Delta células foi tomada como controle de fundo. Semelhante ao estàvel transfected células S2-entalhe, logros KD aumentaram o número de agregados entre célulastransiente de S2-entalhe em comparação com o controle (EGFP dsRNA-tratados) e S2-Delta. Expressão co de cis-Delta com entalhe em uma proporção de 1:1 resultou num decréscimo comparável do número de agregados no controle (EGFP dsRNA-tratados), bem como em células de dsRNA Tratado de Souza . Barra de escala = 100 µm. (B) o gráfico mostra agregação relativa entre células Delta-S2 e S2 células transitoriamente co transfectadas com proporções indicadas (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 e 1:0. 1) de entalhe e cis-Delta. Tratamento de dsRNA EGFP e logros mostram uma diminuição comparável de agregação em cada entalhe /cis-relação do Delta. Os dados apresentados aqui são representativos de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Canônico de sinalização Notch depende das interacções entre o receptor do entalhe e seus ligantes5. Embora a maioria dos estudos sobre a via de Notch principalmente considerar a vinculação do entalhe e ligantes em células vizinhas (trans), entalhe e ligantes mesmo células interagem e estes so-called cis-interações podem desempenhar um papel inibitório no entalhe sinalização de3,4. Nesse sentido, para decifrar os mecanismos subjacentes os efeitos de um modificador na sinalização de entalhe canônico, muitas vezes é pertinente examinar os dois tipos de interações do entalhe-ligante (trans e cis). No entanto, em muitos contextos durante o desenvolvimento de animais, envolvimento de ambas essas interações e sua regulação feedback complica na vivo estudos1,6. No presente protocolo, nós fornecemos uma metodologia detalhada para em vitro ensaios agregação celular usando células de Drosophila S2 para avaliar a ligação do receptor do entalhe com trans- ligantes e sua inibição pelo cis- ligantes. Nós apresentamos a utilização desta metodologia para avaliar o efeito de um modificador de genético de entalhe sinalização (o xylosyltransferase Souza7,8) na ligação do receptor-ligante.

Primeiro, agregação ensaios foram realizados entre estável S2-Delta EGFP ou logros dsRNA-tratados estável S2-entalhe células e examinar o efeito de Souza KD na trans-ligação. Agregação de células S2-Delta com células de S2 planície de dsRNA-tratados de Souza foi levada como controle de fundo. Shams KD reforçada a agregação entre S2-entalhe e células S2-Delta em relação ao controle. É importante executar agregações de controle experimental de fundo entre simples células S2 e ligante-carregando S2 células em paralelo para o trans-experiências de vinculação. Apesar de drosófila S2 células não expressam endógena do receptor do entalhe e Delta ligante11, expressão de baixos níveis de Serrate é relatado em S2 células13. Considerando isso, planície S2 células foram utilizadas em ensaios de agregação de célula como controle de fundo; Estas células não mostrou qualquer agregação (Figura 5B). Agregados são contados manualmente usando um hemocytometer. Para garantir consistência na quantificação agregada, 10-20 µ l de população mista de celular pode ser pipetado para fora de pelo menos três diferentes áreas por alvéolo para contar. Estes ensaios requerem células saudáveis de S2 crescentes. Considerando a natureza semi aderente do S2 células, gentil pipetagem enquanto coleta as células e constante agitação durante o ensaio de agregação é importante.

Anteriormente, nós e os outros usaram ensaios obrigatórios de bem-estabelecida, solúvel ligante-receptor para uma avaliação quantitativa da ligação do receptor-ligante no trans17,18,19, 20. desde que os ensaios de agregação são semi-quantitativa, ensaios obrigatórios de ligante solúvel também foram realizados para examinar o efeito de Souza KD no entalhe-ligante trans-ligação. Os resultados observados foram semelhantes na tendência com aqueles obtidos a partir de ensaios de agregação8. Este atestado fiel avaliação da vinculação de entalhe com trans-ligantes utilizando ensaios de agregação de célula. Embora a formação de agregados é uma leitura de ligação do receptor-ligante, pode ser intrincada se a expressão de superfície do receptor do entalhe ou seus ligantes é afectada pelos modificadores de determinado. Isto ressalta a limitação dos ensaios agregação de célula, como ele não pode ser distinguido se a mudança na formação de agregados é por causa da ligação do receptor-ligante modificado ou alterado a expressão de superfície. Portanto, paralelamente a ensaios de agregação, os efeitos de cada modificador na expressão de superfície de entalhe e ligantes precisam ser testados em células de S2. No contexto de nossos estudos, níveis superficiais de entalhe e Delta não foram afetados em células Souza S2 dsRNA-tratados8.

Para examinar a inibição da trans-ligação pela adição de cis-ligantes, agregação ensaios foram realizados entre células S2-Delta e EGFP ou Souza S2-entalhe dsRNA-tratados &transitória células Delta . O número de agregações formadas entre estas células foi comparado com o número de agregações formadas entre células Delta-S2 e S2-entalhetransitória células. A diminuição relativa do número de agregados foi calculada e usada como um indicador para a magnitude da inibição pelo cis-Delta. Os experimentos de controle mostrou que cis-ligantes mostram uma inibição robusta e dose-dependente de entalhe /trans-ligação Delta sobre uma gama bastante ampla de entalhe de cis-rácios de ligante (1:1 a 1:0. 1) (Figura 5A),8 . Proporção de 1:1 resultou em grau mais forte de cis-inibição e diminuindo o nível relativo de cis-Delta enfraquecido cis-inibição. Nesse sentido, as experiências de KD sobre essa variação da proporção foi realizada. Digno de nota, a quantidade de receptores Notch e a quantidade total de DNA transfectada foi mantidos constantes em todos os experimentos. Isto irá assegurar que formação agregada é afectada principalmente pela atividade de cis-ligantes e não por alterou os níveis de expressão de receptores Notch pelas células.

Anteriormente foi mostrado essa expressão co de entalhe e cis-ligantes em células S2 podem resultar na formação de homotypic agregações14. Para examinar se semelhante homotypic agregações entre S2-entalhe & Deltatransitória ou S2-entalhe & serrilhadotransitória de células podem comprometer nossas interpretações das agregado quantificações em cis-estudos de ligante, um ensaio de agregação de controle foi realizado entre S2-entalhe & Deltatransitória e simples células S2. O número de células S2 usado nesses experimentos foi o mesmo que células S2-Delta usadas no cis-experimentos do Delta. Observou-se uma agregação de homotypic, mas quantificação mostrou que os agregados resultantes contribuem uma fração baixa dos agregados totais comparado com os heterotypic agregados entre S2-entalhe & Deltatransitória e S2-Delta células ( Figura 5B).Podemos concluir que as alterações observaram no número de agregados na cis-ensaios de ligante são principalmente devido ao efeito inibitório do cis-ligantes na ligação entre o entalhe e trans-Delta.

Em resumo, os ensaios de agregação apresentados neste protocolo fornecem uma metodologia simples e fácil para avaliação semi-quantitativa da cise trans--interações entre o receptor do entalhe e seus ligantes. Estes ensaios podem ser usados para examinar os efeitos da genéticas ou farmacológicas modificadores de caminho de entalhe no entalhe-ligante vinculação em vitro e, portanto, podem ajudar a elucidar os mecanismos subjacentes na vivo efeitos de modificadores no entalhe sinalização.

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Disclosures

Os autores não têm nenhum conflito de interesses.

Acknowledgments

Os autores reconhecem o apoio do NIH/NIGMS (R01GM084135 de HJN) e Fundação de Mizutani para eficientemente (grant #110071 para HJN) e é grato ao Tom V. Lee para discussões e sugestões sobre os ensaios e Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine e a drosófila genômica recurso Center (DGRC) para plasmídeos e linhas celulares.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

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References

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Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe <em>drosófila</em> com <em>Trans</em>-ligantes e sua inibição pelo <em>Cis</em>-ligantes
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Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).More

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

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