Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af Drosophila Notch med Trans-ligander og dens hæmning af Cis-ligander

doi: 10.3791/56919 Published: January 2, 2018

Summary

I vivo systemers kompleksitet gør det vanskeligt at skelne mellem aktivering og hæmning af Notch receptor af trans- og cis-ligander, henholdsvis. Vi præsenterer her, en protokol baseret på in vitro- celle-sammenlægning assays til kvalitative og semi-kvantitative evaluering af bindingen af Drosophila hak til trans-ligander vs cis-ligander.

Abstract

Notch signalering er en evolutionært bevarede celle-celle kommunikationssystem anvendes bredt i dyrenes udvikling og voksen vedligeholdelse. Samspillet mellem Notch receptor og ligander fra tilstødende celler inducerer aktivering af den signalvejen (trans-aktivering), mens interaktion med ligander fra den samme celle hæmmer signalering (cis-hæmning). Passende balance mellem trans-aktivering og cis-hæmning hjælper med at etablere optimale niveauer af Notch signalering i nogle sammenhænge under dyrenes udvikling. På grund af de overlappende udtryk domæner Notch og dens ligander i mange celletyper og eksistensen af feedback-mekanismer, at studere virkningerne af en given posttranslationel modifikation på trans- versus cis-vekselvirkninger mellem Notch og dens ligander i vivo er vanskeligt. Her, beskriver vi en protokol for Drosophila S2 celler i celle-sammenlægning assays til at vurdere virkningerne af bankede ned en hak pathway modifier for bindingen af hak til hver ligand i trans og i SNG-landene. S2 celler stabilt eller forbigående transfekteret med en kærv-udtrykker vektor er blandet med celler, der udtrykker hver Notch ligand (S2-Delta eller S2-savtakkede). Trans-bindingen mellem receptor og ligander resulterer i dannelsen af Heterotypiske celle aggregater og måles i forhold til antallet af aggregater pr. mL sammensat af > 6 celler. At undersøge den hæmmende effekt af cis-ligander, S2 celler Co udtrykker Notch og hver ligand er blandet med S2-Delta eller S2-savtakkede celler og antallet af aggregater er kvantificeret som beskrevet ovenfor. Den relative nedgang i antallet af aggregater på grund af tilstedeværelsen af cis-ligander giver et mål for SNG-ligand-medieret hæmning af trans-bindende. Disse ligetil assays kan levere semi-kvantitative data om effekten af genetiske eller farmakologiske manipulationer på bindingen af hak til sit ligander, og kan hjælpe med at decifrere de molekylære mekanismer i vivo -effekten af sådanne manipulationer på Notch signalering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Canonical Notch signalering er en kortrækkende celle til celle kommunikationsmekanisme, der kræver fysisk kontakt mellem tilstødende celler for at lette samspillet mellem Notch receptorer og deres ligander1. Samspillet mellem Notch receptor (til stede på overfladen af signal-modtagende celler) og ligander (til stede på overfladen af signal at sende celler) indleder Notch signalering og er kendt som trans-aktivering2. På den anden side interaktion mellem Notch og dens ligander i den samme celle fører til hæmning af Notch pathway og er kendt som cis-hæmning3. Balance mellem trans- og cis-interaktioner er nødvendige for at sikre optimal ligand-afhængige Notch signalering4. Drosophila har en hak receptor og to ligander (Delta og Serrate) i modsætning til pattedyr, der har fire Notch receptorer og fem ligander [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-lignende 1 (DLL1), DLL3 og DLL4]5. At have denne enkelhed, tilbyder Drosophila model lethed til at dissekere/undersøgelse pathway modifikatorer virkninger på Notch-ligand interaktioner og efterfølgende på Notch signalering. I visse sammenhænge under dyrenes udvikling (herunder wing udvikling i Drosophila), både cis- og trans-interaktioner er involveret til at opnå ordentlig hak signalering og celle skæbne1,6 . Det er vigtigt at skelne virkninger af Notch pathway modifikatorer i disse sammenhænge på cis- og trans-interaktioner i hak med sin ligander.

Vores gruppe tidligere rapporteret at tilføjelsen af en kulhydrat rest kaldet xylose til Drosophila Notch negativt regulerer Notch signalering i visse sammenhænge, herunder wing udvikling7. Tab af shams (enzymet der xylosylates Notch) fører til en "tab af wing vene" fænotype7. Mere nylig, gen dosering eksperimenter og klonede analyse blev brugt til at vise, at tab af shams øger Delta-medieret Notch fokuseren. At skelne mellem om den forbedrede Notch signalering i shams mutanter er et resultat af nedsat cis-hæmning eller øget trans-aktivering, ektopiske overekspression undersøgelser af Notch ligander i larve wing fantasiens diske du bruger driveren, dpp-GAL4 blev udført. Disse eksperimenter leveres beviser tyder på, at Shams regulerer trans-aktivering af hak af Delta uden at påvirke Notch SNG-hæmning af ligander8. Dog feed-back bestemmelser og virkninger af endogene ligander kan komplicere fortolkningen af ektopiske overekspression undersøgelser1,6,9.

Du kan løse problemet, Drosophila S2 celler10 blev brugt, som giver en enkel in vitro- system for Notch-ligand interaktion undersøgelser11,12. S2 celler ikke udtrykke endogene Notch receptor og Delta ligand11 og udtrykke et lavt niveau af takkede13, som ikke påvirker Notch-ligand sammenlægning eksperimenter8. Derfor, S2 celler kan være stabilt eller forbigående transfekteret af hak og/eller individuelle ligander (Delta eller Serrate) til at generere celler, der udelukkende express Notch receptor eller en af dens ligander eller en kombination af disse. Blanding af hak-udtrykker S2 celler med ligand-udtrykker S2 celler resulterer i dannelsen af Heterotypiske aggregater medieret af receptor-ligand bindende11,12,14. Kvantitativ bestemmelse af den samlede dannelse giver et mål for trans-bindende mellem Notch og dens ligander15 (figur 1). Ligeledes S2 celler kan være co transfected med hak og Delta eller Serrate ligander (dvs. cis-ligander). CIS-ligander i cellernes Notch-udtrykker S2 ophæve sammenkædning af Notch med trans-ligander og resultere i nedsat samlede dannelse8,12,14. Den relative nedgang i samlede dannelse forårsaget af cis-ligander giver et mål for den hæmmende effekt af cis-ligander bindingen mellem Notch og trans-ligander (figur 2). I overensstemmelse hermed, celle sammenlægning assays blev udnyttet til at undersøge effekten af tab af xylosylation på trans- og cis-interaktioner mellem Notch og dens ligander.

Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for celle sammenlægning assays til formål at evaluere binding af Notch med trans-ligander og dens hæmning af cis-ligander bruger Drosophila S2 celler. Som et eksempel, vi leverer de data, der tillod os at bestemme virkningen af Notch xylosylation bindingen mellem Notch og trans-Delta8. Disse enkle assays give en semi-kvantitative vurdering af hak-ligand interaktioner i vitro og hjælpe med at bestemme de molekylære mekanismer bag effekterne i vivo af Notch pathway modifikatorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse af dobbelt strandede RNA (dsRNA) for Shams Knockdown

  1. PCR-amplifikation af produkter
    1. Bruge wild-type gul hvid (y w) genomisk DNA og pAc5.1-EGFP som skabelon, og de følgende primer par til at forstærke DNA fragmenter bruges i dsRNA syntese. Brug følgende PCR termisk profil: denaturering (95 ° C, 30 s), udglødning (58 ° C, 30 s) og filtypenavn (72 ° C, 1 min).
      Forbedret grøn fluorescerende proteiner (EGFP) dsRNA primere (5' - 3')-
      Fremad primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Vende primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams dsRNA primere (5' - 3')-
      Fremad primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Vende primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Bemærk: EGFP dsRNA bruges som negativ kontrol.
  2. Gel-rense polymerase kædereaktion (PCR) produkter ved hjælp af en kommerciel gel rensning kit efter producentens protokol.
  3. Udføre i vitro transskription ved hjælp af et kommercielt produkt i stand til at transskribere fra en T7 promotor efter producentens protokol.
  4. Rense dsRNA bruger et RNA oprensning kit efter producentens protokol og opbevares ved-80 ° C.
  5. Vurdere effektiviteten af shams knockdown ved hjælp af følgende trin (1.5.1-1.5.5).
    1. Tæller de celler manuelt ved hjælp af en hemocytometer og plade 5 x 105 S2 celler i hver brønd med en 6 godt plade i 1 mL/godt af Schneiders medium suppleret med 10% føtal bovin Serum (FBS) og 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
    2. Tilføje 7,5 µg for EGFP- eller shams dsRNA til hver brønd og Inkuber ved 25 ° C i 24 timer.
    3. Høst kontrol (EGFP dsRNA-behandlet) og shams dsRNA-behandlet S2 celler af blid pipettering efterfulgt af pelleringsmidler ned ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min ved 25 ° C og proces for RNA isolering bruger et RNA udvinding kit i henhold til producentens protokol.
    4. Kvantificere RNA bruger et spektrofotometer og proces 100 ng af RNA for 1-trins qRT-PCR ved hjælp af kommercielle qPCR reagenser og primer/sonder og følgende PCR termisk profil: denaturering (95 ° C, 15 s) og Annealing/forlængelse (60 ° C, 1 min).
      Bemærk: Se Tabel af materialer du kan finde oplysninger om primer/sonden apparater og instrumentet anvendes til shams og kontrol qRT-PCR eksperimenter i disse undersøgelser.
    5. Beregne relative shams mRNA niveauer ved hjælp af 2-ΔΔCT metode16.

2. vurdering af bindingen mellem Notch Receptor og Trans-ligander

  1. Forberede signal-modtagende celler (S2 celler udtrykker Notch receptor).
    1. Tælle celler manuelt ved hjælp af en hemocytometer og plade 5 x 105 S2 og stabil S2-Notch celler i hver brønd med en 6-godt plade i 1 mL/godt af Schneiders medium suppleret med 10% FBS og 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
      Bemærk: For S2-Notch celler, som er tilgængelige fra Drosophila genomforskning ressource Center (DGRC), tilføje 200 nM methotrexat i medierne. For at forberede en 0,5 mM methotrexat stamopløsning, først forberede en 20 mM methotrexat løsning i 250 µL 1 M NaOH. Næste, fortyndes denne opløsning til 0,5 mM, 1 M fosfat buffer saltvand og opbevares ved-20 ° C. I S2-Notch celler er udtryk for Notch protein under for Drosophila metallothionein i ydelse vektor kontrol.
    2. Tilføje 7,5 µg for dsRNA til hver brønd og Inkuber ved 25 ° C i 24 timer.
    3. Tilføje 0,7 mM CuSO4 inducerer udtryk af Notch og inkuberes ved 25 ° C i 3 dage.
      Bemærk: CuSO4 bruges til at fremkalde udtryk for proteiner kontrolleret af metallothionein promotor.
  2. Forbered afsendelse af signal celler (S2 celle udtrykker Delta eller Serrate ligander).
    1. Tælle celler manuelt ved hjælp af en hemocytometer og plade ~ 5 x 106 stabil S2-Delta eller S2-savtakkedeTom celler i hver brønd med en 6-godt plade i 1 mL/brønd af Schneiders medium suppleret med 10% FBS og 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
      Bemærk: Tilføje 200 nM methotrexat for S2-Delta celler og 100 µg/mL hygromycin til S2-savtakkedeTom celler i medierne. Udtryk for Delta og takkedeTom— en tomat-mærket, funktionel version af takkede12— er Drosophila metallothionein promotor i ydelse vektor.
    2. Tilføje 0,7 mM CuSO4 inducerer udtryk af ligander og inkuberes ved 25 ° C til 3 h.
  3. Udføre sammenlægning mellem signal-afsendelse og signal-modtagelse celler.
    1. Høst af dsRNA-behandlet S2 (kontrol) og S2-Notch celler af blid pipettering og plade 2,5 x 105 celler/brønd i en 24-godt plade efter manuel optælling af hemocytometer.
    2. Tilføj 5 x 105 stabil S2-Delta eller S2-savtakkedeTom celler i en samlet maengde paa 200 µL af Schneiders medium (suppleret med 10% FBS og 100 U/mL Penicillin-Streptomycin).
      Bemærk: Alle S2 celler håndtering (herunder plating, induktion og dsRNA behandling) blev gjort under en biosikkerhed kabinet.
    3. Pladen anbringes på en orbitalryster på 150 rpm (942.48 rad/min).
    4. Efter 1 min, bland indholdet af hver brønd og tage 20 µL for at tælle antallet af aggregater.
      1. Samtidig tage et repræsentativt billede under inverteret sammensat mikroskop ved hjælp af 10 x forstørrelse (PLL 10/0,25 mål).
      2. Manuelt tælle aggregater (> 6 celler) ved hjælp af en hemocytometer.
    5. Pladen anbringes på en shaker.
    6. Gentag billede erhvervelse og tælle efter 5 min og 15 min af sammenlægning.
  4. Udføre kvantificering af trans-bindende.
    1. Beregne antallet af aggregater pr. mL mellem S2 celler og S2-Delta eller S2-savtakkedeTom celler som baggrund kontrol.
    2. Beregne antallet af aggregater pr. mL mellem S2-Notch og S2-Delta eller S2-savtakkedeTom celler (omfanget af trans-bindende).

3.Evaluering af hæmning af bindingen mellem Notch og Trans-ligander af Cis-ligander

  1. Forberede signal-modtagende celler.
    1. Plade 5 x 105 S2 celler i hver brønd med en 6-godt plade i 1 mL/godt af Schneiders medium suppleret med 10% FBS og 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
    2. Tilføje 7,5 µg for dsRNA til hver brønd og Inkuber ved 25 ° C i 24 timer.
    3. Co transfect de dsRNA-behandlede celler med pBluescript og Ydelse-Notch11 (DGRC) alene eller med pMT-Notch og Ydelse-Delta11 (DGRC) eller Ydelse-savtakkede17 for i alt DNA koncentration af 2 µg/brønd ved hjælp af en kommerciel Transfektion reagens ifølge producentens protokol.
      Bemærk: pBluescript er brugt et kontrolelement. De Co transfected celler vil blive kaldt S2-Notch & Deltaforbigående eller S2-Notch & savtakkedeforbigående celler herefter.
    4. Inkuber forbigående transfekteret S2 celler ved 25 ° C i 24 timer.
    5. Tilføje 0,7 mM CuSO4 inducerer udtryk af Notch og af ligander og inkuberes ved 25 ° C i 3 dage.
  2. Forbered afsendelse af signal celler, som beskrevet i punkt 2.2.
  3. Udføre sammenlægning mellem signal-afsendelse og signal-modtagelse celler, som beskrevet i afsnit 2.3.
  4. Kvantificere hæmning af trans-bindende af cis-ligander.
    1. Beregne antallet af aggregater pr. mL mellem S2 celler og S2-Delta eller S2-savtakkede celler som baggrund kontrol.
    2. Kvantificere omfanget af hæmning af cis-ligander som følger.
      1. Definere A som antallet af aggregater mellem S2-Notchforbigående og S2-Delta celler.
      2. Definere B som antallet af aggregater mellem S2 celler forbigående Co transfekteret med kærv og Delta (S2-Notch & Deltaforbigående) og S2-Delta celler.
      3. Beregne relative sammenlægning C = (B x 100) /A
      4. Beregne omfanget af hæmning af cis- ligand (Delta eller Serrate) som 100- C.
        Bemærk: som et eksempel, hvis relative sammenlægning er 45%, så cis-ligander anses for at hæmme trans-bindende med 55%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vores i vivo bemærkninger foreslog, at tab af xylosyltransferase gen shams resultater i gevinst på Notch signalering skyldes øget Delta-medieret trans-aktivering af Notch uden at påvirke cis-hæmning af Hak af ligander8. For at teste dette begreb, blev i vitro celle sammenlægning assays udført. Først, shams udtryk i S2 celler blev slået ved hjælp af shams dsRNA. EGFP dsRNA blev brugt som kontrol. Effektiviteten af knockdown (KD) blev undersøgt af real-time PCR og viste sig at være større end 80%8. Derefter, binding af Notch receptor med trans-Delta på shams KD blev undersøgt ved hjælp af sammenlægning assays. Sammenlægning mellem S2-Notch og S2-Delta celler blev undersøgt på forskellige tidspunkter efter blande dem. Sammenlægning mellem almindelig S2 celler og S2-Delta celler blev taget som baggrund kontrol. Figur 3 viser grafen med angivelse af antallet af aggregater dannet på forskellige tid punkter (1, 5, 15 og 30 min) efter blanding. En skarp stigning blev observeret i antallet af aggregater mellem 1 og 5 min. bagefter, antallet af aggregater fortsatte med at stige indtil 30 min i et langsommere tempo. Derfor samlede dannelse blev afbildet på 1, 5 og 15 min og antallet af aggregater var kvantificerede efter 5 min blanding.

Figur 4A viser repræsentative billeder af celle sammenlægning assays mellem stabil S2-Notch og S2-Delta celler til at vurdere virkningerne af shams KD på bindingen mellem Notch receptor og trans-Delta. Billederne viser sammenlægning ved tre-tiden point (1, 5 og 15 min). For baggrund kontrol, blev plain S2 celler (behandlet med shams dsRNA) blandet med S2-Delta celler. EGFP dsRNA-behandlet S2-Notch celler dannet aggregater med S2-Delta celler, som forøgelse antallet med tiden. Derimod shams dsRNA-behandlet S2-Notch celler dannet aggregater hurtigere, og aggregaterne blev større og større antal end kontrol dem (figur 4B). Det angives, at faldende Shams niveauer øger trans-binding af Notch med Delta8.

For at undersøge hvorvidt Shams regulerer den hæmmende effekt af cis-ligander bindingen mellem Notch og trans-Delta, vi først etableret som fælles udtryk for Notch og Delta i signal-modtager celle kan mindske celle sammenlægning medieret af Notch og trans-Delta. Fig. 5A viser grafen med angivelse af antallet af aggregater dannet mellem S2-Delta og S2-Notch & Deltaforbigående celler med forskellige mængder af cis-Delta. Transfecting lige store mængder af Notch og Delta udtryk konstruktioner i S2 celler dramatisk reducerer antallet af aggregater dannet mellem disse celler og S2-Delta celler. Desuden mindske mængden af cis-Delta resulterer i en stigning i antallet af aggregeringer, der angiver, at i området Notch /cis-Delta nøgletal bruges i disse assays, cis-Delta kan hæmme bindingen mellem Notch og Trans-Delta i en dosis-afhængige måde. Siden S2-Notch & Deltaforbigående celler udtrykker både Notch og Delta, de kan danne Homotypiske aggregater uafhængigt af S2-Delta celler. At undersøge, om dannelsen af Homotypiske aggregater blandt S2-Notch & Deltaforbigående celler kan være en forstyrrende faktor i cis-hæmning assays vist i figur 5A, vi blandet disse celler med S2 celler og kvantificeres de aggregater. Figur 5B viser antallet af aggregater dannet efter blanding S2 celler med S2-Notch & Deltaforbigående celler, der udtrykker forskellige Notch /cis-Delta nøgletal. Et forholdsvis lille antal Homotypiske aggregater i forhold til Heterotypiske aggregater som vist i figur 5A blev observeret. Vi konkluderer, at disse sammenlægning assays trofast måle effekten af cis-Delta bindingen mellem Notch og trans-Delta.

Vi næste undersøgte effekten af shams KD på hæmmende evne til cis-Delta. Til denne afslutning, sammenlægning mellem S2-Delta og S2-Notch & Deltaforbigående celler blev undersøgt. Figur 6A viser repræsentative billeder af sammenlægning mellem S2-Delta celler og S2-Notchforbigående (kontrol) eller S2-Notch & Deltaforbigående celler. S2-Delta og EGFP dsRNA-behandlet S2-Notchforbigående celler dannet aggregater, der øger i nummer med tid, svarende til sammenlægning mellem S2-Delta og stabil S2-Notch celler (figur 4). Navnlig, blande S2-Delta og S2-Notch & Deltaforbigående celler Co transfekteret med lige store mængder af Notch og Delta udtryk plasmider dannet mindre aggregater på både EGFP KD og shams KD, tyder på, at faldende niveau af Shams påvirker ikke evnen til cis-Delta at blokere Notch /trans-Delta bindende. At foretage en bedre vurdering af shams KD på aktiviteten af cis-Delta, omfanget af hæmning af cis-Delta blev målt ved at beregne relative sammenlægning procentdelen over en vifte af hak /cis-Delta nøgletal som forklaret i afsnit 3.4.2. Kvantificering af relative sammenlægning viste en sammenlignelig hæmning af sammenlægning af EGFP og shams dsRNA behandling (fig. 6B). Sammen, disse bemærkninger anbefaler kraftigt at tab af xylosylation fremmer trans-bindende uden at påvirke cis-hæmning8, og give en molekylær mekanisme for wing vene tab fænotype observeret i shams mutanter.

Figure 1
Figur 1: Skematisk fremstilling af celle sammenlægning Assay for Trans-bindende. Diagram, der viser induktion af receptor (S2-Notch) og ligand (S2-Delta eller S2-savtakkede) udtrykker S2 celler af 0,7 mM CuSO4. Induktion af begge S2 celler er efterfulgt af blanding, som har tendens til at gøre aggregater. Disse aggregater (> 6 celler) er afbildet og kvantificeres.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk fremstilling af celle sammenlægning Assay at vurdere Cis-hæmning. S2 celler var forbigående transfekteret med pMT-Notch (S2-Nforbigående), Ydelse-Notch og Ydelse-Delta (S2-Notch & Deltaforbigående), eller Ydelse-Notch og Ydelse-savtakkede (S2-Notch & Takkedeforbigående). Efter induktion af 0,7 mM CuSO4 og blande med S2-Delta celler, aggregater (> 6 celler) er kvantificeret. Hæmning af cis-ligander er målt i relativ sammenlægning procentdel i tilstedeværelse og fravær af hver SNG-ligand. Virkningerne af cis-ligander bindingen mellem Notch og trans-takkede kan bestemmes ved at blande de forbigående transfekteret celler med S2-savtakkedeTom celler (ikke vist). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: sammenlægning mellem S2-Notch og S2 eller S2-Delta celler på forskellige tidspunkter. Grafen viser antallet af aggregater pr. mL på forskellige tidspunkter (1, 5, 15 og 30 min) mellem de angivne typer af celler. Fejllinjer angive standard fejl af middelværdien (SEM) af tre replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Celle sammenlægning medieret af Notch og trans-Delta. (A) billederne viser aggregering på forskellige tidspunkter (1, 5 og 15 min). Sammenlægning mellem shams dsRNA-behandlet plain S2 celler og S2-Delta celler blev taget som baggrund kontrol. Shams- dsRNA behandlet S2-Notch celler viser en stigning i antallet og størrelsen af aggregater i forhold til EGFP dsRNA-behandlet (kontrol) S2-Notch celler efter blanding med S2-Delta celler. Skalalinjen = 100 µm. (B) kvantificering af antallet af celle aggregater større end 6 celler efter 5 min af sammenlægning. Fejllinjer angive SEM. * P < 0,01 (One-way variansanalyse (ANOVA)). Tre gentagelser med tre uafhængige gentagelser blev udført. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Cis-Delta hæmmer den celle samlede dannelse medieret af Notch og trans-Delta i en dosis-afhængige måde. (A) graf viser sammenlægning (med hensyn til antallet af aggregater/mL) mellem S2-Delta celler og S2 celler forbigående transfekteret med forskellige nøgletal udtryk vektorer for Notch og cis-Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 og 1:0. 1). Fejllinjer angive SEM. * P < 0,01 (One-way ANOVA). Tre gentagelser med tre uafhængige gentagelser blev udført. Bemærk, at faldende niveau af cis-Delta resulterer i en stigning i sammenlægning, sandsynligvis på grund af reduceret cis-hæmning. (B) graf viser Homotypiske sammenlægning (med hensyn til antallet af aggregater pr. mL) i S2 celler forbigående transfekteret med forskellige nøgletal Notch og Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 og 1:0. 1) og blandet med almindelig S2 celler. Fejllinjer angive SEM. antallet af aggregater er meget mindre end antallet af Heterotypiske aggregater dannet mellem S2-Delta og S2-Notch & Deltaforbigående celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Knockdown af shams påvirker ikke de hæmmende aktivitet af cis-Delta. (A) vist er repræsentative billeder af effekten af shams KD på cis-Delta-medieret hæmning af celle sammenlægning medieret af hak /trans-Delta bindende. Billederne viser aggregering på forskellige tidspunkter (1, 5 og 15 min). Sammenlægning mellem shams dsRNA-behandlet plain S2 celler og S2-Delta celler blev taget som baggrund kontrol. Ligner stabilt transfekteret S2-Notch celler, shams KD steg antallet af aggregater mellem S2-Delta og S2-Notchforbigående celler i forhold til kontrol (EGFP dsRNA-behandlet). Co udtryk af cis-Delta med hak i forholdet 1:1 resulterede i et tilsvarende fald i antallet af aggregater i kontrol (EGFP dsRNA-behandlet) såvel som i shams dsRNA behandlede celler. Skalalinjen = 100 µm. (B) graf viser relative sammenlægning mellem S2-Delta celler og S2 celler forbigående Co transfekteret med angivne nøgletal (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 og 1:0. 1) hak og cis-Delta. EGFP og shams dsRNA behandling viser et tilsvarende fald i sammenlægning på hvert ryk /cis-Delta ratio. Data præsenteres her er repræsentant for tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Canonical Notch signalering afhænger af samspillet mellem Notch receptor og dens ligander5. Selv om de fleste undersøgelser på Notch pathway primært betragter binding af Notch og ligander i tilstødende celler (trans), hak og samme cellerække ligander interagerer, og disse såkaldte cis-interaktioner kan spille en hæmmende rolle i hak signalering3,4. Derfor for at dechifrere de underliggende virkningerne af en modifier for kanoniske notch signalering mekanismer, er det ofte relevant at undersøge begge typer af hak-ligand interaktioner (trans og cis). Men i mange sammenhænge under dyrenes udvikling, inddragelse af begge disse interaktioner og deres feedback regulering komplicerer i vivo undersøgelser1,6. I denne protokol leverer vi en detaljeret metode til in vitro- celle sammenlægning assays bruger Drosophila S2 celler til at evaluere bindingen af Notch receptor med trans- ligander og dens hæmning af cis- ligander. Vi har præsenteret udnyttelsen af denne metode til at vurdere effekten af en genetisk modifier af Notch signalering (xylosyltransferase Shams7,8) receptor-ligand bindingen.

Først, sammenlægning assays blev udført mellem stabil S2-Delta og EGFP eller shams dsRNA-behandlet stabil S2-Notch celler til at undersøge effekten af shams KD på trans-bindende. Sammenlægning af S2-Delta celler med shams dsRNA-behandlet plain S2 celler blev taget som baggrund kontrol. Shams KD forbedret sammenlægning mellem S2-Notch og S2-Delta celler i forhold til kontrol. Det er vigtigt at udføre baggrund eksperimentelle kontrol sammenlægninger mellem almindelig S2 celler og ligand-regnskabsmæssige S2 celler sideløbende at trans-bindende forsøg. Selvom Drosophila S2 celler ikke udtryk endogene Notch receptor og Delta ligand11, rapporterede udtryk for lavt Serrate i S2 celler13. I betragtning af dette, plain S2 celler blev brugt i celle sammenlægning assays som baggrund kontrol; disse celler udviste ikke nogen sammenlægning (figur 5B). Aggregater, tælles manuelt ved hjælp af en hemocytometer. For at sikre konsistens i samlede kvantificering, kan 10-20 µL af blandet celle befolkning være pipetted ud fra mindst tre forskellige områder pr. brønd for at tælle. Disse assays kræver sund voksende S2 celler. I betragtning af de semi-vedhængende karakter af S2 celler, blid pipettering samtidig med at indsamle cellerne og konstant ryster under sammenlægning assay er vigtige.

Tidligere har vi og andre brugt veletableret, opløseligt ligand-receptor binding assays for en kvantitativ vurdering af receptor-ligand bindende i trans17,18,19, 20. da sammenlægning assays er semi-kvantitative, opløselige ligand bindende assays blev også udført for at undersøge effekten af shams KD på Notch-ligand trans-bindende. De observerede resultater var ens i trend med dem, der opnås fra sammenlægning assays8. Dette attesteres den trofaste evaluering af bindingen af Notch med trans-ligander ved hjælp af celle sammenlægning assays. Selv om den samlede dannelse er en udlæsning af receptor-ligand bindende, kan det være indviklede, hvis overflade udtryk for Notch receptor eller dens ligander er berørt af de givne modifikatorer. Dette understreger begrænsningen af celle sammenlægning assays, som den ikke kan adskilles, hvis ændringen i samlet formation er på grund af ændrede receptor-ligand bindende eller ændret overflade udtryk. Parallel til sammenlægning assays, virkningerne af hver modifier på overflade udtryk for Notch og ligander bør derfor afprøves i S2 celler. I forbindelse med vores undersøgelser, blev overflade niveauer af Notch og Delta ikke berørt i shams dsRNA-behandlet S2 celler8.

At undersøge hæmning af trans-binding ved tilsætning af cis-ligander, sammenlægning assays blev udført mellem S2-Delta celler og EGFP eller shams dsRNA-behandlet S2-Notch & Deltaforbigående celler . Antallet af aggregater dannet mellem disse celler blev sammenlignet med antallet af aggregater dannet mellem S2-Delta celler og S2-Notchforbigående celler. Den relative nedgang i antallet af aggregater blev beregnet og anvendes som en indikator for omfanget af hæmning af cis-Delta. Kontrol eksperimenter viste, at cis-ligander vise en robust og dosis-afhængige hæmning af hak /trans-Delta bindende over en temmelig bred vifte hak til cis-ligand nøgletal (1:1 til 1:0. 1) (figur 5A)8 . Forholdet 1:1 resulterede i stærkeste graden af cis-hæmning, og faldende de relative niveau af cis-Delta svækket cis-hæmning. Derfor KD eksperimenter over denne række nøgletal blev udført. Af note, var mængden af Notch receptor og det samlede beløb af transfekteret DNA holdes konstant i alle eksperimenter. Dette vil sikre, at samlede dannelsen påvirkes primært af aktiviteten af cis-ligander og ikke af ændrede niveauer af Notch udtryk af celler.

Det var tidligere vist at co udtryk for Notch og cis-ligander i S2 celler kan resultere i dannelsen af Homotypiske sammenlægninger14. At undersøge, om lignende Homotypiske sammenlægninger blandt S2-Notch & Deltaforbigående eller S2-Notch & takkedeforbigående celler kan kompromittere vores fortolkninger af de samlede kvantificeringer i cis-ligand undersøgelser, en kontrol sammenlægning analyse blev udført mellem S2-Notch & Deltaforbigående og almindelig S2 celler. Antallet af S2 celler, der bruges i disse eksperimenter var den samme som S2-Delta celler, der bruges i cis-Delta eksperimenter. Nogle Homotypiske sammenlægning blev observeret, men kvantificering viste, at de resulterende tilslagsmaterialer bidrager en lav brøkdel af de samlede aggregater, sammenlignet med de Heterotypiske aggregater mellem S2-Notch & Deltaforbigående og S2-Delta celler () Figur 5B).Vi konkludere at observeres ændringerne i antallet af aggregater i cis-ligand assays er primært på grund af den hæmmende effekt af cis-ligander bindingen mellem Notch og trans-Delta.

I Resumé, sammenlægning assays præsenteret i denne protokol giver en let og enkel metode til semi-kvantitative vurdering af trans- og cis-interaktioner Notch receptor og dens ligander. Disse assays kan bruges til at undersøge effekten af genetiske eller farmakologiske Notch pathway modifikatorer på Notch-ligand bindende in vitro- og derfor kan hjælpe med at belyse de underliggende i vivo -virkningerne af disse modifikatorer på Notch mekanismer signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender støtte fra NIH/NIGMS (R01GM084135 til HJN) og Mizutani grundlag for Glycoscience (grant #110071 til HJN), og er taknemmelig for, at Tom V. Lee for diskussioner og forslag på assays, og Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bell, Robert Fleming, Ken Irvine og Drosophila genomforskning ressource Center (DGRC) for plasmider og cellelinjer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124, (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16, (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21, (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465, (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137, (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124, (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9, (6), e1003547 (2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13, (4), e1006723 (2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125, (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61, (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140, (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18, (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239, (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167, (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278, (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132, (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406, (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338, (6111), 1229-1232 (2012).
Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af <em>Drosophila</em> Notch med <em>Trans</em>-ligander og dens hæmning af <em>Cis</em>-ligander
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).More

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter