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Developmental Biology

सेल एकत्रीकरण परख सीआईएसद्वारा ट्रांस-लाइगैंडों और उसके निषेध के साथ Drosophila पायदान के बंधन का मूल्यांकन करने के लिए-लाइगैंडों

doi: 10.3791/56919 Published: January 2, 2018

Summary

वीवो सिस्टम में की जटिलता यह मुश्किल ट्रांसऔर सीआईएस-लाइगैंडों, क्रमश: से सक्रियकरण और पायदान रिसेप्टर के निषेध के बीच अंतर करने के लिए बनाता है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल के आधार पर प्रस्तुत इन विट्रो सेल- Drosophila पायदान की बाध्यकारी गुणात्मक और अर्द्ध मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए ट्रांस-लाइगैंडों बनाम सीआईएस-लाइगैंडों के लिए एकत्रीकरण परख ।

Abstract

पायदान संकेतन एक evolutionarily संरक्षित सेल सेल संचार प्रणाली पशु विकास और वयस्क रखरखाव में मोटे तौर पर इस्तेमाल किया है । पड़ोसी कोशिकाओं से लाइगैंडों के साथ पायदान रिसेप्टर की बातचीत संकेतन मार्ग (ट्रांस-सक्रियण) के सक्रियण लाती है, जबकि एक ही सेल से लाइगैंडों के साथ बातचीत संकेत (सीआईएस-निषेध) रोकता है । ट्रांससक्रियकरण और सीआईएसके बीच उचित संतुलन-निषेध पशु विकास के दौरान कुछ संदर्भों में संकेत पायदान के इष्टतम स्तर की स्थापना में मदद करता है । क्योंकि पायदान के अतिव्यापी अभिव्यक्ति डोमेन और उसके लाइगैंडों कई प्रकार के सेल और प्रतिक्रिया तंत्र के अस्तित्व में, ट्रांसपर दिया पोस्ट-अनुवाद संशोधन के प्रभाव का अध्ययन बनाम सीआईएस-पायदान की बातचीत और vivo में इसकी लाइगैंडों मुश्किल है. यहां, हम सेल में Drosophila S2 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-एकत्रीकरण परख ट्रांस में और सीआईएसमें प्रत्येक ligand को पायदान के बंधन पर एक पायदान मार्ग संशोधक नीचे दस्तक के प्रभाव का आकलन । s2 के एक पायदान-व्यक्त वेक्टर के साथ छुरा या क्षणिक transfected कोशिकाओं को प्रत्येक पायदान ligand (s2-डेल्टा या s2-दांतेदार) व्यक्त कक्षों के साथ मिश्रित कर रहे हैं । heterotypic कोशिका समुच्चय के गठन में रिसेप्टर और लाइगैंडों परिणामों के बीच ट्रांसबंधन और & #62 की रचना प्रति मिलीलीटर की संख्या के संदर्भ में मापा जाता है, 6 कोशिकाओं. सीआईएस-लाइगैंडों के निरोधात्मक प्रभाव की जांच करने के लिए, s2 कोशिकाओं सह व्यक्त पायदान और प्रत्येक ligand s2-डेल्टा या s2-दांतेदार कोशिकाओं के साथ मिश्रित कर रहे हैं और समुच्चय की संख्या के रूप में ऊपर वर्णित मात्रा है । सीआईएसकी उपस्थिति के कारण समुच्चय की संख्या में रिश्तेदार कमी-लाइगैंडों ट्रांस-बाध्यकारी के सीआईएस-ligand-मध्यस्थता निषेध का एक उपाय प्रदान करता है । ये सरल परख अर्द्ध अपने लाइगैंडों को पायदान की बाध्यकारी पर आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ के प्रभाव पर मात्रात्मक डेटा प्रदान कर सकते हैं, और आणविक प्रभाव में vivo अंतर्निहित तंत्र को समझने में मदद कर सकते है पायदान संकेतन पर इस तरह जोड़तोड़ ।

Introduction

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विहित पायदान संकेतन सेल संचार तंत्र है कि पायदान रिसेप्टर्स और उनके लाइगैंडों1के बीच बातचीत की सुविधा के लिए पड़ोसी कोशिकाओं के शारीरिक संपर्क की आवश्यकता के लिए एक छोटी दूरी सेल है । पायदान रिसेप्टर की बातचीत (संकेत प्राप्त कोशिकाओं की सतह पर मौजूद) लाइगैंडों के साथ (संकेत-भेजने की सतह पर मौजूद) पायदान संकेतन शुरू होता है और ट्रांससक्रियण2के रूप में जाना जाता है. दूसरी ओर, पायदान और एक ही सेल में अपने लाइगैंडों के बीच बातचीत पायदान मार्ग के निषेध की ओर जाता है और सीआईएस-संकोच3के रूप में जाना जाता है । ट्रांसऔर सीआईएसके बीच संतुलन-बातचीत इष्टतम ligand-निर्भर पायदान संकेतन4सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । Drosophila एक पायदान रिसेप्टर और दो लाइगैंडों (डेल्टा और दांतेदार) के रूप में स्तनधारी है, जो चार पायदान रिसेप्टर्स और पांच लाइगैंडों [दांतेदार 1 (JAG1), JAG2, डेल्टा की तरह 1 (DLL1), DLL3 और DLL4 है विरोध किया है]5। इस सादगी होने, Drosophila मॉडल पायदान ligand बातचीत पर मार्ग संशोधक के प्रभाव और बाद में पायदान संकेतन पर टुकड़े/अध्ययन करने के लिए आसानी प्रदान करता है । पशु विकास के दौरान कुछ संदर्भों में ( Drosophilaमें विंग विकास सहित), दोनों सीआईएसऔर ट्रांस-बातचीत उचित पायदान संकेतन और सेल भाग्य1प्राप्त करने के लिए शामिल हैं,6 . यह सीआईएसबनाम ट्रांसअपने लाइगैंडों के साथ पायदान की बातचीत पर इन संदर्भों में पायदान मार्ग संशोधक के प्रभाव को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

हमारे समूह पहले की सूचना दी है कि एक कार्बोहाइड्रेट अवशेषों के अलावा xylose बुलाया Drosophila पायदान नकारात्मक कुछ संदर्भों, विंग विकास7सहित में संकेतन पायदान नियंत्रित करता है । शम्स की हानि (एंजाइम कि xylosylates पायदान) पंख नस की एक "हानि" phenotype7की ओर जाता है । हाल ही में, जीन खुराक प्रयोगों और क्लोनल विश्लेषण को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि शम्स की हानि डेल्टा-मध्यस्थता पायदान singling को बढ़ाता है. अंतर करने के लिए कि क्या शम्स म्यूटेंट में बढ़ाया पायदान संकेत कम सीआईएस-निषेध या वृद्धि हुई ट्रांस-सक्रियण, लार्वा विंग काल्पनिक डिस्क में पायदान लाइगैंडों के अस्थानिक एक्सप्रेस अध्ययन का परिणाम है का उपयोग करते हुए डीपीपी-GAL4 ड्राइवर प्रदर्शन किया गया । इन प्रयोगों से पता चलता है कि शम्स लाइगैंडों8द्वारा पायदान सीआईएस-निषेध को प्रभावित किए बिना डेल्टा द्वारा पायदान के पार-सक्रियण नियंत्रित करता है सबूत प्रदान की है । हालांकि, फ़ीड वापस नियमों और अंतर्जात लाइगैंडों के प्रभाव अस्थानिक की व्याख्या को जटिल हो सकता है अध्ययन1,6,9

इस समस्या को हल करने के लिए, Drosophila S2 कोशिकाओं10 उपयोग किया गया है, जो पायदान के लिए एक सरल इन विट्रो प्रणाली प्रदान-ligand बातचीत अध्ययन11,12. S2 कोशिकाओं अंतर्जात पायदान रिसेप्टर और डेल्टा ligand11 व्यक्त नहीं करते हैं और दांतेदार13, जो पायदान-ligand एकत्रीकरण प्रयोगों8को प्रभावित नहीं करता है की एक निम्न स्तर व्यक्त करते हैं. इसलिए, S2 कोशिकाओं वार या क्षणिक transfected पायदान और/या व्यक्तिगत लाइगैंडों (डेल्टा या दांतेदार) द्वारा किया जा सकता है कि विशेष रूप से पायदान रिसेप्टर या इसके लाइगैंडों, या उनमें से एक संयोजन व्यक्त कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए. ligand-एक्सप्रेस s2 कोशिकाओं heterotypic रिसेप्टर-ligand बाध्यकारी11,12,14द्वारा मध्यस्थता समुच्चय के गठन में परिणाम के साथ पायदान-एक्सप्रेस s2 कोशिकाओं के मिश्रण । समग्र गठन के ठहराव पायदान और उसके लाइगैंडों15 (चित्रा 1) के बीच ट्रांसबाध्यकारी का एक उपाय प्रदान करता है । इसी तरह, S2 कोशिकाओं पायदान और डेल्टा या दांतेदार लाइगैंडों (यानी सीआईएस-लाइगैंडों) के साथ सह transfected जा सकता है । सीआईएस-लाइगैंडों इन पायदान-एक्सप्रेस S2 कोशिकाओं में ट्रांस-लाइगैंडों के साथ पायदान के बंधन को निराकृतकरतेहैं और परिणाम में घटी कुल गठन8,12,14सीआईएसकी वजह से कुल गठन में सापेक्ष कमी-लाइगैंडों पायदान और ट्रांस-लाइगैंडों (चित्रा 2) के बीच बाध्यकारी पर सीआईएसलाइगैंडों के निरोधात्मक प्रभाव का एक उपाय प्रदान करता है । तदनुसार, सेल एकत्रीकरण परख ट्रांसऔर सीआईएस-पायदान और उसके लाइगैंडों के बीच बातचीत पर xylosylation के नुकसान के प्रभाव की जांच करने के लिए उपयोग किया गया ।

यहाँ, हम Drosophila S2 कोशिकाओं का उपयोग करके ट्रांस-लाइगैंडों और इसके निषेध द्वारा सीआईएसलाइगैंडों के साथ पायदान के बंधन का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से सेल एकत्रीकरण परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एक उदाहरण के रूप में, हम पायदान और ट्रांसडेल्टा8के बीच बाध्यकारी पर पायदान xylosylation के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए हमें अनुमति दी है कि डेटा प्रदान करते हैं । ये सरल परख पायदान के एक अर्द्ध मात्रात्मक आकलन प्रदान-ligand इन विट्रो में बातचीत और मदद आणविक पायदान मार्ग संशोधक के vivo में प्रभाव अंतर्निहित तंत्र का निर्धारण ।

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Protocol

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1. शम्स पछाड़ना के लिए डबल कतरा आरएनए (dsRNA) की तैयारी

  1. पीसीआर उत्पादों के प्रवर्धन
    1. का प्रयोग करें जंगली प्रकार के पीले सफेद (y डब्ल्यू) जीनोमिक डीएनए और पीएसी 5.1-EGFP के रूप में टेंपलेट और निंनलिखित प्राइमर जोड़े डीएनए dsRNA संश्लेषण में इस्तेमाल किया टुकड़े बढ़ाना । निम्नलिखित पीसीआर थर्मल प्रोफाइल का प्रयोग करें: विकार (९५ डिग्री सेल्सियस, 30 एस), एनीलिंग (५८ डिग्री सेल्सियस, 30 एस) और विस्तार (७२ ° c, 1 मिनट) ।
      बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) dsRNA प्राइमर्स (5 '-3 ')-
      फॉरवर्ड प्राइमरी-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      रिवर्स प्राइमर-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      शम्स dsRNA प्राइमरी (5 '-3 ')-
      फॉरवर्ड प्राइमरी-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      रिवर्स प्राइमर-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      नोट: EGFP dsRNA का उपयोग ऋणात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है ।
  2. जेल-निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक जेल शोधन किट का उपयोग कर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) उत्पादों को शुद्ध ।
  3. इन विट्रो में एक वाणिज्यिक उत्पाद निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक T7 प्रवर्तक से टाइप करने में सक्षम का उपयोग कर प्रतिलेखन ।
  4. निर्माता के प्रोटोकॉल और स्टोर पर-८० ° c के अनुसार एक आरएनए शुद्धि किट का उपयोग कर dsRNA को शुद्ध करें ।
  5. निम्न चरणों (1.5.1-1.5.5) का उपयोग करके शम्स पछाड़ना की कार्यकुशलता का आकलन करें ।
    1. गणना कोशिकाओं को मैंयुअल रूप से एक hemocytometer और प्लेट 5 x 105 S2 के प्रत्येक अच्छी तरह से एक थाली में एक 6 अच्छी प्लेट के 1 मिलीलीटर/Schneider के माध्यम से पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और १०० U/
    2. EGFP-या शम्स dsRNA के ७.५ µ g को प्रत्येक वेल में जोड़ें और 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन करें ।
    3. फसल नियंत्रण (EGFP dsRNA-इलाज) और शम्स dsRNA द्वारा इलाज S2 कोशिकाओं कोमल pipetting द्वारा पीछा १,००० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस और आरएनए अलगाव के लिए प्रक्रिया के अनुसार एक आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके निर्माता के प्रोटोकॉल ।
    4. एक spectrophotometer और प्रक्रिया १०० आरएनए के 1-चरण qRT-पीसीआर वाणिज्यिक qPCR रिएजेंट और प्राइमर/जांच और निम्नलिखित पीसीआर थर्मल प्रोफाइल: विकार (९५ ° c, 15 एस) और एनीलिंग/विस्तार (६० ° c, 1 मिनट) का उपयोग कर के लिए का उपयोग कर आरएनए को बढ़ाता है ।
      नोट: कृपया प्राइमरी/जांच सेट और इन अध्ययनों में शम्स और नियंत्रण qRT-पीसीआर प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया साधन के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
    5. 2-ΔΔCT पद्धति16का उपयोग करते हुए सापेक्ष शम्स mRNA स्तरों की गणना करें ।

2. पायदान रिसेप्टर और ट्रांस-लाइगैंडों के बीच बंधन का आकलन

  1. संकेत प्राप्त कोशिकाओं को तैयार (S2 के पायदान रिसेप्टर एक्सप्रेस कोशिकाओं).
    1. गणना कोशिकाओं को मैंयुअल रूप से एक hemocytometer और प्लेट 5 x 105 s2 और स्थिर s2-पायदान कोशिकाओं में से प्रत्येक अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर में एक 6-अच्छी थाली के Schneider के माध्यम से पूरक का उपयोग कर 10% FBS और १०० यू/एमएल पेनिसिलिन-Streptomycin ।
      नोट: Drosophila जीनोमिक्स रिसोर्स सेंटर (DGRC) से उपलब्ध है जो S2-पायदान कोशिकाओं के लिए, मीडिया में २०० एनएम methotrexate जोड़ें । ०.५ mm methotrexate शेयर सॉल्यूशन तैयार करने के लिए, पहले 1 मीटर NaOH के २५० µ एल में 20 एमएम methotrexate सॉल्यूशन तैयार करें । अगले, 1 मीटर फॉस्फेट बफर खारा में ०.५ mM करने के लिए इस समाधान को पतला और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । S2 के पायदान कोशिकाओं में, पायदान प्रोटीन की अभिव्यक्ति pMT वेक्टर में Drosophila metallothionein प्रमोटर के नियंत्रण में है ।
    2. dsRNA के ७.५ µ g को एक अच्छी तरह से जोड़ें और 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    3. 3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर पायदान और गर्मी की अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए ०.७ mM CuSO4 जोड़ें ।
      नोट: CuSO4 metallothionein प्रमोटर द्वारा नियंत्रित प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  2. संकेत भेजने कोशिकाओं (S2 सेल एक्सप्रेस डेल्टा या दांतेदार लाइगैंडों) तैयार करते हैं ।
    1. गणना कोशिकाओं को मैंयुअल रूप से एक hemocytometer और प्लेट ~ 5 x 106 स्थिर s2-डेल्टा या s2-दांतेदारटॉम की कोशिकाओं का उपयोग कर एक अच्छी तरह से Schneider के माध्यम से 10% FBS और १०० यू/एमएल पेनिसिलिन-Streptomycin के साथ पूरक के 1 मिलीलीटर में 6-अच्छी तरह से थाली के/
      नोट: s2-डेल्टा कोशिकाओं और १०० µ g/एमएल hygromycin के लिए २०० एनएम methotrexate जोड़ें मीडिया में s2-दांतेदारटॉम कोशिकाओं के लिए । डेल्टा और दांतेदारटॉमकी अभिव्यक्ति-एक टमाटर टैग, कार्यात्मक दांतेदार के संस्करण12- Drosophila metallothionein प्रमोटर में पीएमटी वेक्टर के अंतर्गत है ।
    2. 3 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर लाइगैंडों और मशीन की अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए ०.७ mM CuSO4 जोड़ें ।
  3. संकेत-प्रेषण और संकेत-प्राप्त कक्षों के बीच एग्रीगेट निष्पादित करें.
    1. फसल dsRNA-उपचार s2 (नियंत्रण) और कोमल pipetting और प्लेट द्वारा s2 के पायदान कोशिकाओं २.५ x 105 कोशिकाओं hemocytometer द्वारा मैनुअल गिनती के बाद एक 24 अच्छी तरह से थाली में/।
    2. Schneider के माध्यम से २०० µ एल की कुल मात्रा में 5 x 105 स्थिर S2-डेल्टा या s2-दांतेदारटॉम कोशिकाओं को जोड़ें (10% FBS और १०० यू/एमएल पेनिसिलिन-Streptomycin के साथ पूरक) ।
      नोट: सभी S2 कोशिकाओं हैंडलिंग (चढ़ाना, प्रेरण और dsRNA उपचार सहित) एक सुरक्षा कैबिनेट के तहत किया गया था ।
    3. १५० rpm (९४२.४८ रेड/मिनट) में एक कक्षीय शेखर पर प्लेट प्लेस ।
    4. 1 मिनट के बाद, एक अच्छी तरह से सामग्री मिश्रण और 20 µ ले बाहर समुच्चय की संख्या की गिनती के लिए l ।
      1. साथ ही साथ एक प्रतिनिधि छवि ले औंधा यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 10x आवर्धन (पीएलएल 10/0.25 उद्देश्य).
      2. किसी hemocytometer का उपयोग करके एग्रीगेट (& #62; 6 कक्ष) को मैंयुअली गिनना ।
    5. एक शेखर पर प्लेट लगाएं ।
    6. छवि अधिग्रहण दोहराने और 5 मिनट और एकत्रीकरण के 15 मिनट के बाद गिनती ।
  4. ट्रांस-बाइंडिंग के ठहराव प्रदर्शन करें ।
    1. एक पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में s2 कोशिकाओं और s2-डेल्टा या s2-दांतेदारटॉम कोशिकाओं के बीच प्रति मिलीलीटर समुच्चय की संख्या की गणना ।
    2. s2-पायदान और s2-डेल्टा या s2-दांतेदारटॉम कोशिकाओं ( ट्रांसबाइंडिंग के परिमाण) के बीच प्रति मिलीलीटर समुच्चय की संख्या की गणना ।

3.सीआईएसद्वारा पायदान और ट्रांस-लाइगैंडों के बीच बाध्यकारी के निषेध का मूल्यांकन-लाइगैंडों

  1. संकेत-प्राप्त करने वाले कक्ष तैयार करें ।
    1. प्लेट 5 x 105 S2 कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से में एक 6-well थाली में 1 मिलीलीटर/Schneider के मध्यम पूरक के साथ 10% FBS और १०० U/एमएल पेनिसिलिन-Streptomycin ।
    2. dsRNA के ७.५ µ g को एक अच्छी तरह से जोड़ें और 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    3. pBluescript और पीएमटी-पायदान11 (DGRC) के साथ अकेले या पीएमटी-पायदान और पीएमटी-डेल्टा11 (DGRC) या पीएमटी-दांतेदार 17 के लिए कुल के साथ dsRNA-इलाज कोशिकाओं को सह-transfect 2 µ जी का डीएनए एकाग्रता/अच्छी तरह से निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर ।
      नोट: pBluescript नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । co-transfected कोशिकाओं को S2-पायदान & #38;D eltaक्षण िक या s2-पायदान & #38; दांतेदारपरिवर्तनीय कोशिकाओं के बाद कहा जाएगा ।
    4. 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर क्षणिक-transfected S2 कोशिकाओं की मशीन
    5. ०.७ mM CuSO4 जोड़ें पायदान और लाइगैंडों की अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए और 25 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए गर्मी ।
  2. २.२ में वर्णित के रूप में संकेत-प्रेषण कक्ष तैयार करें ।
  3. अनुभाग २.३ में बताए गए अनुसार संकेत-प्रेषण और संकेत-प्राप्त कक्षों के बीच एग्रीगेट निष्पादित करें.
  4. ट्रांस सीआईएसद्वारा बाध्यकारी-लाइगैंडों के रोकता है ।
    1. एक पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में s2 कोशिकाओं और s2-डेल्टा या s2-दांतेदार कोशिकाओं के बीच प्रति मिलीलीटर समुच्चय की संख्या की गणना ।
    2. इस प्रकार के रूप में सीआईएस-लाइगैंडों द्वारा निषेध की भयावहता को बढ़ाता है ।
      1. s2-पायदानक्षण िक और s2-डेल्टा कोशिकाओं के बीच समुच्चय की एक संख्या के रूप में परिभाषित करें ।
      2. B को परिभाषित s2 कोशिकाओं के बीच समुच्चय की संख्या के रूप में पायदान और डेल्टा (s2-पायदान & #38;D eltaक्षणिक) और S2-डेल्टा कोशिकाओं के साथ transfected सह ।
      3. सापेक्ष एकत्रीकरण की गणना C = (B x 100)/
      4. १००-ligand (डेल्टा या दांतेदार) के रूप में सीआईएसद्वारा निषेध के परिमाण की गणना- सी
        नोट: एक उदाहरण के रूप में, यदि सापेक्ष एकत्रीकरण ४५% है, तो सीआईएस-लाइगैंडों के लिए ५५% द्वारा ट्रांसबाध्यकारी बाधित माना जाता है ।

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Representative Results

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हमारे vivo में टिप्पणियों का सुझाव दिया है कि xylosyltransferase जीन शम्स परिणामों की हानि वृद्धि हुई डेल्टा के कारण संकेतन के लाभ में, मध्यस्थता ट्रांस- सीआईएसको प्रभावित किए बिना पायदान के सक्रियकरण-निषेध लाइगैंडों द्वारा8पायदान । इस धारणा का परीक्षण करने के लिए, इन विट्रो में सेल एकत्रीकरण परख प्रदर्शन किया गया । पहले, S2 कोशिकाओं में शम्स अभिव्यक्ति नीचे शम्स dsRNA का उपयोग कर खटखटाया था । नियंत्रण के रूप में EGFP dsRNA का उपयोग किया गया । पछाड़ना (केडी) की दक्षता वास्तविक समय पीसीआर द्वारा जांच की गई थी और ८०%8से अधिक होने के लिए दिखाया गया था । फिर, ट्रांसडेल्टा के साथ-साथ पायदान रिसेप्टर की बाध्यकारी के रूप में है । s2-पायदान और s2-डेल्टा कोशिकाओं के बीच एकत्रीकरण उन्हें मिश्रण के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर जांच की गई । सादा s2 कोशिकाओं और s2-डेल्टा कोशिकाओं के बीच एकत्रीकरण पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में लिया गया था । चित्रा 3 मिश्रण के बाद अलग समय अंक (1, 5, 15 और 30 मिनट) में गठन समुच्चय की संख्या का संकेत ग्राफ दिखाता है । 1 और 5 मिनट के बीच समुच्चय की संख्या में तीव्र वृद्धि देखी गई । बाद में, समुच्चय की संख्या में एक धीमी दर से 30 मिनट तक बढ़ाने के लिए जारी रखा । इसलिए, कुल गठन 1, 5 और 15 मिनट में imaged था और समुच्चय की संख्या मिश्रण के 5 मिनट के बाद मात्रा था ।

चित्र 4a स्थिर S2 पायदान और s2-डेल्टा कोशिकाओं के बीच सेल एकत्रीकरण परख के प्रतिनिधि छवियों पायदान रिसेप्टर और ट्रांसडेल्टा के बीच बंधन पर शम्स केडी के प्रभाव का आकलन करने के लिए दिखाता है । छवियाँ तीन-बार अंक (1, 5 और 15 मिनट) पर एकत्रीकरण दिखाएँ. पृष्ठभूमि नियंत्रण के लिए, सादा s2 कोशिकाओं ( शम्स dsRNA के साथ इलाज) s2 डेल्टा कोशिकाओं के साथ मिलाया गया । EGFP dsRNA-इलाज s2-पायदान कोशिकाओं s2-डेल्टा कोशिकाओं है, जो समय के साथ संख्या में वृद्धि के साथ समुच्चय का गठन किया । इसके विपरीत, शम्स dsRNA-इलाज S2-पायदान कोशिकाओं समुच्चय तेजी से, और समुच्चय बड़ा और नियंत्रण वालों (चित्रा 4B) की तुलना में संख्या में अधिक थे । यह संकेत दिया है कि शम्स स्तर कम डेल्टा8के साथ पायदान की ट्रांसबाध्यकारी बढ़ाता है ।

यह जांचने के लिए कि क्या शम्स-लाइगैंडों के निरोधात्मक प्रभाव को पायदान और ट्रांस-डेल्टा के बीच बाध्यकारी होने पर नियंत्रित करता है, हमने पहले स्थापित किया था कि संकेत-प्राप्त कक्ष में पायदान और डेल्टा की सह-अभिव्यक्ति कोशिका एकत्रीकरण को कम कर सकती है पायदान और ट्रांसडेल्टा ने मध्यस्थता की । चित्र 5 . सीआईएस-डेल्टा के विभिन्न मात्रा के साथ eltaपरिवर्तनीय कोशिकाओं;D s2-डेल्टा और s2-पायदान & #38 के बीच गठित समुच्चय की संख्या का संकेत ग्राफ दिखाता है । Transfecting की बराबर मात्रा-और डेल्टा-अभिव्यक्ति S2 कोशिकाओं में नाटकीय रूप से इन कोशिकाओं और S2-डेल्टा कोशिकाओं के बीच गठित समुच्चय की संख्या कम हो जाती है का निर्माण करती है । इसके अलावा, समुच्चय की संख्या में वृद्धि में सीआईएस-डेल्टा परिणाम की राशि को कम करने, यह दर्शाता है कि पायदान की सीमा में/-डेल्टा इन परख में इस्तेमाल किया अनुपात, सीआईएस-डेल्टा पायदान के बीच बंधन को बाधित कर सकते हैं और एक खुराक पर निर्भर तरीके से ट्रांसडेल्टा । चूंकि s2-पायदान & #38;D eltaक्षण िक कोशिकाओं दोनों पायदान और डेल्टा एक्सप्रेस, वे homotypic समुच्चय के रूप में स्वतंत्र रूप से S2-डेल्टा कोशिकाओं के फार्म हो सकता है । की जांच करने के लिए यदि s2-पायदान & #38;D eltaक्षण िक कोशिकाओं के बीच homotypic समुच्चय के गठन सीआईएस-संकोच चित्रा 5में दिखाया गया परख में एक प्रकारक हो सकता है, हम S2 कोशिकाओं और मात्रा के साथ इन कोशिकाओं को मिलाया समुच्चय. चित्रा 5B s2-पायदान & #38;D eltaक्षण िक कोशिकाओं विभिन्न पायदान पर व्यक्त/सीआईएस-डेल्टा अनुपात के साथ s2 कोशिकाओं मिश्रण के बाद गठित समुच्चय की संख्या से पता चलता है । चित्र 5 में दर्शाए अनुसार heterotypic समुच्चय की तुलना में homotypic समुच्चय की एक जगह छोटी संख्या देखी गई । हम निष्कर्ष है कि इन एकत्रीकरण परख श्रद्धालुओं पायदान और ट्रांस-डेल्टा के बीच बाध्यकारी पर सीआईएसडेल्टा के प्रभाव को मापने ।

हम अगले सीआईएस-डेल्टा की निरोधात्मक क्षमता पर शम्स केडी के प्रभाव की जांच की । इस छोर तक s2-डेल्टा और s2-पायदान & #38;D eltaक्षण िक कोशिकाओं के बीच एकत्रीकरण की जांच की गई । चित्रा 6A s2-डेल्टा कोशिकाओं और s2-पायदानक्षण िक (नियंत्रण) या s2-पायदान & #38;D eltaपरिवर्तनीय कोशिकाओं के बीच एकत्रीकरण के प्रतिनिधि छवियों को दर्शाता है. s2-डेल्टा और EGFP dsRNA-इलाज s2 पायदानक्षण िक कोशिकाओं समुच्चय है, जो समय के साथ संख्या में वृद्धि s2-डेल्टा और स्थिर s2-पायदान कोशिकाओं (चित्रा 4) के बीच एकत्रीकरण करने के लिए इसी तरह का गठन किया । विशेष रूप से, मिश्रण s2-डेल्टा और s2-पायदान & #38;D eltaक्षण िक कोशिकाओं सह पायदान की बराबर मात्रा के साथ transfected-और डेल्टा-अभिव्यक्ति plasmids दोनों EGFP केडी और शम्स केडी पर कम समुच्चय का गठन, सुझाव है कि कम शम्स के स्तर को ब्लॉक पायदान/ट्रांसडेल्टा बाइंडिंग के लिए सीआईएस-डेल्टा की क्षमता को प्रभावित नहीं करता है । बेहतर सीआईएसकी गतिविधि पर शम्स केडी के प्रभाव का आकलन करने के लिए-डेल्टा, सीआईएसद्वारा निषेध की भयावहता-डेल्टा पायदान की एक सीमा से अधिक रिश्तेदार एकत्रीकरण प्रतिशत की गणना द्वारा मापा गया था/सीआईएस-डेल्टा अनुपात के रूप में खंड 3.4.2 में बताया । सापेक्ष एकत्रीकरण के ठहराव EGFP और शम्स dsRNA उपचार (फिगर घमण्ड) पर एकत्रीकरण की एक तुलनीय निषेध दिखाया । साथ में, इन टिप्पणियों दृढ़ता से सुझाव है कि xylosylation की हानि सीआईएस-निषेध8प्रभावित किए बिना ट्रांसबाध्यकारी को बढ़ावा देता है, और शम्स में मनाया विंग नस हानि phenotype के लिए एक आणविक तंत्र प्रदान म्यूटेंट ।

Figure 1
चित्र 1: ट्रांस-बाइंडिंग के लिए कक्ष एकत्रीकरण परख के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । रिसेप्टर (s2-पायदान) और ligand (s2-डेल्टा या s2-दांतेदार) ०.७ mM CuSO4द्वारा s2 कोशिकाओं व्यक्त की प्रेरण दिखा आरेख । दोनों S2 कोशिकाओं की प्रेरण मिश्रण है, जो समुच्चय बनाने के लिए जाता है के बाद है । ये समुच्चय (& #62; 6 कोशिकाएं) छबि और मात्रा हैं ।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सीआईएस-निषेध का आकलन करने के लिए सेल एकत्रीकरण परख के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । s2 कोशिकाओं पीएमटी पायदान (s2-Nक्षणिक) के साथ क्षणिक transfected थे, पीएमटी-पायदान और पीएमटी-डेल्टा (s2-पायदान & #38;D eltaक्षणिक), या पीएमटी-पायदान और पीएमटी-दांतेदार (s2-पायदान & #38; दांतेदारक्षणिक). ०.७ mM CuSO द्वारा प्रेरण के बाद4 और S2 के साथ मिश्रण-डेल्टा कोशिकाओं, समुच्चय (& #62; 6 कोशिकाओं) मात्रा हैं । सीआईएसद्वारा निषेध-लाइगैंडों उपस्थिति और प्रत्येक सीआईएस-ligand की अनुपस्थिति में रिश्तेदार एकत्रीकरण प्रतिशत के मामले में मापा जाता है । सीआईएसके प्रभाव-पायदान और ट्रांस-दांतेदार के बीच बंधन पर लाइगैंडों S2-दांतेदारटॉम कोशिकाओं (नहीं दिखाया गया है) के साथ क्षणिक transfected कोशिकाओं को मिलाकर निर्धारित किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: s2 पायदान और s2 या s2-डेल्टा कोशिकाओं के बीच विभिन्न समय बिंदुओं पर एकत्रीकरण. ग्राफ़ विभिंन समय बिंदुओं (1, 5, 15 और 30 मिनट) में प्रति मिलीलीटर समुच्चय की संख्या दर्शाता है जो कि कक्षों के संकेत प्रकारों के बीच है । त्रुटि पट्टी माध्य (SEM) की तीन प्रतिकृति मानक त्रुटि इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पायदान और ट्रांसडेल्टा द्वारा मध्यस्थता सेल एकत्रीकरण. (A) छवियाँ विभिन्न समय बिंदुओं (1, 5 और 15 मिनट) पर समुच्चय दिखाएँ. शम्स dsRNA-इलाज सादा S2 कोशिकाओं और S2-डेल्टा कोशिकाओं के बीच एकत्रीकरण पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में लिया गया था । शम्स-dsRNA इलाज s2-पायदान कोशिकाओं s2-डेल्टा कोशिकाओं के साथ मिश्रण के बाद EGFP dsRNA-इलाज (नियंत्रण) s2 के पायदान कोशिकाओं की तुलना में समुच्चय की संख्या और आकार में वृद्धि दिखा । स्केल बार = १०० µm. (B) एग्रीगेट के 5 मिनट के बाद 6 कक्षों से अधिक कक्ष एग्रीगेट की संख्या का ठहराव । त्रुटि पट्टियां SEM. * P & #60; ०.०१ (प्रसरण (ANOVA) का एक-तरफ़ा विश्लेषण) इंगित करती हैं । तीन स्वतंत्र दोहराने के साथ तीन प्रतिकृति प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सीआईएस-डेल्टा एक खुराक पर निर्भर तरीके से पायदान और ट्रांसडेल्टा द्वारा मध्यस्थता सेल कुल गठन को रोकता है । (क) ग्राफ से पता चलता है (समुच्चय की संख्या के संदर्भ में) s2-डेल्टा कोशिकाओं और s2 कोशिकाओं के बीच कुल मात्रा और सीआईएसके लिए अभिव्यक्ति वैक्टर के विभिन्न अनुपात के साथ क्षणिक transfected-डेल्टा (1:0, 1:1, 1:0.5, 1:0.2 और 1:0.1) । त्रुटि पट्टियां SEM. * P & #60; ०.०१ (एक-तरफ़ा ANOVA) इंगित करती हैं । तीन स्वतंत्र दोहराने के साथ तीन प्रतिकृति प्रदर्शन किया गया । ध्यान दें कि एकत्रीकरण में वृद्धि में सीआईएसडेल्टा परिणाम के स्तर को कम करने, संभावना कम सीआईएस-निषेध के कारण । () homotypic एग्रीगेट दिखा ग्राफ (एमएल प्रति समुच्चय की संख्या के संदर्भ में) S2 कोशिकाओं में क्षणिक और डेल्टा के विभिंन अनुपात के साथ transfected (1:0, 1:1, 1:0.5, 1:0.2 और 1:0.1) और सादा S2 कोशिकाओं के साथ मिलाया । त्रुटि पट्टियों का संकेत SEM. समुच्चय की संख्या s2-डेल्टा और s2-पायदान & #38;D eltaक्षण िक कोशिकाओं के बीच गठित heterotypic समुच्चय की संख्या से बहुत छोटा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: शम्स का पछाड़ना सीआईएसडेल्टा के निरोधात्मक गतिविधि को प्रभावित नहीं करता है । () दिखाया गया है सीआईएसपर शम्स केडी के प्रभाव के प्रतिनिधि छवियों को पायदान/ट्रांसडेल्टा बाध्यकारी द्वारा मध्यस्थता सेल एकत्रीकरण की डेल्टा-मध्यस्थता निषेध. छवियां विभिंन समय बिंदुओं (1, 5 और 15 मिनट) पर समुच्चय दिखाती हैं । शम्स dsRNA-इलाज सादा S2 कोशिकाओं और S2-डेल्टा कोशिकाओं के बीच एकत्रीकरण पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में लिया गया था । छुरा transfected s2 के पायदान कोशिकाओं के लिए इसी तरह, शम्स केडी S2-डेल्टा और s2-पायदानक्षण िक कोशिकाओं के रूप में नियंत्रण (EGFP dsRNA-इलाज) की तुलना में समुच्चय की संख्या में वृद्धि हुई । एक 1:1 अनुपात में पायदान के साथ सीआईएस-डेल्टा की सह-अभिव्यक्ति नियंत्रण में समुच्चय की संख्या में तुलनीय कमी के परिणामस्वरूप (EGFP dsRNA-इलाज) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शम्स dsRNA इलाज कोशिकाओं में । स्केल पट् टी = १०० µm. (B) ग्राफ़ इंगित अनुपातों (1:0, 1:1, 1:0.5, 1:0.2 और 1:0.1) पायदान और सीआईएस-डेल्टा के साथ s2-डेल्टा कोशिकाओं और s2 कोशिकाओं के बीच सापेक्ष समुच्चय दिखाता है । सीआईएस-डेल्टा अनुपात- EGFP और शम्स dsRNA उपचार प्रत्येक पायदान पर एकत्रीकरण में एक तुलनीय कमी दिखा । यहाँ प्रस्तुत आंकड़ों में तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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विहित पायदान संकेतन पायदान रिसेप्टर और उसके लाइगैंडों5के बीच बातचीत पर निर्भर करता है । हालांकि पायदान मार्ग पर सबसे अधिक अध्ययन मुख्यतः पायदान और पड़ोसी कोशिकाओं (ट्रांस), पायदान और एक ही सेल लाइगैंडों में लाइगैंडों के बंधन पर विचार बातचीत करते हैं, और इन तथाकथित सीआईएस-बातचीत पायदान में एक निरोधात्मक भूमिका निभा सकते हैं सिग्नलिंग3,4. तदनुसार, विहित पायदान संकेतन पर एक संशोधक के प्रभाव अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए, यह अक्सर पायदान-ligand बातचीत (ट्रांस और सीआईएस) के दोनों प्रकार की जांच करने के लिए प्रासंगिक है । हालांकि, पशु विकास के दौरान कई संदर्भों में, इन दोनों के संबंधों की भागीदारी और उनके फ़ीड वापस विनियमन vivo अध्ययन1,6 में पेचीदा है । वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम इन विट्रो सेल एकत्रीकरण परख Drosophila S2 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए ट्रांसलाइगैंडों और सीआईएसद्वारा अपनी बाधा के साथ पायदान रिसेप्टर के बंधन का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करते हैं- लाइगैंडों. हम रिसेप्टर ligand बाइंडिंग पर पायदान संकेत (xylosyltransferase शम्स7,8) के एक आनुवंशिक संशोधक के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस पद्धति का उपयोग प्रस्तुत किया है.

सबसे पहले, एकत्रीकरण परख स्थिर s2-डेल्टा और EGFP या शम्स dsRNA-इलाज स्थिर s2-पायदान कोशिकाओं के बीच प्रदर्शन किया गया ट्रांसपर शम्स केडी के प्रभाव की जांच बाध्यकारी । शम्स dsRNA-इलाज सादा s2 कोशिकाओं के साथ S2-डेल्टा कोशिकाओं का समुच्चय पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में लिया गया था । शम्स केडी नियंत्रण की तुलना में s2 के पायदान और s2-डेल्टा कोशिकाओं के बीच एकत्रीकरण बढ़ाया । यह ट्रांसबाध्यकारी प्रयोगों के समानांतर में सादा s2 कोशिकाओं और ligand-ले जाने वाली s2 कोशिकाओं के बीच पृष्ठभूमि प्रयोगात्मक नियंत्रण एकत्रीकरण करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि Drosophila s2 कोशिकाओं अंतर्जात पायदान रिसेप्टर और डेल्टा ligand11व्यक्त नहीं करते हैं, दांतेदार के निम्न स्तर की अभिव्यक्ति S2 कोशिकाओं13में रिपोर्ट की जाती है. इस पर विचार, सादा S2 कोशिकाओं पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में सेल एकत्रीकरण परख में इस्तेमाल किया गया; इन कक्षों में कोई एग्रीगेट (आरेख 5B) नहीं दिखाई दिया । समुच्चय मैन्युअल रूप से एक hemocytometer का उपयोग कर गिना रहे हैं. कुल ठहराव में एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए, मिश्रित सेल जनसंख्या के 10-20 µ l को गिनती के लिए प्रति अच्छी तरह से कम से कम तीन विभिन्न क्षेत्रों से pipetted किया जा सकता है । इन परख स्वस्थ बढ़ती S2 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है । S2 कोशिकाओं के अर्द्ध अनुयाई प्रकृति को ध्यान में रखते हुए, कोमल pipetting जबकि एकत्रीकरण परख के दौरान कोशिकाओं और लगातार मिलाते हुए इकट्ठा महत्वपूर्ण हैं ।

पहले, हम और दूसरों को अच्छी तरह से इस्तेमाल किया है की स्थापना की, घुलनशील ligand-रिसेप्टर बाइंडिंग की एक मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए परख ligand ट्रांस17,18,19में बाध्यकारी, 20. के बाद से एकत्रीकरण परख अर्द्ध मात्रात्मक हैं, घुलनशील ligand बाध्यकारी परख भी पायदान-ligand ट्रांस-बाध्यकारी पर शम्स केडी के प्रभाव की जांच प्रदर्शन किया गया । मनाया परिणाम रुझान में एकत्रीकरण परख8से प्राप्त उन लोगों के साथ समान थे । यह ट्रांसलाइगैंडों के साथ पायदान के बंधन के वफादार मूल्यांकन का सत्यापन सेल एकत्रीकरण परख का उपयोग कर । हालांकि कुल गठन रिसेप्टर की एक readout-ligand बाध्यकारी है, यह जटिल हो सकता है अगर पायदान रिसेप्टर या उसके लाइगैंडों की सतह अभिव्यक्ति दी संशोधक से प्रभावित है. यह सेल एकत्रीकरण परख की सीमा पर प्रकाश डाला गया, के रूप में यह प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है अगर कुल गठन में परिवर्तन की वजह से बदल रिसेप्टर ligand बाध्यकारी या बदल सतह अभिव्यक्ति की है । इसलिए, एकत्रीकरण के लिए समानांतर परख, पायदान और लाइगैंडों की सतह अभिव्यक्ति पर प्रत्येक संशोधक के प्रभाव S2 कोशिकाओं में परीक्षण किया जाना चाहिए । हमारे अध्ययन के संदर्भ में, पायदान और डेल्टा के सतह स्तर शम्स dsRNA-इलाज S2 कोशिकाओं8में प्रभावित नहीं थे ।

सीआईएस-लाइगैंडों के अलावा ट्रांसबाइंडिंग के निषेध की जांच करने के लिए, एकत्रीकरण परख s2-डेल्टा कोशिकाओं और EGFP या शम्स dsRNA-स्वास्थ्यकर्मी s2-निशान & #38;D eltaपरिवर्तनीय कोशिकाओं के बीच प्रदर्शन किया गया . इन कोशिकाओं के बीच गठित समुच्चय की संख्या s2-डेल्टा कोशिकाओं और s2-पायदानक्षण िक कोशिकाओं के बीच गठित समुच्चय की संख्या के साथ तुलना की गई थी । समुच्चय की संख्या में सापेक्ष कमी की गणना की गई और सीआईएस-डेल्टा द्वारा निषेध की भयावहता के लिए एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया । नियंत्रण प्रयोगों से पता चला है कि सीआईएस-लाइगैंडों एक मजबूत और खुराक पर निर्भर अवरोध दिखाने के पायदान/ सीआईएसके लिए पायदान की एक जगह व्यापक रेंज पर डेल्टा बाध्यकारी-ligand अनुपात (1:1 1:0.1) (आंकड़ा 5 ए)8 . एक 1:1 अनुपात सीआईएसके मजबूत डिग्री के परिणामस्वरूप-निषेध, और सीआईएसके सापेक्ष स्तर कम-डेल्टा कमजोर सीआईएस-निषेध... तदनुसार, अनुपात के इस रेंज पर केडी प्रयोगों प्रदर्शन किया गया । नोट की, पायदान रिसेप्टर की राशि और transfected डीएनए की कुल राशि सभी प्रयोगों में लगातार रखा गया था. यह सुनिश्चित करेगा कि कुल गठन मुख्य रूप से सीआईएस-लाइगैंडों की गतिविधि से प्रभावित है और नहीं बदल द्वारा पायदान अभिव्यक्ति के स्तर की कोशिकाओं द्वारा ।

यह पहले दिखाया गया है कि पायदान और सीआईएस-S2 कोशिकाओं में लाइगैंडों के सह अभिव्यक्ति homotypic एग्रीगेट के गठन में परिणाम कर सकते हैं14. S2 के बीच समान homotypic एग्रीगेट-पायदान & #38;D eltaक्षण िक या S2-पायदान & #38; दांतेदारपरिवर्तनीय कोशिकाओं सीआईएस-ligand अध्ययन में समग्र quantifications के हमारे व्याख्याओं समझौता कर सकते हैं कि जांच करने के लिए, एक नियंत्रण एकत्रीकरण परख S2-पायदान & #38;D eltaक्षण िक और सादा S2 कोशिकाओं के बीच किया गया था । इन प्रयोगों में इस्तेमाल s2 कोशिकाओं की संख्या s2-डेल्टा कोशिकाओं के रूप में एक ही था सीआईएस-डेल्टा प्रयोगों में इस्तेमाल किया । कुछ homotypic एकत्रीकरण मनाया गया था, लेकिन ठहराव पता चला कि परिणामी समुच्चय S2 के बीच heterotypic समुच्चय के साथ तुलना में कुल समुच्चय के एक कम अंश योगदान & #38;D eltaक्षण िक और s2-डेल्टा कोशिकाओं ( चित्रा 5B).हम निष्कर्ष है कि सीआईएस-ligand परख में समुच्चय की संख्या में मनाया परिवर्तन मुख्य रूप से सीआईएसके निरोधात्मक प्रभाव के कारण पायदान और ट्रांसडेल्टा के बीच बाध्यकारी पर लाइगैंडों हैं ।

सारांश में, एकत्रीकरण इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत की परख ट्रांसऔर सीआईएस-पायदान रिसेप्टर और उसके लाइगैंडों की बातचीत के अर्द्ध मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक आसान और सरल पद्धति प्रदान करते हैं । इन परख विट्रो में ligand बंधन पर आनुवंशिक या औषधीय पायदान मार्ग संशोधक के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इसलिए पायदान पर इन संशोधक के vivo में प्रभाव अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट मदद कर सकते हैं सिग्नलिंग.

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

लेखक NIH/NIGMS (R01GM084135 to HJN) और Mizutani फाउंडेशन फॉर Glycoscience (ग्रांट #110071 टू HJN) से समर्थन स्वीकार करते हैं, और परख पर विचार विमर्श और सुझावों के लिए टॉम वी. ली के आभारी हैं, और Spyros Artavanis-Tsakonas, ह्यूगो Bellen, रॉबर्ट फ्लेमिंग, केन इर्विन और plasmids और सेल लाइंस के लिए Drosophila जीनोमिक्स रिसोर्स सेंटर (DGRC) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

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References

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सेल एकत्रीकरण परख <em>सीआईएस</em>द्वारा <em>ट्रांस</em>-लाइगैंडों और उसके निषेध के साथ <em>Drosophila</em> पायदान के बंधन का मूल्यांकन करने के लिए-लाइगैंडों
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Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).More

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

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