Summary
Volume is een belangrijke parameter over fysiologische en pathologische eigenschappen van cellen. Beschrijven we een fluorescerende uitsluiting methode waardoor volledige-veld meting van in vitro neuronale volume met sub Micrometrische axiale resolutie die nodig zijn voor de analyse van neurites en dynamische structuren geïmpliceerd in neuronale groei.
Abstract
Volume is een belangrijke parameter over fysiologische en pathologische eigenschappen van neuronen op verschillende tijdschema's. Neuronen zijn vrij uniek cellen met betrekking tot hun uitgebreide vertakte morphologies en dus verschillende methodologische uitdagingen voor volumemeting te verhogen. In het bijzondere geval van de in vitro neuronale groei dient de gekozen methodologie sub Micrometrische axiale resolutie gecombineerd met full-veld Opmerking over tijdschema's van minuten tot uren of dagen. In tegenstelling tot andere methoden zoals cel vorm wederopbouw met behulp van de confocal imaging, elektrisch gebaseerde metingen of Atomic Force microscopie, heeft de onlangs ontwikkelde fluorescentie uitsluiting methode (ITA) het potentieel om te voldoen aan deze uitdagingen. Echter, hoewel ze eenvoudig zijn principieel, uitvoering van een hoge resolutie FXm voor neuronen vereist meerdere aanpassingen en een speciale methodologie. Hier presenteren we een methode gebaseerd op de combinatie van fluorescentie uitsluiting, lage-ruwheid meerdere compartimenten microfluidic apparaten, en tot slot micropatterning om in vitro metingen van lokale neuronale volume. De hoge resolutie geboden door het apparaat konden we voor het meten van het lokale volume van neuronale processen (neurites) en het volume van sommige specifieke structuren die betrokken zijn bij de neuronale groei, zoals groei kegels (GCs).
Introduction
De precieze kennis van cellulaire volume heeft verhoogde aandacht getrokken in het afgelopen jaar, gedreven door de kwestie van de cel grootte homeostase in eencellige micro-organismen 1 , en meer in het algemeen in mitotische cellen 2. De vraag van cel volume is echter relevant ook voor post mitotische cellen, waarvoor neuronen een paradigmatische voorbeeld vormen.
Volume is inderdaad een belangrijke handtekening van fysiologische en pathologische gebeurtenissen op verschillende schalen en tijdstippen in neuronale leven, van voorbijgaande axonale vervorming geassocieerd met elektrische activiteit (milliseconde schaal) 3 tot en met de onomkeerbare neuronale zwelling die zich voordoen tijdens de asymptomatische fase van neurodegeneratieve ziekten (jaren bij de mens) 4. Echter, de grootste volumeverandering gebeurt in een tussentijdse tijdschaal voor dagen of weken (afhankelijk van het beschouwde organisme) tijdens de neuronale groei. De uitgebreide en complexe morfologie van neuronen aanleiding tot veelvouden kwesties, waaronder de regulering van de celgrootte. Axonale lengte en diameter zijn inderdaad strak gereguleerde in vivo, met waarden die specifiek zijn voor elke neuronale type 5,6.
Deze kwesties, complexe aan te pakken in vivo, kunnen ook worden behandeld in een vereenvoudigde manier in vitro. In dat streven, een methode die is gewijd aan de volumemeting snel genoeg groeidynamiek (d.w.z. binnen een tijdschaal van minuten) en compatibel met observatie over uren of dagen te volgen is vereist. Verschillende methoden zijn ontwikkeld in de jaren voor een directe of indirecte toegang tot cellulaire volume in vitro. Cel wederopbouw van confocal beeldvorming is een van hen, maar deze methode houdt labeling en herhaalde blootstelling aan licht terwijl een beperkte axiale resolutie van ongeveer 500 nm 7wordt weergegeven. Merk op dat deze twee laatste nadelen gedeeltelijk worden overwonnen door een meer verfijnd en recente methode met de naam lattice licht vel microscopie 8. Atomic Force microscopie is gebruikte 9 maar deze scanmethode gebruikt is door essentie traag en saai. Bovendien is het fysiek contact dat het vereist met de cel kan interfereren met de meting gezien de extreme zachtheid van neuronen 10. Indirecte methode met behulp van impedantie of resonantie hebben gewerkt voor andere cel typen 11, maar zijn niet voldoende voor uitgebreid zelfklevende cellen zoals neuronen.
Een van de meest veelbelovende methoden is gebaseerd op de maatregel van het uitgesloten volume van cellen in een nauwe kamer gevuld met een fluorescente kleurstof. De fluorescentie uitsluiting methode (ITA) is eenvoudig in het principe, want het vereist geen etikettering, en is geschikt voor optische beeldvorming van de snelle, op lange termijn van cel populaties met een potentieel sub optische axiale resolutie. Meer precies, hangt de resolutie in z af van de intensiteit van de maximale fluorescentie in de cultuur-zaal (dat wil zeggen regio verstoken van cellen) gedeeld door het dynamisch bereik van de camera, hoewel verschillende bronnen van geluidshinder deze uiteindelijke resolutie beperken. Deze methode is zeer krachtig te volgen van de omvang van de migratie Adherente cellen 12 of studeren volumeverandering tijdens de mitose van zoogdiercellen, zoals grondig beschreven in 13. Neuronen vormen echter een methodologische uitdaging voor FXm overwegen hun uitgebreide restanten in sub Micrometrische processen.
Wij presenteren hier een methode die leidt tot de fabricage van soepele FXm kamers tot met hoge precisie het volume en hoogte van neuronale takken en dynamische structuren die betrokken zijn bij de neuronale groei als de groei kegels.
Kamers moeten soortgelijke hoogten dan het object om te meten om te optimaliseren axiale resolutie. Daarom ontwierpen wij verschillende FXm apparaten gekenmerkt door centrale meting kamers van drie verschillende hoogtes. De dunste (3 µm in hoogte) is gewijd aan neurite meting: deze lage hoogte sluit soma, die in de in de omgeving van 15 µm hoge tussenliggende bedwelmingsruimte blijven. Dikkere midden kamers (10 en 12 µm) zijn voldoende hoog te volgen de hele celgroei. Het apparaat bevat ook twee reservoirs, gelegen aan weerszijden van de centrale kamer. Vier injectie gaten (IH) dus ten uitvoer worden gelegd en worden aangewezen als volgt: de inlaat en uitlaat dienen in te voeren van de cellulaire schorsingen in de chip, overwegende dat de twee anderen feed de reservoirs.
We hebben de eerste verzonnen kalibratie coverslips voor hoogte metingen met behulp van fotoresist structuren van de bekende meetkunde. We hebben vervolgens gratis groeiende neuronen, maar ook morfologisch beperkte neuronen beeld in micropatterns van hechting.
Protocol
De studie werd uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de Europese Gemeenschap op de zorg en het gebruik van proefdieren: 86/609/EEG. Het doel van het onderzoek en het protocol worden beschreven in het ethische bijlage van ERCadg project CellO, die is goedgekeurd en wordt regelmatig gecontroleerd door de ERCEA. Institut Curie dier faciliteit heeft ontvangen licentie #C75-05-18, 24/04/2012, rapporteren aan het Comité d'Ethique nl matière d'expérimentation animale Paris Centre et Sud (nationaal registratienummer: #59).
1. fabricage van de schimmel
Opmerking: In de mal staan centraal en tussenliggende kamers verbonden met een inlaat en een stopcontact, plus twee reservoirs (en inhammen) gelegen aan weerszijden van de centrale kamer.
- Gebruik platte pincet te manipuleren van 51 mm doorsnede silicium wafers en overbrengt van de ene plaats naar de andere.
- Centrale kamer silicon schimmel
- Vul een plastic pipet van 2 mL met positieve fotoresist. Plaats de pipet in het midden van een 51-mm diameter silicium wafer en druk op op het reservoir tot die ongeveer 75% van het oppervlak van de wafer met de fotoresist. Spin-jas bij 3000 t/min voor 30 s.
- Het zegel van de spin-coater overbrengen naar een kookplaat, met een oppervlaktetemperatuur van 100 ° C, voor 50 s.
- Het zegel van de kookplaat overbrengen aan de substraat-houder (chuck) van het masker aligner. Bloot door middel van de "DRIE mask" (Zie aanvullende bestanden "masks_neuron_volume_chips.tiff" en "masks_neuron_volume_chips.dxf").
- Verwijder het zegel van de chuck en het duiken in een 100 mL glas kristalliseren schotel met de developer (verdunning 1:4 in gedeïoniseerd water). Laat de wafer en handhaven voor 1 min terwijl het voortdurend en zachtjes roeren de crystallizing schotel.
Opmerking: Als u wilt opslaan van reagentia, vullen de crystallizing schotel tot 1 cm in hoogte op maximum. - Het terugnemen van het zegel van de ontwikkelaar en het onderdompelen in een 100 mL crystallizing schotel gevuld met gedeïoniseerd water voor ongeveer 10 s.Then plaats het zegel op een absorberend papier en droog het met hydrofoor stikstof met behulp van een lucht-Blaaspistool.
- Plaats de wafer voor 50 s op een kookplaat met een oppervlaktetemperatuur van 115 ° C.
- Uitvoeren van deep Reactive Ion Etching (DRIE) met de volgende parameters (meer informatie over de DRIE techniek kan worden gevonden in verwijzingen 14 en 15); Passiveren stap: 50 sccm van C4F8, hij back-flow 10 sccm, CP 10 W, inductief gekoppeld Plasma (ICP) 1500 W, totale druk 24 mbar, temperatuur: 18 ° C; Etsen stap: 100 sccm van SF6, hij back-flow 10 sccm, CP 11 W, ICP 1500 W, totale druk 24 mbar, temperatuur: 18 ° C; Passiveren tijd: 4 s; Etsen van tijd: 7 s; Totale duur van het proces: meestal 5 min. voor ongeveer 10 µm geëtst diepte.
- Los de fotoresist door duiken het substraat in een crystallizing schotel gevuld met aceton.
- De wafer in een piranha-oplossing dompelen (2/3 H2O2 (30%) en 1/3 H2SO4 (95 %)) voor 5 min.
Let op: H2O2 altijd eerst toevoegen en vervolgens H2zo4 en spoel ten minste 3 keer gede¨ uoniseerd water na het schoonmaken.
- De mallen overeenkomt met tussenliggende kamers door het uitvoeren van de stappen 1.2.1 aan 1.2.11 na de parameters die worden vermeld in de tabellen 1-3te fabriceren.
Opmerking: Elke tabel correspondeert met een bepaald apparaat, gekenmerkt door een bepaalde hoogte van de centrale observatie-kamer.
Opmerking: Voer het hele proces met behulp van toenemende photoresists heights (maskers 1 tot en met 3 voor elk apparaat, Zie aanvullende bestanden "masks_neuron_volume_chips.tiff" en "masks_neuron_volume_chips.dxf").- Plaats de geëtste silicium wafer op de spin-coater substraat houder.
- Controleer dat de spin-coater correct werkt door te verifiëren dat het streven van het substraat effectief is (het substraat moet draaien en blijven op hun plaats tijdens het nominale toerental).
- De viscositeit van SU-8 toeneemt met de hoogte van de gerichte dikte bereik. Altijd gebruik 20-30 mL flessen voor het opslaan van SU-8 photoresists en giet het over de wafer voordat spin-coating (SU-8 zou worden gemanipuleerd met een plastic pipet al te visceus zijn).
- Negatieve epoxy-type fotoresist SU-8 in het midden van het substraat tot die ongeveer 75% van de silicium wafer giet, dan draai-jas met behulp van de parameters vermeld in de rij "Spincoating" van de tabellen.
- Plaats het gecoate zegel op een kookplaat voor de duur en de temperatuur aangegeven in rij "zachte bak".
- Monteer de geëtste wafer en de voldoende "SU-8 Mask" op het masker aligner.
- De geëtste wafer uitlijnen met het masker met behulp van de speciale uitlijning kruisen (typische grootte van deze kruizen: 50 µm × 150 µm) ontworpen op elk masker.
Opmerking: Twee kruisen aan elke kant van het apparaat zijn voldoende (linksonder) en een rechts bovenaan. - Bloot met behulp van de I-lijn van het masker aligner (golflengte 365 nm) met de juiste dosis UV, zoals aangegeven in rij "Blootstelling energie".
Opmerking: De belichtingstijd is berekend door de specifieke energie E blootstelling voor elke fotoresist door het effectiefvermogen van de UV-lamp, gemoduleerd door de absorptie van het masker:
x (1 - absorptiemasker). Absorptie is ongeveer 20% voor flexibele maskers en te verwaarlozen voor chroom harde masker. - Plaats het gecoate zegel op een kookplaat voor de duur en de temperatuur aangegeven in rij "Post bak".
- Bereidt twee 100 mL glas-kristalliseren gerechten, een met de developer, de andere lege. Duik de wafer in de ontwikkelaar voor de duur aangegeven in rij "Ontwikkeling". Agitate zachtjes de crystallizing schotel langs ontwikkeling
- Bestrooi de wafer met isopropanol boven de lege crystallizing schotel voor ongeveer 5 s. Tot slot, plaats het zegel op een absorberend papier en droog het met hydrofoor stikstof met behulp van een lucht-Blaaspistool.
- Plaats het gecoate zegel op een kookplaat voor de duur en de temperatuur in rij "harde bak aangegeven" (optioneel).
Opmerking: Deze stap is handig bij het voorkomen van scheuren in de fotoresist en zorgen voor een homogene vlakke ondergrond voor de volgende stappen. - Herhaal stap 1.3.1 - 1.3.10 te voltooien van de processen die zijn vermeld in tabel 1-3.
- Na de laatste stap van fotolithografie, schimmel silanize het definitieve model bestaande uit 3 lagen van negatieve photoresists door het sturen van twee 100 µL druppels Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl) silane aan elke kant van de meester in een petrischaal 100 mm. Verzegel de Petri-schijf met een kunststof paraffine film en incubeer 20 min bij kamertemperatuur (RT).
Opmerking: De meester mal is klaar en kan meerdere malen worden gebruikt.
- Plaats de geëtste silicium wafer op de spin-coater substraat houder.
x (1 - absorptiemasker). Absorptie is ongeveer 20% voor flexibele maskers en te verwaarlozen voor chroom harde masker.2. fabricage van PDMS chip
- Giet van 90 g van silicium gebaseerde biologische polymeer (Polydimethylsiloxaan: PDMS) in een 100 mL plastic beker. Voeg 10 g haar genezen agent (1:10 in gewicht). Roer het mengsel met behulp van een plastic pipet voor 2-3 min.
Opmerking: Meng 90 g PDMS met 10 g agent voor de fabrikatie van 6 fiches om te genezen. - Plaats het mengsel in een vacuüm exsiccator en pomp voor ongeveer 30 min te verwijderen van luchtbellen in de PDMS gevangen.
- Plaats de meester mal in een petrischaal P100 en giet 15 mL van het mengsel op de mal met een injectiespuit.
Opmerking: 15 mL leidt tot een chip van de totale hoogte van 1,5 mm. - Plaats de PDMS-schimmel structuur binnen een vacuüm exsiccator en pomp zolang er geen meer lucht bubbels barsten aan de oppervlakte van het PDMS niet zijn.
Opmerking: Deze stap duurt ongeveer 30 min. - Duw het zegel aan de onderkant van de petrischaal met behulp van een kegel tip om te voorkomen dat dode PDMS volume onder het zegel. Plaats het PDMS-mal-apparaat in de oven, ingesteld bij 70 ° C gedurende ten minste 2 uur.
- Demold het PDMS blok onder een chemische motorkap met behulp van een platte spatel roestvrij staal en gieten isopropanol op de chip. Plaats het op de Bank roestvast staal van de kap.
- Knip rond het silicium zegel en demold van de replica van de PDMS met behulp van een scalpel.
- Gesneden rond (laat een 2-mm marge) de chip met behulp van een scalpel of een scheermesje.
- Punch inhammen door stevig op de 1.5 mm diameter perforatie te drukken en actuate om te knippen en snijden van het gat van de inlaat. Doe hetzelfde op de vier specifieke zones van de chip waar vloeistof zullen worden ingespoten.
- Reinig de chip door steken en peeling plakband aan de microstructured kant. Bestrooi isopropanol en aan beide zijden. Droog dan de chip met hydrofoor stikstof met behulp van een lucht-Blaaspistool.
3. fabricage van patroon coverslips (24 × 24 mm2)
Opmerking: Manipuleren coverslips met gebogen pincet.
- Poly-ornithine (PLO) patronen
- Een O2 reiniging plasma op glas coverslips hebt toegepast. Plasma parameters: pompen naar beneden druk: 0,25 mbar; O2 levering duur: 3 min; gas flow: 10 sccm; maximale afwijking: ±5 sccm; Plasma-duur: 3 min; instellen van de druk: 0,36 mbar; maximale afwijking: ±0.10 mbar; Stel macht: 50 W; maximale afwijking: 5%; ontluchting duur: 45 s.
- Mix-484 µL van azijnzuur en 56 µL van 3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane, compleet met absolute ethanol om een totaal volume van 15 mL.
- Een daling van 500 µL van deze oplossing met behulp van een kegel van 1 mL tip, zet op elke dekglaasje aan, wachten voor 2-3 min. drogen met behulp van een cleanroom microfiber wisser.
Opmerking: Gesilaneerde glas coverslips kan worden opgeslagen tot 1 maand bij kamertemperatuur binnen plastic dozen afgedicht met een kunststof paraffine-film. - Plaats elke dekglaasje aan op een spin-coater gelegen in de omgeving van een schone kamer. Zet een daling van een positieve fotoresist die ongeveer 75% van de dekglaasje aan (ongeveer 500 µL) en spin-jas bij 4000 t/min voor 30 s tot het bereiken van een definitieve dikte 0,45 µm.
- Plaats de coverslips voor 1 min op een kookplaat met een oppervlaktetemperatuur van 115 ° C.
- Met behulp van een masker aligner, bloot elke dekglaasje aan bij een golflengte van 435 nm (G-lijn) door het speciale masker volgens de fabricant parameters (UV dosis over 50-60 mJ.cm--1)
- Bereiden van 2 glazen kristalliseren gerechten, een met de developer (geen verwatering), de andere met gedeïoniseerd water.
- Duiken één voor één elke dekglaasje aan in de ontwikkelaar voor 1 min terwijl het voortdurend en zachtjes roeren de crystallizing schotel. Vervolgens onderdompelen van de wafer in gedeïoniseerd water voor ongeveer 5 s. plaats het zegel op een absorberend papier en droog het met hydrofoor stikstof met behulp van een lucht-Blaaspistool.
- Een activering O2 plasma met dezelfde parameters zoals in 3.1.1 van toepassing.
- Onder de motorkap, onttronen vier 170 µL druppels van de oplossing van een 100 µg/mL PLO per P100 petrischaal. Zet het patroon gezicht van de coverslips op elk van deze dalingen. Het zegel van de petrischaal met een kunststof paraffine film om te voorkomen dat het drogen. Na een nacht bebroeden bij RT.
Opmerking: De PLO oplossing moet blijven vasthouden aan de coverslips door capillariteit. - Voorbereiden van vier ontvangers (meestal P60 petrischalen), drie van hen met PBS en de vierde een met gedeïoniseerd water vullen. Bereidt gerechten, twee kristalliseren glas pure ethanol.
- Nemen elke dekglaasje aan van de petrischaaltjes dompelen het in het eerste bad van de PBS voor 10-15 s, evacueren van de vloeistof op een absorberende weefsel door het dekglaasje aan verticaal op de kant te zetten, het invoegen met bijvoorbeeld het patroon gezicht-omhoog in het bad van ethanol.
Opmerking: Zodra de ontbinding van de fotoresist is voltooid, wordt het moeilijk te vinden de patroon kant van het dekglaasje aan. Daarom is het belangrijk in dit stadium op te sporen van de locatie. - Plaats de schotel in een ultrasoonbad ultrasoonapparaat kristalliseren ethanol (120 W / 35 kHz) en laat de fotoresist worden ontbonden gedurende 3 minuten.
Opmerking: Wijzigen de ethanol Bad elke 4 coverslips te beperken door de PBS die afbreuk kan doen aan de ontbinding van de fotoresist verdunning. - Neem uit het dekglaasje aan uit het bad ethanol, dan duik het meerdere malen in het tweede PBS-bad. Controleer de oppervlakte aspect herhaaldelijk tot de vettige-achtig oppervlak dat resultaten uit de overige vloeibare film van ethanol verdwijnt.
- Dompelen voor 5-10 s het dekglaasje aan in het derde PBS-bad. Vervolgens onmiddellijk overbrengen naar de gedeïoniseerd waterbad. Plaats het dekglaasje aan op een absorberend papier en droog het met hydrofoor stikstof met behulp van een lucht-Blaaspistool.
Opmerking: De laatste spoelen in gedeïoniseerd water wordt gebruikt om te voorkomen dat de vorming van PBS kristallen tijdens het drogen stap.
- Fotoresist structuren voor hoogte kalibreren
- Stappen alleen 3.1.4. naar 3.1.8. met behulp van het speciale masker (masker "Fotoresist stripes", Zie aanvullende bestand "Mask_Photoresist-stripes.dxf").
4. chip montage en definitieve uitvoering
- Chip montage op glazen bodem gerechten
- Zowel de PDMS-chip en de glazen schotel waarop het zal worden gebonden gestoken door de kamer van de plasma voor oppervlakte activering. Parameters: pompen naar beneden druk: 0,25 mbar; O2 levering duur: 3 min; gas flow: 10 sccm; maximale afwijking: ±5 sccm; Plasma-duur: 30 s; instellen van de druk: 0,40 mbar; maximale afwijking: ±0.10 mbar; Stel macht: 50 W; maximale afwijking: 5%; ontluchting duur: 45 s.
- Voorzichtig zetten de geactiveerde chip van het PDMS in contact met het dekglaasje glas aan en tactvol druk uitoefenen op de randen van de chip obligatie van de chip om het dekglaasje aan. Het vergroten van de kracht van hechting, plaats het apparaat in de oven op 70 ° C gedurende 5 tot 10 minuten.
Opmerking: Druk niet op op delen met pilaren, ze zou bezwijken onder te veel druk. - Onder de motorkap (d.w.z. op RT) en binnen 30 min na binding, plaats een 10-µL tip kegel gevuld met een oplossing van 100 µg/mL PLO bij de IHs en vervolgens injecteren van de vloeistof. Stel het volume om een druppel aan de bovenkant van elke IHs. Voeg vervolgens, met behulp van een 1-mL tip kegel, PBS in de petrischaal rondom de chip.
- Laat de chip op RT met een minimum van 2 h incubatietijd. Voor overnachting incubatie, verzegelen de petrischaal met behulp van een plastic paraffine film om te voorkomen dat het drogen.
Opmerking: De vloeistof mag niet lekken buiten de chip anders die de chip moet worden verwijderd. - Druk op een 10-µL tip kegel licht in elke IH en opzuigen van de overmaat vloeistof. Vervolgens volledig de kegel uiteinde in het stopcontact steken en stelt de resterende vloeistof.
- PLO te vervangen door de volgende laminin de aanwijzingen in stap 4.1.5 (leegmaken) en 4.1.3 (vulling). Incubeer bij RT gedurende 1 h.
- Vervang laminin door cultuurmedium de aanwijzingen in stap 4.1.5 (leegmaken) en 4.1.3 (vulling). Samenstelling van het kweekmedium: MEM 81,8%; Natrium pyruvaat 100 mM 1%; Glutamax 200 mM 1%; Paard Serum 5%; B27 aanvulling op 2%, N2 supplement 1%, gentamicine 0,2%; Filtreer de oplossing met behulp van een 220-nm-filter. Met behulp van een 1-mL tip kegel, vervangt ook de PBS rond de chip door dit medium.
- Zet de chip in de broedstoof geregeld bij 37 ° C en 5% CO2 voor ten minste 5 h (of 's nachts) vóór neuron zaaien.
- Chip monteren met behulp van het patroon van coverslips
Opmerking: Als het patroon coverslips positieve fotoresist reference-objecten bevatten, stappen 4.2.1 aan 4.2.9. Anders voeren alleen stap 4.2.3, stok het PDMS-apparaat op de PLO patroon dekglaasje aan zoals aangegeven in punt 4.1.2, zetten kweekmedium binnen en rond de chip gaat u naar stap 4.2.10.- Een druppel water op een rechthoekige dikke glazen microscoopglaasje storten en plak het dekglaasje aan op het glasplaatje door capillariteit (niet-patroon zijde naar het glasplaatje). Onder een Microscoop, de locatie van de fotoresist strepen aan de achterzijde van het glasplaatje met een viltstift markeren.
- Plaats de patroon glas dekglaasje aan op de houder van het masker van het masker aligner. Afhankelijk van het merk gemaakt met de viltstift naar het midden van de fotoresist reference-objecten.
- De plasma-stap uitvoeren zoals beschreven in 4.1.1 op de PDMS-chip.
- Plaats de PDMS chip op de mobiel substraat houder (chuck) van het masker aligner.
Opmerking: Het vergroten van optische contrast, plaats een silicium wafer onder de PDMS-chip. Het silicium wafer moet stevig bevestigd op de chuck blijven tijdens het uitlijning proces (gebruik een transparante tape om het vasthouden aan de chuck). - Til de chuck op de grens van mechanisch contact wilt uitlijnen van een chip met de array van fotoresist strepen gelegen op het dekglaasje aan.
- Mechanisch contact tussen de chip en het dekglaasje aan bereiken door afwerking tot opheffing van de chuck totdat het oppervlak van het PDMS pijlers aanraking het glas dekglaasje aan.
- Verlaag de chuck. Verwijder het dekglaasje aan nu gebonden aan de chip van de houder van het masker. Dan plaats het apparaat in een petrischaal 35-mm, en breng alles in de oven (temperatuur: 70 ° C) gedurende 5 tot 10 minuten om de hechting sterkte te verhogen.
- Uitvoeren zoals in stap 4.1.3.
Opmerking: als met behulp van de PLO coverslips patronen, ga rechtstreeks vanuit stap 4.2.7 aan stap 4.2.9. - PLO vervangen door de beplating middellange volgens die de procedures in stappen beschreven 4.1.5 (leegmaken) en 4.1.3 (vulling). Met behulp van een 1-mL tip kegel, vervangt ook de PBS rond de chip door dit medium.
- Zet de chip in de broedstoof geregeld bij 37 ° C en 5% CO2 tot neuron zaaien, met een minimum van 5 h incubatietijd.
5. neuron cultuur
- 100 mL dissectie voedingsbodem (HH medium) voor te bereiden door het mengen van 10 mL HBSS 10 x, 2 mL Hepes 1 M en 88 mL steriel water in een kunststof kolf van 200 mL.
Opmerking: Het HH medium kan bereid worden de dag voor de cultuur. - Ontleden hippocampus uit E18 muizen embryo geëxtraheerd uit een moeder euthanized door cervicale dislocatie (C57BL/6J muizen van Charles Rivers). Stappen van dissectie zijn bijvoorbeeld gedetailleerde in 16.
- Hippocampus in een plastic buis met trypsine (0.3 mL trypsine 2,5%, w/o EDTA in 2,7 mL van HH medium) gedurende 10 minuten bij 37 ° C om te starten van chemische dissociatie plaatsen.
- Bijna alle van de vloeistof te negeren en te vervangen door 5 tot 10 mL met behulp van wegwerp plastic pipetten HH. Doe het 3 keer. Gebruik voor de laatste opvulling, 1 mL medium in plaats van HH plating.
- Mechanisch distantiëren weefsels met behulp van een 1 mL tip-kegel door aspirant en het uitwerpen van het volledige volume meerdere malen, het vermijden van bubbels te maken en het gebruik van niet meer dan 15-20 passages.
- Bereiden in een aparte 500 µL-ontvanger, een oplossing met 5 µL celsuspensie verdund in 45 µL van PBS. Neem 1 µL van deze oplossing met behulp van een precisiepipet µL 10 en de verdunde schorsing in een Malassez cel teller invoegen. Gebruik de vermeldingen bepaald in 17 te schatten van het aantal cellen.
Opmerking: Een enkele hippocampus biedt meestal ongeveer 0,5 miljoen van neuronen. - Centrifugeer bij 100 x g gedurende 6 min op RT.
- Verwijder het supernatant en vervang deze door de hoeveelheid plating medium vereist om een concentratie van 10 miljoen cellen/mL. Resuspendeer cellen door achtereenvolgens streven en uitwerpen van de celsuspensie met een 1-mL tip kegel.
- Opstellen van het aanwezig zijn in de chip plating-medium (zie stap 4.1.5). Verzamelen van 2-3 µL van de vers geresuspendeerde oplossing met behulp van een precisiepipet 10-µL en het injecteren bij de inlaat (verwijzen naar de injectie-procedure die wordt beschreven in stap 4.1.3). Herhaal onmiddellijk dezelfde bewerking bij de uitlaat.
- Injecteren over hetzelfde volume van plating medium in elke reservoir (zie stap 4.1.3).
Opmerking: Observeren snel de chip onder de Microscoop om na te gaan van de dichtheid van de cellen. De orde van grootte van de optimale celdichtheid komt overeen met ongeveer 5-10 cellen binnen de vierkante oppervlakte begrensd door 4 pijlers (ongeveer 0.3 mm2, dat wil zeggen over 15-20 cellen per mm2). - Uiteindelijk Herhaalstap 5.10 gebruiken van 0,5-1 µL celsuspensie te bereiken de gerichte celdichtheid.
- Plaats de geplaatste chip in een broedstoof geregeld bij 37 ° C 5% CO2.
6. fluorescentie uitsluiting observatie
- Vervanging van kweekmedium door het imaging medium.
- Bereiden het imaging medium zoals 4.1.7 maar gebruik in plaats daarvan MEM verstoken van fenol rood en fluorescerende dextran toevoegen. In dat doel, Verdun dextran (moleculair gewicht 10.000 g/mol, stamoplossing geconcentreerd op 10 mg/mL in PBS) met het oog op een eindconcentratie van 0,5-1 mg/mL in het imaging medium.
Opmerking: Gebruik Dextran conjugaten met absorptie/emissie-maxima 496/524 of 650/668. Liever de eerste om het imago van 0,45 µm hoge positieve fotoresist structuren (om zich te ontdoen van hun auto fluorescentie in de rode bandbreedte) en de tweede afbeelding neuronen (minder giftig). - Alle inhammen met behulp van een precisiepipet 10-µL leeg en vul ze opnieuw volledig met het imaging medium (zie stap 4.1.3 en 4.1.5 voor de precieze methodologie van middellange vervanging).
- Bereiden het imaging medium zoals 4.1.7 maar gebruik in plaats daarvan MEM verstoken van fenol rood en fluorescerende dextran toevoegen. In dat doel, Verdun dextran (moleculair gewicht 10.000 g/mol, stamoplossing geconcentreerd op 10 mg/mL in PBS) met het oog op een eindconcentratie van 0,5-1 mg/mL in het imaging medium.
- Imaging
- Plaats de chip onder een Microscoop van de epifluorescence uitgerust met een milieu kamer geregeld bij 37 ° C en 5% van de CO-2. Gebruik een 40 X, numerieke diafragma (nvt) 0.8 droog objectieve, 30% van de volle kracht (volledige vermogen: 3 W) en 30 ms blootstelling tijd. Verwerven van beelden van cellen in het focus (van eenpersoons tot meerdere opeenvolgende beelden in geval van time-lapse experimenten).
- Beeldanalyse
- Normaliseren van beelden met behulp van de achtergrond reductie routine uitgevoerd in speciale software om een homogene achtergrond. Zie 13 voor de details van de stappen in deze software voor beeldverwerking. De output afbeelding heeft een. MAT formaat.
- Converteren. MAT bestand in. TIFF-8 bits afbeeldingen met behulp van de routine zet in aanvullend materiaal (conversion_mattotiff.m, waarin wordt gepleit voor importfilevol.m).
- Uitvoeren van Import > Afbeeldingsvolgorde op ImageJ om te bouwen van een video van de. TIFF-afbeeldingen.
- Berekenen van de gemiddelde intensiteit P van een vierkante ruimte gelokaliseerd in het midden van een pijler (reference-object) en de gemiddelde intensiteit B van een vierkante ruimte van de kamer verstoken van cellen (achtergrond, dat wil zeggen nul hoogte). Zie 18 voor een voorbeeld van gedetailleerde methodologie voor beeldverwerking.
Opmerking: De laterale dimensie van de vierkante gebieden gebruikt als intensiteit verwijzingen moeten ongeveer de helft van de diameter van de pijler om een voldoende aantal pixels terwijl het vermijden van lichtvervuiling van de randen van de pijler. - Gebruik de P- en B-waarden vast te stellen van de wet van de lineaire conversie van intensiteit ik tot hoogte h:
met hc de bekende hoogte van de kamer,
en
Opmerking: PDMS weergegeven geen detecteerbare autofluorescence. - Selecteer een gebied rond de zone van belang, integreren met behulp van ImageJ intensiteit (Zie 19 voor meer details) en de conversie recht verkregen in 6.3.5 voor het meten van de omvang van een compartiment cel toepassen.
Opmerking: De zone van belang zou kunnen worden geselecteerd op basis van de fluorescentie van sub cellulaire elementen zoals actine, bijvoorbeeldvoor de selectie van groei kegels in GFP-LifeAct neuronen, selecteer de zone van belang in het GFP emissie kanaal, behalve de omtrek van dit zone met behulp van een hulpmiddel van de manager van de ROI, dan de maatregel die het volume van de cel ingesloten binnen dezelfde zone in het kanaal van de emissie van dextran (in rood).
en
Representative Results
Het resultaat van het proces van fabricage beschreven in de punten 1 en 2 wordt geïllustreerd door de beelden van figuur 1A-1B en de curve van Figuur 1 c. De tabel van Figuur 1 d bevat de ruwheid waarden van twee verschillende representatieve gebieden van de PDMS-chip, dat wil zeggen in het midden en de 20 µm hoge volgende tussenliggende kamer. Een afname van de ruwheid met een factor van ongeveer 7 is verkregen met behulp van geëtste Si wafer in plaats van SU-8 fotoresist. Vervolgens, FXm werd eerst toegepast op een fotoresist streep van bekende meetkunde (figuur 2A) binnen een hoge kamer van 10 µm. Na de beeldverwerking en intensiteit naar hoogte conversie (Zie de grafiek van figuur 2B), FXm profielen uitgevoerd op dwarsdoorsneden langs deze streep (figuur 2C) bieden de gewenste hoogte profielen (figuur 2D). Figuur 2D geeft een vergelijking tussen profielen met behulp van mechanische profilometry en FXm methoden verkregen. Deze profielen, met inbegrip van rand en plateau waarde, zijn zeer vergelijkbaar, het valideren van de methode. De verstrooiing van FXm gegevens is niet representatief zijn voor de uiteindelijke resolutie van de methode, zoals nader beoordeeld in Figuur 3 en 4 van de figuur, maar resultaten uit de lage intensiteit gebruikt om te voorkomen dat een mogelijk effect van de zeer zwak auto-fluorescentie van de fotoresist in het GFP-kanaal.
Vervolgens zien we neurites in 3 µm en hoge kamers van 10 µm (Figuur 3). De standaarddeviatie van de achtergrondgeluiden is ongeveer 18 nm na intensiteit hoogte conversie en achtergrond correctie. Deze waarde is iets hoger dan de fysieke ruwheid van PDMS oppervlakken gegoten op silicium oppervlakken (12 nm, zie de tabel met Figuur 1 d) maar veel lager dan de ruwheid gemeten op PDMS van SU-8 mallen verkregen. Deze resultaten wijzen op de toegevoegde waarde van boren van waterputten in silicium wafers in plaats van het openen van gaten in de SU-8 fotoresist te werpen pijlers. Dergelijke lage waarde kan een hoog signaal / ruisverhouding en zeer heldere beelden in volume zoals weergegeven in figuur 3A. Als een voorbeeld van de gegevens die uit dergelijke beelden kunnen worden opgehaald, berekend we de hoeveelheid 1.6 µm (d.w.z. 10 pixels) breed neurite slice (Zie de grafiek van figuur 3B). In een eerste benadering met behulp van een lineaire vlaag van deze gegevens geeft een hoogtewaarde gemiddelde neurite van ongeveer 400 nm, moet worden vergeleken met bijvoorbeeld de 500 nm axonale diameter in 10 dagen oude pups binnen het corpus callosum 5 gevonden. Wij ook FXm gecombineerd met micropatterns wrijvingscoëfficiënt bestaande uit serieel abutted 2 µm en 6 µm brede strepen van 30 µm in lengte. Ons doel was het bestuderen van de invloed van de breedte van de neurite op de 3D-vorm. Figuur 3 c toont een 3D-weergave in valse kleuren van een afbeelding van de hele neuron verkregen in een hoge kamer van 10 µm. Neurites zaaien 2 µm en 6 µm brede strepen, overwegende dat het soma zich op het uiteinde van de grootste streep bevindt. Hoogte profielen opgesteld in drie verschillende doorsneden. In samenhang met de grafiek weergegeven in figuur 3A, het oppervlak geïntegreerd over de verhoging van de dwarsdoorsneden met de breedte van de neurite (figuur 3D).
We ook gericht op groei kegel (GC) 3D-structuren. Figuur 4 A-B toont twee verschillende GC profielen verkregen in een 3 µm hoge kamer, die wijzen op hun vertakte sub structuur. Daarnaast hebben we uitgevoerd time-lapse experimenten te volgen de dynamiek van het volume van GCs in een 12 µm hoge kamer. Figuur 4C geeft een cyclus van krimpen en reactivering van een bepaalde GC binnen een tijdsbestek van enkele tientallen minuten. Dankzij het gebruik van GFP-lifeact muizen, groei kegels waren gelokaliseerd in de golflengte van de emissie GFP (510 nm) van hun hoge actine-concentratie. Het oppervlak bij de golflengte geïdentificeerd werd gebruikt om te integreren over de dextran emissie golflengte op 647 nm voor het berekenen van de omvang van de GC. Figuur 4 d bevat ten slotte de verdeling van de omvang van de GC op verschillende tijdstippen en de locatie op drie verschillende neuronen, gecentreerd op een waarde van ongeveer 6 µm3.
Figuur 1: FXm PDMS chambers. (A) de regelingen voor de vier verschillende hoofdstappen van microfabrication leiden tot de definitieve mal. De locatie van de inlaat, de uitlaat en de stuwmeren worden aangegeven. Schaal bars: 1 mm. (B) beeld van de kamer van de PDMS FXm verkregen met behulp van een optische profilometer. Dit beeld toont de centrale kamer met 3 rijen van 10 µm hoge pilaren en de tussenliggende kamers van 20, 50 en 90 µm in hoogte. Schaal bar: 500 µm. (C) transversale weergave van de chip langs de twee stippellijnen getekend in (B). Geel/goud: dwarsdoorsnede langs pijlers, blauw: doorsnede tussen pijlers. (D) betekenen de waarden van de ruwheid van het PDMS gemeten op 50 × 50 µm2 gebieden gegoten op silicium en op de 20 µm hoge SU-8 tussenliggende kamer (Zie pijlen voor de locatie van deze gebieden). Gemiddelde waarden werden verkregen van de metingen van drie verschillende gebieden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: kalibratie van FXm methode met behulp van een fotoresist streep als het object belangenverstrengeling. (A) GFP-fluorescentie foto genomen in een hoge kamer van 10 µm gevuld met 10.000 MW dextran absorberende op 488 nm bij 1 mg/mL. (B: achtergrond, P: pijler). Observatie met een droge 40 X NA 0.8 doelstelling. Schaal bar: 50 µm. (B) lineaire kalibratie recht verkregen van de gemiddelde intensiteit van de twee gekleurde rechthoeken weergegeven in A. (C) fluorescentie intensiteit profiel verkregen op het niveau van de blauwe, onderbroken lijn weergegeven in (A), overschrijding van de fotoresist streep (0,45 µm hoge positieve fotoresist). (D) de vergelijking van de profielen verkregen mechanische profilometer (zwarte stippen) en FXm na intensiteit naar hoogte conversie van de gegevens van (B) (blauwe stippen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Neurite volume imaging. (A) Neurite zich uitstrekt in de centrale 3 µm hoge kamer van soma bevindt zich in de volgende 15 µm tussenliggende zaal. Imaging uitgevoerd met behulp van 10.000 MW dextran absorberende op 488 nm en een 40 X, NA 0,8 droog doelstelling. Verzonken vlak van de verkregen na het gebruik van de achtergrond reductie routine hoogtepunten, de twee neurites en gekozen uitzetten in de grafiek aan de rechterkant. Schaal bars: 30 µm. (B) Neurite segment volume als een functie van de breedte van de neurite verkregen uit de 22 profielen (gemiddeld op 10 pixels, dat wil zeggen op een 1.6 µm "neurite slice") weergegeven in (A). De ononderbroken lijn vertegenwoordigt een lineaire vlaag van helling 0.4 µm passeren door de oorsprong. (C) valse kleurenafbeelding van een patroon neuron op een zelfklevende stripe gemaakt van opeenvolgende 2 µm en 6 µm breed stompen (vertegenwoordigd in wit). Metingen zijn verricht in een 10 µm hoge kamer gevuld met 10.000 MW dextran absorberende op 647 nm en het gebruik van een 40 x NA 0.8 droog doelstelling. (D) hoogte profielen overeenkomt met de gekleurde streepjeslijnen weergegeven in (C), houden het zelfde kleur code. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: statische en dynamische groei kegel imaging. (A-B) Groei Kegel hoogte profielen verkregen in een 3 µm hoge kamer na intensiteit naar hoogte conversie langs de gele lijnen in gekoppelde afbeeldingen weergegeven. Observatie uitgevoerd met behulp van een opvulling met 10.000 MW dextran absorberende op 488 nm en een 40 X, NA 0,8 droog doelstelling. (C) hele neuron imaging in een 12 µm hoge kamer gevuld met 10.000 MW dextran absorberende op 647 nm. Waarnemingen zijn gedaan in twee fluorescerende kanalen: GFP voor groei kegel lokalisatie (gele stippellijnen) en CY5 voor het berekenen van de omvang van de GC van fluorescentie uitsluiting. Het oppervlak opgenomen door gele stippellijnen werd gebruikt voor het berekenen van de omvang van de GC. De grafiek toont de variatie van GC volume over tijd, en de bijbehorende morphologies in zowel GFP en CY5 kanalen op twee verschillende tijdstippen vertegenwoordiger. Alle gegevens zijn verkregen met behulp van een 40 x NA 0.8 droog doelstelling iedere 3 min. schaal bars: 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Stap | 1:8 µm laag maskeren | Masker 2:30 µm laag | Masker 3:40 µm laag |
| SU-8 type | 2007 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 2000 toeren per minuut | 30 s @ 3050 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Zachte bak | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C |
| Blootstelling energie | 110 mJ/cm2 | 155 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Post-exposure bak | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C |
| Ontwikkeling | 2 min 30 s | 5 min | 6 min |
| Harde bak (optioneel) | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C |
Tabel 1: fotolithografie stappen uitgevoerd om te bouwen van een apparaat met een centrale kamer van 12 μm in hoogte. Hoogten van de tussenliggende kamers: 20, 50 en 90 µm.
| Stap | Maskeren van 1:10 µm laag | Masker 2:30 µm laag | Masker 3:40 µm laag |
| SU-8 type | 2007 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 1500 rpm | 30 s @ 3050 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Zachte bak | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C |
| Blootstelling energie | 125 mJ/cm2 | 155 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Post-exposure bak | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C |
| Ontwikkeling | 2 min 30 s | 5 min | 6 min |
| Harde bak (optioneel) | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C |
Tabel 2: fotolithografie stappen uitgevoerd om te bouwen van een apparaat met een centrale kamer van 10 μm in hoogte. Hoogten van de tussenliggende kamers: 20, 50 en 90 µm.
| Stap | Maskeren van 1:12 µm laag | Masker 2:32 µm laag | Masker 3:40 µm laag |
| SU-8 type | 2015 | 2025 | 2050 |
| Spincoating | 30 s @ 3250 rpm | 30 s @ 2500 rpm | 30 s @ 3250 rpm |
| Zachte bak | 3 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C | 3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C |
| Belichtingstijd | 140 mJ/cm2 | 157 mJ/cm2 | 170 mJ/cm2 |
| Post-exposure bak | 4 min @ 95 ° C | 1 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C | 2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C |
| Ontwikkeling | 3 min | 5 min | 6 min |
| Harde bak (optioneel) | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C | 3-5 min @ 200 ° C |
Tabel 3: fotolithografie stappen uitgevoerd om te bouwen van een apparaat met een centrale kamer van 3 μm in hoogte. Hoogten van de tussenliggende kamers: 18, 50 en 90 µm.
Aanvullende gegevens 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Schematische weergave van de maskers gebruikt voor het fabriceren van het PDMS apparaat (DRIE masker en maskers 1-3). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende gegevens 2: bestand "masks_neuron_volume_chips.dxf". Elektronische bestanden, waardoor de DRIE masker en maskers 1-3 te fabriceren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende gegevens 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Elektronische bestanden, waardoor het masker gebruikt voor de fotolithografie van fotoresist strepen fabriceren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende gegevens 4: bestand conversion_mattotiff.m Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende gegevens 5: bestand importfilevol.m Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Volume beeldvorming van neuronen vormt een uitdaging voor de FXm techniek als gevolg van de lange en dunne extensies van deze cellen. Dit protocol beschrijft varianten van hetzelfde type van microfluidic apparaat gewijd aan neuron imaging.
Naast de aspecten van microfluidic ontwerp, de keuze van de doelstelling is van fundamenteel belang voor fluorescentie uitsluiting beeldvorming en impliceert een trade-off tussen laterale resolutie en de helderheid van de afbeelding. In 13 is gebleken dat een hoge nb leidt tot een diepte van de focus kleiner is dan de hoogte van de kamer niet schadelijk voor de precisie van de volumemeting van het was als imaging werd uitgevoerd bij focus en een voldoende marge tussen de omtrek van het object van i overblijft nterest en de grenzen van het oppervlak van de integratie. Echter, het gebruik van een kamer veel hoger dan de diepte van de focus schaadt de beeldhelderheid als gevolg van foton diffusie, welke worden de randen van de objecten van belang. De fabricage van een hoge kamer van 3 µm verminderd deze laterale vervaging en mits uitzonderlijk goed gedefinieerde fluorescerende uitsluiting beelden zelfs met behulp van hoge nb (0.8) 40 X doelstellingen te visualiseren van neuronale takken met hoge zijdelingse resolutie.
Chip montage is een cruciale stap, met name in het geval van 3 µm hoge kamers, maar voorzichtig manipulatie zoals beschreven in punt 4.1.2 vermijdt het instorten van het dak. De hoge oppervlakte volumeverhouding geassocieerd met deze dunne kamers kwestie ook de van de stabiliteit van Dextran concentratie na verloop van tijd. Wij hebben gecontroleerd dat de oppervlakte absorptie van de Dextran na één nacht van incubatie verwaarloosbaar was: na het vervangen van Dextran door PBS, was het verschil in intensiteit tussen de pijler en de achtergrond ongeveer 1 per 1000 van het contrast van de eerste intensiteit tussen deze twee regio's in het bijzijn van Dextran. Opmerking dat neuronen op de bodem dekglaasje aan zowel op het PDMS dak houden kunnen. Dit effect verdwijnt wanneer met behulp van patroon coverslips (dat wil zeggen wanneer we niet zelfklevende moleculen in de vergaderzaal van het PDMS broeden doen), als de coating is dan ook strikt gelokaliseerd op de bodem van de kamer.
Afgezien van hun uitdagende morfologie, neuronen zijn eerder geschikt voor FXm wijten aan het feit dat een van de belangrijkste beperking van de methode, d.w.z. dextran endocytose, zeer beperkt is in deze cellen. We kiezen een 10 kDa formulering te onderdrukken in de lange bereik (uren) verschijnselen zichtbaar endocytose.
Kortom, is de conceptuele eenvoud van FXm gecompenseerd door een aantal experimentele problemen die zijn opgelost door het huidige protocol, zoals nanometric PDMS ruwheid en Micrometrische kamer hoogte of achtergrondcorrectie om te corrigeren voor de oneffenheden van het PDMS plafond tussen pijlers. Echter, het gebruik van een nauwe microfluidic kamer te beperken van het fluorescerende medium levert een paar specifieke beperkingen zoals de noodzaak van steun de pijlers, die het effectieve oppervlak beschikbaar voor cel adhesie, of de noodzaak verlaagt om het soma uitsluiten van de centrale kamer te observeren van neuronale extensies met de hoogste helderheid, die de regio's van de cel die toegankelijk zijn voor hoge resolutie observatie beperkt. Een mogelijke evolutie van deze methode zou zijn om zich te ontdoen van deze fysieke opsluiting, worden vervangen door een optische. De nieuwe ontwikkeling van lichte blad microscopie kan gecombineerd worden voordelig met FXm in de toekomst.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
De auteurs willen erkennen ChiLab, materialen en Microsystems laboratorium - Politecnico di Torino - DISAT, in de persoon van Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza en Dr. S L Marasso, voor hun waardevolle hulp bij de procesontwikkeling en fabricage van het apparaat. Wij danken Victor Racine van Quantacell voor discussie en ondersteuning in de beeldverwerking. Wij zijn dankbaar aan Isabelle Grandjean en Manon Chartier uit het dier faciliteit van het Institut Curie voor hun steun voor muizen, en Pablo Vargas en Ana-Maria Lennon (Institut Curie) voor het verstrekken van ons met de LifeAct van GFP-muizen. We zijn dankbaar Olivier Thouvenin uit Institut Langevin en Clotilde Cadart, Larisa Venkova en Matthieu Piel van het Institut Curie - UMR 144, voor hun hulp bij het begrijpen van de fluorescentie uitsluiting methode. Tot slot, wij danken het technologische platform van Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) voor hun steun in microfabrication. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Europese onderzoek Raad Advanced Grant No. 321107 "CellO," PSL Université (SwithNeuroTrails project), ANR Investissement d'Avenir, IPGG Labex en de Equipex.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
| NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
| Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
| Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
| Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
| Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
| PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
| Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
| Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
| Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
| Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
| Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
| Masks | |||
| DRIE | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
| Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
| S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
| Small laboratory equipment | |||
| 1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
| Scalpel or razor blade | |||
| 9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
| Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
| Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
| Substrates | |||
| Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
| 24x24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
| Photoresists and developpers | |||
| AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
| AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
| SU-8 2007 | MicroChem | ||
| SU-8 2025 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
| Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
| MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
| Laboratory consumables | |||
| Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies - ThermoFisher | ||
| P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
| 20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
| Transparent scotch tape | |||
| Square wipes | VWR | 115-2148 | |
| Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
| Chemicals | |||
| (3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
| PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| isopropanol | W292907 | ||
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 - 50 mL | |
| Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
| 3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
| acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
| Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies - ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
| Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies - ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
| Culture medium | |||
| MEM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 21090-022 | |
| Horse Serum | LifeTechnologies - ThermoFisher | 26050088 | |
| B27 | LifeTechnologies - ThermoFisher | 12587-010 | |
| Glutamax 200 mM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies - ThermoFisher | 11360-070 | |
| Gentamicin | LifeTechnologies - ThermoFisher | 15710-049 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| HBSS 10x | LifeTechnologies - ThermoFisher | 14180-046 | |
| Hepes 1M | LifeTechnologies - ThermoFisher | 15630-056 | |
| trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
| Neurobasal | LifeTechnologies - ThermoFisher | 21103-049 | |
| Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies - ThermoFisher | 12348-017 | |
| Softwares | |||
| Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
| ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
| Routine | ImageJ | Supplementary data | |
| Routine | Matlab | Supplementary data |
References
- Jun, S., Taheri-Araghi, S. Cell-size maintenance: universal strategy revealed. Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).
- Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis. J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).
- Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals. Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).
- Iacono, D., et al. Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).
- Cheli, V. T., et al. Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice. J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).
- Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures. J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PloS one. 10 (3), (2015).
- Aguet, F., et al. Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).
- Roland, A. B., et al. Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth. eLife. 3, (2014).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization. Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).
- Bottier, C., et al. Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique. Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).
- Cadart, C., et al. Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells. Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).
- Marasso, S. L., et al. A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors. Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).
- Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas. Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).
- Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Götz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).
- abcam. Counting cells using a hemocytometer. , Available from: http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2017).
- ImageJ. Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing. , Available from: https://imagej.net/Image_Intensity_Processing (2017).
- ImageJ. 19. Tools. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html (2017).
