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Neuroscience

प्रतिदीप्ति बहिष्करण विधि और समर्पित Microfluidic उपकरणों के उपयोग द्वारा न्यूरॉन्स की उच्च संकल्प मात्रा इमेजिंग

Published: March 26, 2018 doi: 10.3791/56923
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Laboratoire Physico-Chimie Curie, Institut Curie, Institut Pierre-Gilles de Gennes pour la microfluidique, Université PSL, CNRS, 2UMR 144 Institut Curie, Université PSL, CNRS

Summary

मात्रा कोशिकाओं की शारीरिक और रोग विशेषताओं के बारे में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है । हम एक फ्लोरोसेंट अपवर्जन विधि का वर्णन पूर्ण-क्षेत्र माप की अनुमति के साथ इन विट्रो ंयूरॉन मात्रा उप micrometric अक्षीय संकल्प neurites और गतिशील संरचनाओं के विश्लेषण के लिए आवश्यक के साथ ंयूरॉन विकास में निहित है ।

Abstract

मात्रा अलग समय तराजू पर न्यूरॉन्स की शारीरिक और रोग विशेषताओं के बारे में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है । न्यूरॉन्स काफी अद्वितीय उनके विस्तारित ramified morphologies के बारे में कोशिकाओं रहे हैं और फलस्वरूप मात्रा माप के लिए कई methodological चुनौतियों बढ़ा. के विशेष मामले में इन विट्रो में ंयूरॉन वृद्धि, चुना पद्धति उप micrometric अक्षीय संकल्प को मिनट से घंटे या दिनों से समय तराजू पर पूर्ण क्षेत्र अवलोकन के साथ संयुक्त शामिल होना चाहिए । फोकल इमेजिंग, विद्युत आधारित माप या परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सेल आकार पुनर्निर्माण की तरह अन्य तरीकों के विपरीत, हाल ही में विकसित प्रतिदीप्ति अपवर्जन विधि (FXm) इन चुनौतियों को पूरा करने की क्षमता है । हालांकि, हालांकि अपने सिद्धांत में सरल किया जा रहा है, न्यूरॉन्स के लिए एक उच्च संकल्प FXm के कार्यांवयन एकाधिक समायोजन और एक समर्पित पद्धति की आवश्यकता है । हम यहां एक प्रतिदीप्ति अपवर्जन, कम किसी न किसी बहु डिब्बों microfluidic उपकरणों के संयोजन के आधार पर विधि प्रस्तुत करते हैं, और अंत में micropatterning को प्राप्त करने के लिए स्थानीय ंयूरॉन मात्रा के इन विट्रो माप । डिवाइस द्वारा प्रदान की उच्च संकल्प हमें ंयूरॉन प्रक्रियाओं के स्थानीय खंड (neurites) और कुछ विशिष्ट संरचनाओं जैसे विकास शंकु (जेन्टलमैन) में शामिल की मात्रा को मापने के लिए अनुमति दी ।

Introduction

सेलुलर मात्रा का सटीक ज्ञान पिछले वर्षों में वृद्धि की ओर ध्यान आकर्षित किया है, सेल आकार homeostasis के मुद्दे से प्रेरित एकल सेल सूक्ष्मजीवों में 1 और अधिक आम तौर पर mitotic कोशिकाओं 2में । हालांकि, कोशिका की मात्रा का सवाल पोस्ट-mitotic कोशिकाओं के लिए भी प्रासंगिक है, जिसके लिए न्यूरॉन्स एक paradigmatic उदाहरण का गठन करते हैं.

मात्रा वास्तव में शारीरिक और रोग की घटनाओं के एक महत्वपूर्ण हस्ताक्षर में अलग तराजू और समय-अंक ंयूरॉन जीवन में, परिवर्तनीय axonal विकृति से संबंधित विद्युत गतिविधि (मिलीसेकंड स्केल) से जुड़े 3 के लिए अपरिवर्तनीय neurodegenerative रोगों के स्पर्शोन्मुख चरण के दौरान होने वाली न्यूरॉन सूजन (मनुष्यों में वर्षों से अधिक) 4. हालांकि, सबसे बड़ी मात्रा परिवर्तन दिनों या हफ्तों के एक मध्यवर्ती समय के पैमाने में होता है (माना जीव पर निर्भर करता है) ंयूरॉन वृद्धि के दौरान । न्यूरॉन्स की विस्तारित और जटिल आकृति विज्ञान कई मुद्दों को उठाती है, जो बीच में सेल आकार के विनियमन. Axonal लंबाई और व्यास वास्तव में कसकर vivo मेंविनियमित रहे हैं, मूल्यों के साथ प्रत्येक के लिए विशिष्ट ंयूरॉन प्रकार 5,6.

इन मुद्दों, vivo मेंपता करने के लिए जटिल, भी इन विट्रो में एक सरलीकृत तरीके से संबोधित किया जा सकता है । उस उद्देश्य में, एक खंड माप के लिए समर्पित करने के लिए पर्याप्त तेजी से विकास की गतिशीलता का पालन करने के लिए (यानी मिनट के एक समय के पैमाने में) और घंटे या दिनों से अधिक प्रेक्षण के साथ संगत विधि की आवश्यकता है । कई तरीकों से विकसित किया गया है वर्षों में सेलुलर वॉल्यूम के लिए एक प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष पहुंच प्रदान करने के लिए इन विट्रो। फोकल इमेजिंग से सेल पुनर्निर्माण उनमें से एक है, लेकिन इस विधि से तात्पर्य लेबल और प्रकाश में दोहराया जोखिम जबकि के बारे में 500 एनएम के एक सीमित अक्षीय संकल्प दिखा 7। ध्यान दें कि इन दो आखिरी कमियां आंशिक रूप से एक और अधिक परिष्कृत और हाल ही में जाली प्रकाश चादर नाम विधि से दूर कर रहे है माइक्रोस्कोपी 8। परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी इस्तेमाल किया गया है 9 लेकिन इस स्कैनिंग विधि सार द्वारा है धीमी और थकाऊ । इसके अलावा, यह सेल के साथ की आवश्यकता है शारीरिक संपर्क न्यूरॉन्स की चरम कोमलता पर विचार माप के साथ हस्तक्षेप कर सकता है 10. अप्रत्यक्ष विधि प्रतिबाधा या प्रतिध्वनि का उपयोग कर विभिन्न प्रकार के सेल के लिए नियोजित किया गया है 11, लेकिन न्यूरॉन्स की तरह विस्तारित चिपकने वाली कोशिकाओं के लिए अपर्याप्त हैं.

सबसे होनहार तरीकों में से एक एक बंद एक फ्लोरोसेंट डाई से भरा कक्ष में कोशिकाओं के बाहर की मात्रा के उपाय पर आधारित है । प्रतिदीप्ति अपवर्जन विधि (FXm) इसके सिद्धांत में सरल है क्योंकि यह कोई लेबलिंग की आवश्यकता है, और तेजी से, एक संभावित उप ऑप्टिकल अक्षीय संकल्प के साथ सेल की आबादी के दीर्घकालिक ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए उपयुक्त है । अधिक ठीक है, जेड में संकल्प संस्कृति चैंबर में अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता पर निर्भर करताहै (यानी कोशिकाओं के क्षेत्र विहीन में) कैमरे के गतिशील रेंज से विभाजित है, हालांकि शोर के कई स्रोतों इस परम संकल्प सीमा । इस विधि को बहुत अनुयाई कोशिकाओं के पलायन की मात्रा का पालन करें 12 या स्तनधारी कोशिकाओं के बँटवारा के दौरान मात्रा परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए, के रूप में अच्छी तरह से 13में वर्णित बहुत शक्तिशाली है । हालांकि, न्यूरॉन्स उप-micrometric प्रक्रियाओं में उनके व्यापक असर पर विचार FXm के लिए एक methodological चुनौती का गठन.

हम यहां एक चिकनी FXm कक्षों के निर्माण के लिए अग्रणी विधि उच्च परिशुद्धता के साथ मात्रा और ंयूरॉन शाखाओं और गतिशील विकास शंकु की तरह ंयूरॉन विकास में शामिल संरचनाओं की ऊंचाई का उपयोग करने के लिए वर्तमान ।

कक्षों को मापने के लिए अक्षीय रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिमाइज़ करने के लिए ऑब्जेक्ट से समान ऊंचाई होनी चाहिए । इसलिए, हम तीन अलग ऊंचाइयों के केंद्रीय माप मंडलों द्वारा विशेषता अलग FXm उपकरणों डिजाइन किए हैं । सबसे पतले (ऊंचाई में 3 µm) neurite माप के लिए समर्पित है: इस कम ऊंचाई सोमा है, जो पास में रहने के 15 µm उच्च मध्यवर्ती चैंबर में शामिल नहीं है । मोटा केंद्रीय मंडलों (10 और 12 µm) पूरे सेल विकास का पालन करने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च हैं । इस उपकरण में केंद्रीय कक्ष के दोनों ओर स्थित दो जलाशय भी शामिल हैं । चार इंजेक्शन छेद (IH) इस प्रकार लागू कर रहे है और इस प्रकार के रूप में निर्दिष्ट कर रहे हैं: प्रवेश और आउटलेट के लिए चिप में सेलुलर निलंबन शुरू की सेवा, जबकि दो अंय जलाशयों फ़ीड ।

हम पहली ऊंचाई माप ज्ञात ज्यामिति के photoresist संरचनाओं का उपयोग करने के लिए अंशांकन coverslips गढ़े है । हम तो मुक्त ंयूरॉंस बढ़ imaged है, लेकिन यह भी आसंजन के micropatterns में न्यूरॉन्स विवश आकृति विज्ञान ।

Protocol

अध्ययन की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग पर यूरोपीय समुदाय के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था: 86/609/EEC । अनुसंधान प्रयोजन और प्रोटोकॉल ERCadg परियोजना वायलनचेलो के एथिकल अनुलग्नक में वर्णित हैं, जो अनुमोदित किया गया था और ERCEA द्वारा नियमित रूप से समीक्षा की है । Institut क्यूरी एनिमल फैसिलिटी ने comité d'Ethique en matière d'expérimentation एनिमल्स पेरिस सेंटर एट सूद (नेशनल रजिस्ट्रेशन नंबर: #59) के लिए लाइसेंस #C75-05-18, 24/04/2012, रिपोर्टिंग प्राप्त की है ।

1. मोल्ड का निर्माण

नोट: मोल्ड केंद्रीय और मध्यवर्ती एक प्रवेश और एक दुकान से जुड़े कक्षों में शामिल हैं, प्लस दो जलाशयों (और सुविधा) केंद्रीय चैंबर के दोनों किनारों पर स्थित है ।

  1. 51 मिमी व्यास सिलिकॉन वेफर्स में हेरफेर करने के लिए फ्लैट चिमटी का उपयोग करें और एक जगह से दूसरे में स्थानांतरित ।
  2. केंद्रीय चैंबर सिलिकॉन मोल्ड
    1. एक 2-एमएल प्लास्टिक पिपेट को पॉजिटिव photoresist के साथ भरें । स्थिति एक 51 के केंद्र में पिपेट मिमी व्यास सिलिकॉन वेफर और प्रेस अपने जलाशय पर photoresist के साथ वेफर सतह के 75% के बारे में कवर जब तक । स्पिन-कोट के लिए 3000 rpm पर 30 एस ।
    2. एक चूल्हा के लिए स्पिन-कोट से वेफर स्थानांतरण, 100 डिग्री सेल्सियस के एक सतह के तापमान के साथ, 50 एस के लिए ।
    3. चूल्हा से बाहर सब्सट्रेट धारक (चक) मुखौटा संरेखण के वेफर स्थानांतरण । "डरिए मास्क" के माध्यम से बेनकाब (अनुपूरक फ़ाइलें "masks_neuron_volume_chips. tiff" और "masks_neuron_volume_chips. dxf") देखें ।
    4. चक से वेफर निकालें तो यह एक 100 मिलीलीटर ग्लास सघन डेवलपर युक्त पकवान में गोता (पानी में कमजोर पड़ने 1:4) । वेफर रिलीज और यह 1 मिनट के लिए बनाए रखने जबकि लगातार और धीरे सघन पकवान सरगर्मी ।
      नोट: रिएजेंट को बचाने के लिए, अधिकतम पर ऊंचाई में 1 सेमी के लिए सघन पकवान भरें ।
    5. डेवलपर से वेफर वापस ले लो और यह एक 100 मिलीलीटर सघन के बारे में 10 एस के लिए पानी से भरा पकवान में डूब । तो एक शोषक कागज पर वेफर जगह और दबाव नाइट्रोजन एक हवा उड़ा बंदूक का उपयोग कर के साथ सूखी ।
    6. 50 एस के लिए एक चूल्हा पर 115 डिग्री सेल्सियस की सतह के तापमान के साथ वेफर प्लेस ।
    7. गहरी प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (डरिए) निम्नलिखित मापदंडों के साथ प्रदर्शन (डरिए तकनीक के बारे में अधिक जानकारी के संदर्भ में पाया जा सकता है 14 और 15); Passivation कदम: C4F8 के 50 sccm, वह समर्थन प्रवाह 10 sccm, सीपी 10 डब्ल्यू, Inductively युग्मित प्लाज्मा (आईसीपी) 1500 डब्ल्यू, कुल दबाव 24 mbar, तापमान 18 ° c; नक़्क़ाशी कदम: 100 SF6 के sccm, वह समर्थन प्रवाह 10 sccm, सीपी 11 डब्ल्यू, आईसीपी 1500 डब्ल्यू, कुल दबाव 24 mbar, तापमान 18 ° c; Passivation समय: 4 s; नक़्क़ाशी समय: 7 एस; कुल प्रक्रिया अवधि: आमतौर पर 5 मिनट के बारे में 10 µm धंसा गहराई ।
    8. एसीटोन से भरा एक सघन पकवान में सब्सट्रेट डाइविंग द्वारा photoresist भंग ।
    9. एक पिरांहा समाधान में वेफर जलमग्न (एच2ओ2 (30%) और एच2का 1/तो4 (5 मिनट के लिए 95%)) ।
      चेतावनी: हमेशा एच2ओ2 पहले जोड़ें और फिर एच2तो4 और साफ करने के बाद पानी से कम 3 बार कुल्ला ।
  3. 1.2.1 चरणों को 1.2.11 करने के लिए तालिकाएं 1-3में सूचीबद्ध पैरामीटर्स का अनुसरण करके मध्यवर्ती कक्षों के लिए इसी मोल्ड बनाना ।
    नोट: प्रत्येक तालिका केंद्रीय अवलोकन कक्ष की एक विशिष्ट ऊंचाई द्वारा विशेषता किसी दिए गए डिवाइस से मेल खाती है ।
    नोट: photoresists हाइट्स बढ़ाने का उपयोग करके पूरी प्रक्रिया निष्पादित करें (प्रत्येक डिवाइस के लिए मास्क 1 से 3, अनुपूरक फ़ाइलें "masks_neuron_volume_chips. tiff" और "masks_neuron_volume_chips. dxf") देखें ।
    1. स्पिन-कोट सब्सट्रेट धारक पर धंसा सिलिकॉन वेफर प्लेस ।
      1. जांच लें कि स्पिन-कोट सब्सट्रेट की आकांक्षा प्रभावी है कि सत्यापित करने के द्वारा ठीक से काम कर रहा है (सब्सट्रेट स्पिन और नाममात्र रोटेशन की गति के दौरान जगह में रहना चाहिए).
      2. एसयू-8 की चिपचिपाहट लक्षित मोटाई रेंज की ऊंचाई के साथ बढ़ जाती है । हमेशा 20-30 मिलीलीटर की बोतलों का उपयोग करने के लिए SU-8 photoresists की दुकान और यह स्पिन से पहले वेफर पर डाल-कोटिंग (SU-8 भी चिपचिपा हो सकता है एक प्लास्टिक पिपेट के साथ हेरफेर हो) ।
    2. नकारात्मक epoxy-प्रकार photoresist SU-8 सब्सट्रेट के केंद्र में सिलिकॉन वेफर का 75% के बारे में कवर जब तक, तो स्पिन-कोट पंक्ति में संकेत दिया मानकों का उपयोग कर डालो "टेबल के Spincoating" ।
    3. अवधि के लिए एक चूल्हा पर लेपित वेफर प्लेस और तापमान पंक्ति में संकेत दिया "शीतल सेंकना" ।
    4. धंसा वेफर और पर्याप्त "SU-8 मुखौटा" मुखौटा संरेखण पर माउंट ।
    5. समर्पित संरेखण का उपयोग कर मुखौटा के साथ धंसा वेफर संरेखित करें (इन पार के ठेठ आकार: 50 µm × 150 µm) प्रत्येक मुखौटा पर बनाया गया है ।
      नोट: डिवाइस के प्रत्येक पक्ष पर दो काटता पर्याप्त है (नीचे छोड़ दिया और ऊपर दाईं ओर एक में एक) ।
    6. "जोखिम ऊर्जा" पंक्ति में संकेत के रूप में मुखौटा संरेखण की I-लाइन का उपयोग कर बेनकाब (तरंग दैर्ध्य 365 एनएम) उपयुक्त यूवी खुराक के साथ ।
      नोट: जोखिम समय यूवी लैंप की प्रभावी शक्ति के द्वारा प्रत्येक photoresist के लिए जोखिम ऊर्जा ई विभाजन द्वारा गणना की है, मुखौटा के अवशोषण द्वारा संग्राहक: x (1- Equation 1 अवशोषणमास्क) । अवशोषण के बारे में 20% लचीला मास्क के लिए और क्रोमियम मुश्किल मुखौटा के लिए नगण्य है ।
    7. अवधि और पंक्ति में संकेत दिया तापमान के लिए एक चूल्हा पर लेपित वेफर प्लेस "पोस्ट सेंकना" ।
    8. तैयार २ १००-एमएल ग्लास-सघन व्यंजन, एक डेवलपर युक्त, अंय खाली । पंक्ति में संकेत दिया अवधि के लिए डेवलपर में वेफर गोता "विकास". आंदोलन धीरे सघन सभी विकास के साथ पकवान
    9. के बारे में 5 एस के लिए खाली सघन पकवान के ऊपर isopropanol के साथ वेफर छिड़क । अंत में, एक शोषक कागज पर वेफर जगह है और यह दबाव एक हवा उड़ा बंदूक का उपयोग कर नाइट्रोजन के साथ सूखी ।
    10. अवधि और पंक्ति में संकेत तापमान "हार्ड सेंकना के लिए एक चूल्हा पर लेपित वेफर प्लेस" (वैकल्पिक) ।
      नोट: यह कदम photoresist में दरारें से बचने और अगले चरणों के लिए एक सजातीय सपाट सतह प्रदान करने के लिए उपयोगी है ।
    11. तालिका 1-3में सूचीबद्ध प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए चरण 1.3.1-1.3.10 दोहराएं ।
    12. photolithography के अंतिम चरण के बाद, silanize एक 100 मिमी Trichloro पकवान में मास्टर के प्रत्येक पक्ष पर 2H (1, 4, 2H, perfluoro-octyl-silane) पेट्री के २ १०० µ एल बूंदों को डिस्पैच करके नकारात्मक photoresists की 3 परतों से मिलकर अंतिम मास्टर मोल्ड । एक प्लास्टिक की तेल फिल्म के साथ पेट्री डिस्क सील और कमरे के तापमान (आरटी) में 20 मिनट की मशीन ।
      नोट: मास्टर मोल्ड तैयार है और कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. PDMS चिप का निर्माण

  1. सिलिकॉन के 90 ग्राम आधारित कार्बनिक बहुलक (Polydimethylsiloxane: PDMS) एक 100 मिलीलीटर प्लास्टिक कप में डालो । इसके इलाज एजेंट के 10 ग्राम जोड़ें (1:10 वजन में) । 2-3 मिनट के लिए एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर मिश्रण हिलाओ ।
    नोट: 6 चिप्स के निर्माण के लिए इलाज एजेंट के 10 जी के साथ PDMS के 90 ग्राम मिश्रण ।
  2. PDMS में फंसे हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए लगभग 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम desiccator और पंप के भीतर मिश्रण रखें ।
  3. एक P100 पेट्री डिश में मास्टर मोल्ड प्लेस और एक सिरिंज का उपयोग कर मोल्ड पर मिश्रण के 15 मिलीलीटर डालना ।
    नोट: 15 मिलीलीटर 1.5 मिमी की कुल चिप ऊंचाई की ओर जाता है ।
  4. एक निर्वात desiccator और पंप के भीतर PDMS-मोल्ड संरचना प्लेस जब तक कोई और अधिक हवा PDMS की सतह पर फोड़ बुलबुले हैं ।
    नोट: इस चरण के बारे में 30 मिनट लगते हैं ।
  5. पेट्री डिश के तल पर वेफर पुश एक शंकु टिप का उपयोग करने के लिए वेफर से नीचे मृत PDMS मात्रा से बचने के । PDMS-मोल्ड डिवाइस को ओवन में 70 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे के लिए सेट में रखें ।
  6. एक रासायनिक हुड के तहत PDMS ब्लॉक एक स्टेनलेस स्टील के फ्लैट रंग का उपयोग कर और चिप पर isopropanol डालने से ढालना । यह हुड के स्टेनलेस स्टील बेंच पर रखें ।
  7. सिलिकॉन वेफर के आसपास कट और एक स्केलपेल का उपयोग कर PDMS प्रतिकृति ढालना ।
  8. चारों ओर कट (एक 2 मिमी मार्जिन छोड़) एक स्केलपेल या एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग चिप ।
  9. पंच 1.5 मिमी व्यास पंच मजबूती से दबाकर देता है और यह अत्यधिक कटौती और प्रवेश के छेद उत्कीर्ण करने के लिए । चिप जहां तरल इंजेक्ट किया जाएगा के चार समर्पित क्षेत्रों में एक ही मत करो ।
  10. चिपके हुए और microstructured ओर चिपकने वाला टेप छीलने द्वारा चिप साफ । दोनों तरफ isopropanol छिड़के । फिर दबाव नाइट्रोजन एक हवा उड़ा बंदूक का उपयोग कर के साथ चिप सूखी ।

3. नमूनों की coverslips का निर्माण (24 × 24 मिमी2)

नोट: घुमावदार चिमटी के साथ coverslips हेरफेर ।

  1. पाली-ornithine (पीएलओ) पॅटर्न
    1. ग्लास coverslips पर एक ओ2 सफाई प्लाज्मा लागू करें । प्लाज्मा पैरामीटर: दबाव नीचे पंपिंग: 0.25 mbar; ओ2 आपूर्ति अवधि: 3 min; गैस प्रवाह: 10 sccm; अधिकतम विचलन: ± 5 sccm; प्लाज्मा अवधि: 3 मिनट; सेट दबाव: 0.36 mbar; अधिकतम विचलन: ± 0.10 mbar; सेट शक्ति: 50 डब्ल्यू; अधिकतम विचलन: 5%; वेंटिंग अवधि: 45 एस ।
    2. एसिटिक एसिड और 3 के 56 µ एल के 484 µ एल मिश्रण-methacryloxypropyl-trimethoxysilane, पूर्ण इथेनॉल के साथ पूरा करने के लिए 15 मिलीलीटर की कुल मात्रा पाने के लिए ।
    3. एक 1-एमएल टिप शंकु का प्रयोग, एक coverslip पर इस समाधान के 500 µ एल की एक बूंद डाल, 2-3 मिनट के लिए प्रतीक्षा एक cleanroom microfiber वाइपर का उपयोग कर सूखी ।
      नोट: Silanized ग्लास coverslips एक प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ बंद प्लास्टिक बक्से के भीतर कमरे के तापमान पर 1 महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
    4. एक साफ कमरे के वातावरण में स्थित एक स्पिन कोट पर प्रत्येक coverslip रखें । एक सकारात्मक coverslip के 75% के बारे में कवर photoresist की एक बूंद रखो (के बारे में 500 µ एल) और स्पिन-30 एस के लिए 4000 rpm पर कोट 0.45 µm की एक अंतिम मोटाई तक पहुंचने के लिए ।
    5. एक चूल्हा पर 115 डिग्री सेल्सियस की सतह के तापमान के साथ 1 मिनट के लिए coverslips प्लेस ।
    6. एक मुखौटा संरेखण का उपयोग करना, एक coverslip 435 एनएम के एक तरंग दैर्ध्य (जी लाइन) को समर्पित मुखौटा के माध्यम से कपड़े के मापदंडों के अनुसार बेनकाब (यूवी खुराक के बारे में 50-60 mJ.cm-1)
    7. 2 ग्लास सघन व्यंजन तैयार करें, जिसमें डेवलपर (कोई कमजोर पड़ने वाला), अंय युक्त पानी शामिल है ।
    8. एक के बाद एक 1 मिनट के लिए डेवलपर में प्रत्येक coverslip गोता जबकि लगातार और धीरे से सघन पकवान सरगर्मी । तो के बारे में 5 एस के लिए जल में वेफर जलमग्न एक शोषक कागज पर वेफर प्लेस और दबाव नाइट्रोजन एक हवा उड़ा बंदूक का उपयोग कर के साथ सूखी ।
    9. 3.1.1 के रूप में एक ही पैरामीटर के साथ एक सक्रियण ओ2 प्लाज्मा लागू करें ।
    10. हुड के नीचे, एक 100 µ g/mL पीएलओ समाधान प्रति P100 पेट्री डिश के ४ १७० µ एल ड्रॉप्स का निपटारा करें । इन बूंदों में से प्रत्येक पर coverslips के नमूनों चेहरा रखो । सुखाने से बचने के लिए एक प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ पेट्री डिश सील । आरटी पर रात भर गर्मी ।
      नोट: पीएलओ समाधान coverslips से केशिकाता से जुड़ा रहना चाहिए ।
    11. चार प्राप्तकर्ताओं तैयार (आमतौर पर P60 पेट्री व्यंजन), उनमें से तीन पंजाबियों के साथ और एक पानी के साथ चौथे एक भरें । शुद्ध इथेनॉल के दो गिलास सघन व्यंजन तैयार करें ।
    12. पेट्री व्यंजन से प्रत्येक coverslip बाहर ले लो, यह 10-15 एस के लिए पहले पंजाब स्नान में जलमग्न, एक अवशोषित ऊतक पर किनारे पर खड़ी coverslip डाल द्वारा तरल निकासी, यह के साथ डालने के उदा के साथ इथेनॉल स्नान के अंदर नमूनों चेहरा ।
      नोट: एक बार photoresist के विघटन पूरा हो जाता है, यह coverslip के नमूनों पक्ष का पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है. इसलिए, यह इस स्तर पर महत्वपूर्ण है इसके स्थान का पता लगाने ।
    13. एक अल्ट्रासोनिक स्नान sonicator (120 डब्ल्यू/35 kHz) और photoresist 3 मिनट के लिए भंग हो जाने के भीतर इथेनॉल सघन पकवान प्लेस ।
      नोट: इथेनॉल स्नान हर 4 coverslips बदलने के लिए पंजाबियों कि photoresist के विघटन ख़राब हो सकता है द्वारा कमजोर पड़ने की सीमा ।
    14. बाहर इथेनॉल स्नान से coverslip ले लो, तो दूसरा पंजाबियों स्नान में इसे कई बार गोता । सतह पहलू की जांच करें जब तक चिकना-सतह की तरह है कि इथेनॉल के शेष तरल फिल्म से परिणाम गायब हो जाता है ।
    15. 5-10 के लिए जलमग्न तीसरे पंजाब में coverslip एस स्नान । इसके बाद तत्काल इसे जल स्नान के लिए स्थानांतरित करें । एक शोषक कागज पर coverslip प्लेस और दबाव एक हवा उड़ा बंदूक का उपयोग कर नाइट्रोजन के साथ सूखी ।
      नोट: पानी में पिछले कुल्ला सूख कदम के दौरान पंजाब के क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  2. ऊंचाई अंशांकन के लिए Photoresist संरचनाओं
    1. केवल 3.1.4 चरण निष्पादित करें । ते 3.1.8. समर्पित मुखौटा का प्रयोग (मुखौटा "Photoresist धारियों", अनुपूरक फ़ाइल देखें "Mask_Photoresist-stripes. dxf") ।

4. चिप कोडांतरण और अंतिम कार्यांवयन

  1. ग्लास नीचे व्यंजन पर चिप कोडांतरण
    1. दोनों PDMS चिप और ग्लास डिश है जिस पर यह सतह सक्रियण के लिए प्लाज्मा चैंबर में बंधुआ जाएगा रखो । पैरामीटर: दबाव नीचे पंपिंग: 0.25 mbar; ओ2 आपूर्ति अवधि: 3 min; गैस प्रवाह: 10 sccm; अधिकतम विचलन: ± 5 sccm; प्लाज्मा अवधि: 30 एस; सेट दबाव: 0.40 mbar; अधिकतम विचलन: ± 0.10 mbar; सेट शक्ति: 50 डब्ल्यू; अधिकतम विचलन: 5%; वेंटिंग अवधि: 45 एस ।
    2. धीरे कांच coverslip के साथ संपर्क में सक्रिय PDMS चिप डाल दिया, और नाजुक चिप के किनारों पर दबाव लागू करने के लिए coverslip के लिए चिप बांड । बंधन ताकत बढ़ाने के लिए, 5 से 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में डिवाइस जगह है ।
      नोट: स्तंभों से युक्त भागों पर प्रेस नहीं है, वे बहुत अधिक दबाव में गिर सकता है ।
    3. हुड के तहत (यानी आरटी पर) और संबंध के बाद 30 मिनट के भीतर, एक 10-µ एल टिप शंकु IHs पर एक 100 µ जी/एमएल पीएलओ समाधान के साथ भरा जगह है, तो तरल इंजेक्शन । प्रत्येक IHs के शीर्ष पर एक ड्रॉप बनाने के क्रम में मात्रा समायोजित करें । फिर, एक 1 मिलीलीटर टिप शंकु का उपयोग कर, सभी चिप के आसपास पेट्री डिश में पंजाबियों जोड़ें ।
    4. 2 एच मशीन समय की एक ंयूनतम के साथ आर टी पर चिप चलो । रात भर की गर्मी के लिए, पेट्री एक प्लास्टिक आयल फिल्म का उपयोग करने के लिए सुखाने से बचने पकवान सील ।
      नोट: तरल चिप के बाहर नहीं टपकाना चाहिए अंयथा चिप छोड़ दिया जाना चाहिए ।
    5. प्रत्येक IH में हल्के से एक 10-µ एल टिप शंकु दबाएँ और तरल की अधिक चूसना. तो आउटलेट के अंदर पूरी तरह से टिप शंकु छड़ी और शेष तरल आकर्षित ।
    6. स्थ पीएलओ चरणों में दिए गए निर्देशों का पालन laminin करके 4.1.5 (खाली करना) और 4.1.3 (भरना). 1 एच के लिए आरटी पर मशीन ।
    7. 4.1.5 (खाली) और 4.1.3 (भरने) चरणों में दिए गए निर्देशों का पालन संस्कृति माध्यम से laminin बदलें । संस्कृति माध्यम की संरचना: मेम ८१.८%; सोडियम पाइरूवेट 100 मिमी 1%; Glutamax 200 mM 1%; हार्स सीरम 5%; B27 अनुपूरक 2%, N2 अनुपूरक 1%, Gentamicin 0.2%; 220-एनएम फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान फ़िल्टर करें । एक 1 मिलीलीटर टिप शंकु का प्रयोग, भी इस माध्यम से चिप आसपास के पंजाबियों की जगह ।
    8. मशीन 37 डिग्री सेल्सियस पर विनियमित में चिप रखो और 5% सह के लिए2 से कम 5 घंटे (या रातोंरात) ंयूरॉन बोने से पहले ।
  2. चिप नमूनों coverslips का उपयोग कर कोडांतरण
    नोट: यदि प्रतिमानात्मक coverslips में धनात्मक photoresist संदर्भ ऑब्जेक्ट्स शामिल हैं, तो 4.2.9 करने के लिए 4.2.1 चरण निष्पादित करें । अंयथा, केवल कदम 4.2.3 प्रदर्शन, पीएलओ नमूनों coverslip पर PDMS डिवाइस छड़ी के रूप में 4.1.2 में संकेत दिया, संस्कृति माध्यम अंदर और चिप के आसपास तो कदम 4.2.10 जाना है ।
    1. एक आयताकार मोटी माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर पानी की एक बूंद जमा और केशिकाओं द्वारा कांच स्लाइड पर coverslip छड़ी (गैर नमूनों की ओर कांच स्लाइड का सामना करना पड़) । एक माइक्रोस्कोप के तहत, एक महसूस कलम का उपयोग कर कांच स्लाइड के पीछे पर photoresist धारियों के स्थान निशान ।
    2. मास्क के संरेखण के मास्क धारक पर नमूनों ग्लास coverslip रखें । photoresist संदर्भ ऑब्जेक्ट केंद्र के लिए लगा पेन के साथ किए गए चिह्न पर निर्भर करते हैं ।
    3. PDMS चिप पर शुू में बताए गए अनुसार प्लाज्मा स्टेप परफॉर्म करें ।
    4. PDMS चिप को मास्क संरेखण के मोबाइल सब्सट्रेट होल्डर (चक) पर रखें ।
      नोट: ऑप्टिक इसके विपरीत बढ़ाने के लिए, PDMS चिप के नीचे एक सिलिकॉन वेफर जगह है । सिलिकॉन वेफर मजबूती से संरेखण प्रक्रिया के दौरान चक पर संलग्न रहना चाहिए (एक पारदर्शी टेप का उपयोग करने के लिए यह चक छड़ी) ।
    5. यांत्रिक संपर्क की सीमा पर चक लिफ्ट के लिए coverslip पर स्थित photoresist धारियों की सरणी के साथ चिप संरेखित करें ।
    6. चिप और coverslip के बीच यांत्रिक संपर्क को समाप्त करने के ऊपर PDMS खंभे की सतह तक चक उठाने के गिलास coverslip को छूने से प्राप्त ।
    7. चक कम । निकालें coverslip अब मुखौटा धारक से चिप के लिए बंधुआ । तो एक 35 मिमी पेट्री डिश में डिवाइस जगह है, और 5 से 10 मिनट के लिए ओवन में सब कुछ हस्तांतरण (तापमान: 70 डिग्री सेल्सियस) बांडिंग ताकत बढ़ाने के लिए ।
    8. चरण 4.1.3 में के रूप में निष्पादित करें ।
      नोट: पीएलओ patterned coverslips का उपयोग करते हैं, तो चरण 4.2.7 चरण 4.2.9 से सीधे जाएं ।
    9. 4.1.5 (खाली) और 4.1.3 (भरने) चरणों में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद चढ़ाना माध्यम से पीएलओ बदलें । एक 1 मिलीलीटर टिप शंकु का प्रयोग, भी इस माध्यम से चिप आसपास के पंजाबियों की जगह ।
    10. मशीन 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर विनियमित में चिप रखो2 जब तक ंयूरॉन सीडिंग, 5 ज मशीन समय की एक ंयूनतम के साथ ।

5. ंयूरॉन संस्कृति

  1. HBSS 10x के 10 मिलीलीटर, Hepes 1 मीटर की 2 मिलीलीटर और एक 200 मिलीलीटर प्लास्टिक कुप्पी में बाँझ पानी की 88 मिलीलीटर मिश्रण से विच्छेदन मध्यम (एचएच मध्यम) की 100 मिलीलीटर तैयार करें ।
    नोट: HH माध्यम संस्कृति के पहले दिन तैयार किया जा सकता है ।
  2. E18 चूहों से काटना हिप्पोकैम्पस गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा एक मां euthanized से निकाले भ्रूण (C57BL/6J चूहों चार्ल्स नदियों से) । विच्छेदन के चरण 16में विस्तृत उदा .
  3. एक प्लास्टिक ट्यूब में हिप्पोकैम्पस प्लेस trypsin (0.3 मिलीलीटर की trypsin 2.5%, w/o EDTA में 2.7 मिलीलीटर) 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रासायनिक पृथक्करण शुरू करने के लिए ।
  4. लगभग सभी तरल को छोड़ दें और इसे 5 से 10 मिलीलीटर डिस्पोजेबल प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर HH के साथ बदलें । इसे 3 बार करें । अंतिम भरण के लिए, HH के बजाय मध्यम चढ़ाना के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
  5. आकांक्षी और पूरी मात्रा कई बार बाहर निकालने के द्वारा एक 1 मिलीलीटर टिप-शंकु का उपयोग कर ऊतकों यांत्रिक अलग कर देना, बुलबुले बनाने से परहेज और कोई 15-20 से अधिक मार्ग का उपयोग कर ।
  6. एक अलग 500 µ एल प्राप्तकर्ता में, पंजाब के 45 µ एल में पतला सेल निलंबन के 5 µ एल का उपयोग कर एक समाधान तैयार करते हैं । एक 10 µ एल पिपेट का उपयोग कर इस समाधान के 1 µ एल ले लो और एक Malassez सेल काउंटर में पतला निलंबन डालें । कक्षों की संख्या का अनुमान लगाने के लिए 17 में दिए गए संकेतों का उपयोग करें ।
    नोट: एक एकल हिप्पोकैम्पस आमतौर पर ंयूरॉंस के बारे में ५००,००० प्रदान करता है ।
  7. आर टी पर 6 मिनट के लिए 100 x जी में केंद्रापसारक
  8. supernatant त्यागें और यह १०,०००,००० कोशिकाओं की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक मध्यम चढ़ाना की मात्रा से प्रतिस्थापित/ क्रमिक आकांक्षा द्वारा कोशिकाओं को पुनः निलंबित और एक 1 मिलीलीटर टिप शंकु के साथ सेल निलंबन बेदखल ।
  9. चढ़ाना मध्यम चिप में उपस्थित ड्रा (चरण 4.1.5 को देखें) । एक 10-µ l पिपेट का उपयोग कर नए सिरे से निलंबित समाधान के 2-3 µ एल लीजिए और यह प्रवेश पर सुई (इंजेक्शन 4.1.3 चरण में वर्णित प्रक्रिया को देखें). आउटलेट पर तुरंत ही कार्रवाई दोहराएं ।
  10. प्रत्येक जलाशय में मध्यम चढ़ाना की एक ही मात्रा के बारे में सुई (चरण 4.1.3 को देखें) ।
    नोट: जल्दी से माइक्रोस्कोप के तहत चिप का निरीक्षण करने के लिए कोशिकाओं के घनत्व की जांच । इष्टतम कोशिका घनत्व की भयावहता का क्रम 4 स्तंभों (लगभग 0.3 mm2, यानी के बारे में 15-20 कोशिकाओं प्रति मिमी2) द्वारा सीमांकित वर्ग सतह के भीतर के बारे में 5-10 कोशिकाओं के लिए मेल खाती है ।
  11. अंततः दोहराने कदम 5.10 बजाय 0.5-1 µ एल सेल निलंबन के लक्षित सेल घनत्व तक पहुंचने का उपयोग कर ।
  12. एक मशीन 37 डिग्री सेल्सियस 5% CO2पर विनियमित में वरीयता प्राप्त चिप रखें ।

6. प्रतिदीप्ति अपवर्जन प्रेक्षण

  1. इमेजिंग माध्यम द्वारा संस्कृति माध्यम का प्रतिस्थापन ।
    1. 4.1.7 में इमेजिंग माध्यम के रूप में तैयार लेकिन उपयोग के बजाय phenol लाल से रहित मेम और फ्लोरोसेंट dextran जोड़ें । उस उद्देश्य में, पतला dextran (आणविक वजन 10,000 ग्राम//इमेजिंग माध्यम में 0.5-1 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, शेयर समाधान 10/पंजाब में मिलीग्राम/
      नोट: अवशोषण/उत्सर्जन maxima 496/524 या 650/668 के साथ Dextran conjugates का प्रयोग करें । छवि 0.45 µm उच्च सकारात्मक photoresist संरचनाओं के लिए पहले पसंद (लाल बैंडविड्थ में अपने ऑटो प्रतिदीप्ति से छुटकारा पाने के लिए) और छवि ंयूरॉंस के लिए दूसरा (कम विषाक्त) ।
    2. खाली सभी एक 10-µ एल पिपेट का उपयोग कर देता है और फिर उंहें पूरी तरह से इमेजिंग माध्यम के साथ भरें (कदम 4.1.3 और 4.1.5 मध्यम प्रतिस्थापन की सटीक कार्यप्रणाली के लिए देखें) ।
  2. इमेजिंग
    1. एक epifluorescence एक पर्यावरण 37 डिग्री सेल्सियस और सह2के 5% पर विनियमित चैंबर से सुसज्जित माइक्रोस्कोप के तहत चिप प्लेस । एक 40X का प्रयोग करें, संख्यात्मक एपर्चर (NA) 0.8 शुष्क उद्देश्य, पूर्ण शक्ति का 30% (पूर्ण शक्ति: 3 डब्ल्यू) और 30 जोखिम समय के एमएस । ध्यान में कोशिकाओं की छवियों को प्राप्त (एकल से कई क्रमिक छवियों के लिए समय चूक प्रयोगों के मामले में).
  3. छवि विश्लेषण
    1. एक सजातीय पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर में लागू की पृष्ठभूमि में कमी दिनचर्या का उपयोग छवियों को सामान्य. इस सॉफ़्टवेयर में शामिल छवि संसाधन चरणों के विवरण के लिए 13 देखें । आउटपुट छवि एक है । चटाई प्रारूप ।
    2. में. चटाई फ़ाइल में । झगड़ा 8 बिट्स छवियां पूरक सामग्री (conversion_mattotiff. m, जो importfilevol. m के लिए कॉल) में दिनचर्या का उपयोग कर ।
    3. आयात करें > छवि अनुक्रम ImageJ पर से एक वीडियो बनाने के लिए प्रदर्शन । TIFF छवियां ।
    4. एक स्तंभ (संदर्भ वस्तु) के केंद्र में स्थानीयकृत एक वर्ग क्षेत्र के माध्य तीव्रता पी और कोशिकाओं (पृष्ठभूमि, यानी ऊंचाई शून्य) कक्ष विहीन चैंबर के एक वर्ग क्षेत्र का मतलब तीव्रता बी की गणना. छवि प्रसंस्करण की विस्तृत कार्यप्रणाली का एक उदाहरण के लिए 18 देखें.
      नोट:, तीव्रता संदर्भों के रूप में इस्तेमाल वर्ग क्षेत्रों के पार्श्व आयाम स्तंभ व्यास के बारे में आधा होना चाहिए, जबकि स्तंभ किनारों से प्रकाश प्रदूषण से बचने के पिक्सल की एक पर्याप्त संख्या पाने के लिए ।
    5. तीव्रता से रैखिक रूपांतरण कानून स्थापित करने के लिए P और B मानों का उपयोग करें i ऊँचाई h:
      Equation 2
      कक्ष के ज्ञात ऊँचाई hc के साथ, और Equation 3Equation 4
      नोट: PDMS कोई detectable autofluorescence प्रदर्शित करता है ।
    6. ब्याज के क्षेत्र के आसपास के एक इलाके का चयन करें, तीव्रता ImageJ का उपयोग कर एकीकृत (अधिक जानकारी के लिए 19 देखें) और 6.3.5 में प्राप्त रूपांतरण कानून लागू करने के लिए एक सेल डिब्बे की मात्रा को मापने के लिए ।
      नोट: ब्याज के क्षेत्र actin जैसे उप सेलुलर तत्वों के प्रतिदीप्ति के आधार पर चुना जा सकता है, जैसे, GFP-LifeAct न्यूरॉन्स में वृद्धि शंकु के चयन के लिए, GFP उत्सर्जन चैनल में रुचि के क्षेत्र का चयन करें, इस के समोच्च सहेजें एक रॉय प्रबंधक उपकरण का उपयोग कर क्षेत्र, तो dextran (लाल में) के उत्सर्जन चैनल में एक ही क्षेत्र के भीतर संलग्न कोशिका मात्रा को मापने.

Representative Results

1 और 2 वर्गों में वर्णित निर्माण की प्रक्रिया का परिणाम आंकड़ा 1a-1b और चित्रा 1Cके वक्र की छवियों से सचित्र है । चित्रा 1 डी की तालिका PDMS चिप के दो अलग प्रतिनिधि क्षेत्रों के किसी न किसी मूल्यों को प्रदर्शित करता है, यानी केंद्रीय और 20 µm उच्च अगले मध्यवर्ती चैंबर में. के बारे में 7 के एक कारक द्वारा किसी न किसी कमी से प्राप्त किया गया है का उपयोग करके धंसा Si वेफर के बजाय एसयू-8 photoresist. फिर, FXm पहले एक 10 µm उच्च कक्ष के भीतर ज्ञात ज्यामिति (चित्रा 2a) के एक photoresist धारी पर लागू किया गया था । छवि प्रसंस्करण और ऊंचाई रूपांतरण के लिए तीव्रता के बाद ( चित्रा 2 बीका ग्राफ देखें), FXm प्रोफाइल क्रॉस पर प्रदर्शन किया इस धारी साथ वर्गों (चित्रा 2c) वांछित ऊंचाई प्रोफाइल (चित्रा 2d) प्रदान करते हैं । चित्रा 2d यांत्रिक profilometry और FXm तरीकों का उपयोग कर प्राप्त प्रोफाइल के बीच तुलना से पता चलता है । धार और पठार मूल्य सहित इन प्रोफाइल, बहुत समान हैं, विधि मांय । ध्यान दें कि FXm डेटा के कैटरिंग विधि के अंतिम समाधान का प्रतिनिधि नहीं है, के रूप में आगे चित्रा 3 और चित्रा 4में मूल्यांकन किया है, लेकिन कम तीव्रता से परिणाम के लिए बहुत कमजोर के संभावित प्रभाव से बचने के लिए नियोजित GFP चैनल में photoresist का ऑटो-प्रतिदीप्ति ।

फिर, हम 3 µm और 10 µm उच्च मंडलों (चित्रा 3) में neurites मनाया । पृष्ठभूमि शोर के मानक विचलन ऊंचाई रूपांतरण और पृष्ठभूमि सुधार करने के लिए तीव्रता के बारे में 18 एनएम है । यह मान PDMS (12 एनएम, चित्र 1 डी) की मेज पर डाली सतहों की शारीरिक असहजता की तुलना में थोड़ा अधिक है, लेकिन PDMS SU-8 मोल्ड से प्राप्त पर मापा किसी न किसी की तुलना में बहुत कम है । इन परिणामों के बजाय एसयू-8 में छेद खोलने से सिलिकॉन वेफर्स में ड्रिलिंग कुओं के जोड़ा मूल्य पर प्रकाश डाला खंभे photoresist । इस तरह के एक कम मूल्य शोर अनुपात और चित्रा 3ए में प्रदर्शित एक के रूप में इस तरह की मात्रा में बहुत स्पष्ट छवियों के लिए एक उच्च संकेत की अनुमति देता है । इस तरह के चित्रों से प्राप्त किया जा सकता है कि डेटा का एक उदाहरण के रूप में, हम 1.6 µm (यानी 10 पिक्सल) चौड़े neurite स्लाइस ( चित्र बी12 का ग्राफ देखें) की मात्रा की गणना । एक पहले सन्निकटन में इन आंकड़ों के एक रैखिक फिट का उपयोग कर के बारे में 400 एनएम के एक मतलब neurite ऊंचाई मूल्य देता है, के लिए 500 एनएम axonal व्यास में पाया 10 दिनों पुराने पिल्ले के उदा के साथ तुलना में 5महासंयोजिका । हम भी abutted 2 µm और लंबाई में 30 µm के 6 µm व्यापक धारियों से मिलकर आसंजन के micropatterns के साथ संयुक्त FXm । हमारा उद्देश्य अपने 3d आकार पर neurite चौड़ाई के प्रभाव का अध्ययन करना था । चित्रा 3 सी एक पूरे ंयूरॉन एक 10 µm उच्च कक्ष में प्राप्त छवि के झूठे रंग में एक 3 डी प्रतिनिधित्व से पता चलता है । Neurites 2 µm और 6 µm चौड़ी धारियों पर फैल रहे हैं, जबकि सोमा सबसे बड़ा धारी के चरम पर स्थित है । ऊंचाई प्रोफाइल तीन अलग क्रॉस वर्गों में तैयार किया गया । चित्रा3 ए में प्रदर्शित ग्राफ के साथ जुटना में, पार पर एकीकृत सतह neurite चौड़ाई (चित्र 3d) के साथ वृद्धि हुई है ।

हम भी वृद्धि शंकु (जीसी) 3d संरचनाओं पर ध्यान केंद्रित किया । चित्र 4 a-B दो अलग GC प्रोफाइल एक 3 µm उच्च कक्ष है, जो उनके branched उप संरचना पर प्रकाश डाला में प्राप्त प्रदर्शित करता है । इसके अलावा, हम एक 12 µm उच्च कक्ष में जेन्टलमैन की मात्रा की गतिशीलता का पालन करने के लिए समय चूक प्रयोगों प्रदर्शन किया. चित्र 4c मिनटों के कुछ दसियों के समय स्केल के भीतर किसी दिए गए GC के सिकुड़ने और पुनः सक्रियण का एक चक्र प्रदर्शित करता है । GFP-lifeact चूहों के उपयोग के लिए धन्यवाद, विकास शंकु उनके उच्च actin एकाग्रता से GFP उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य (510 एनएम) में स्थानीयकृत थे. तरंग दैर्ध्य पर पहचान की सतह को 647 एनएम में dextran उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एकीकृत करने के लिए GC मात्रा गणना इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 4d अंत में तीन अलग ंयूरॉंस पर अलग समय अंक और स्थान पर GC मात्रा के वितरण से पता चलता है, के बारे में 6 µm3के मूल्य पर केंद्रित ।

Figure 1
चित्र १: FXm PDMS चेंबर्स. (क) microfabrication के चार विभिंन मुख्य चरणों की योजनाओं के अंतिम मोल्ड करने के लिए अग्रणी । प्रवेश, आउटलेट और जलाशयों के स्थान संकेत कर रहे हैं । स्केल बार्स: 1 मिमी। (ख) PDMS FXm चैंबर की छवि एक ऑप्टिकल profilometer का उपयोग कर प्राप्त की । इस छवि को 10 µm उच्च स्तंभों और ऊंचाई में 20, 50 और 90 µm के मध्यवर्ती मंडलों की 3 पंक्तियों वाले केंद्रीय चैंबर से पता चलता है । स्केल बार: 500 µm. (ग) दो डैश्ड (B) में तैयार लाइनों के साथ चिप के पार अनुभागीय दृश्य. पीला/सोने: पार अनुभाग खंभे के साथ, नीला: पार स्तंभों के बीच अनुभाग । (घ) PDMS असभ्यता के मूल्यों का मतलब 50 × 50 µm2 क्षेत्रों सिलिकॉन पर ढाला और 20 µm उच्च एसयू-8 मध्यवर्ती चैंबर पर मापा (इन क्षेत्रों के स्थान के लिए तीर देखें) । मतलब मान तीन विभिन्न क्षेत्रों की माप से प्राप्त किए गए. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: FXm विधि के अंशांकन ब्याज की वस्तु के रूप में एक photoresist धारी का उपयोग कर. (क) GFP-प्रतिदीप्ति छवि एक 10 µm उच्च 10,000 मेगावाट dextran से भरा कक्ष 488 एनएम में अवशोषित 1 मिलीग्राम/एमएल में ले लिया । (ख: पृष्ठभूमि, पी: स्तंभ) । एक सूखी 40X न 0.8 उद्देश्य के साथ अवलोकन । स्केल बार: 50 µm. (B) रेखीय अंशांकन कानून में दर्शाए गए दो रंगीन आयतों का माध्य तीव्रता से प्राप्त किया गया. (C) प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल (a) में प्रदर्शित नीली डैश्ड रेखा के स्तर पर प्राप्त किया गया, photoresist को पार करना धारी (0.45 µm उच्च सकारात्मक photoresist). (D) (B) (नीला डॉट्स) के डेटा की ऊंचाई कनवर्ज़न को तीव्रता के बाद यांत्रिक profilometer (काले डॉट्स) और FXm से प्राप्त प्रोफाइल की तुलना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Neurite वॉल्यूम इमेजिंग. (क) Neurite अगले 15 µm मध्यवर्ती कक्ष में स्थित सोमा से केंद्रीय 3 µm उच्च कक्ष में विस्तार । इमेजिंग 488 एनएम और एक 40X, न 0.8 सूखी उद्देश्य पर अवशोषित 10,000 मेगावाट dextran का उपयोग कर प्रदर्शन किया । पृष्ठभूमि में कमी दिनचर्या के उपयोग के बाद प्राप्त इनसेट दो neurites पर प्रकाश डाला गया और सही पर ग्राफ साजिश चुना । स्केल बार्स: 30 µm। (ख) 22 प्रोफाइल से प्राप्त Neurite चौड़ाई के एक समारोह के रूप में Neurite स्लाइस मात्रा (10 पिक्सल पर औसत, एक 1.6 µm "Neurite स्लाइस" पर अर्थात ) (a) में दिखाया गया है । ठोस लाइन ढलान 0.4 µm मूल के माध्यम से गुजर के एक रैखिक फिट का प्रतिनिधित्व करता है । (ग) एक चिपकने वाला ंयूरॉन के झूठी रंग की छवि को एक के साथ लगातार 2 µm और 6 µm चौड़ा स्टंप (सफेद में प्रतिनिधित्व किया) । माप एक 10 µm उच्च 10,000 मेगावाट dextran 647 एनएम को अवशोषित और एक 40x NA 0.8 शुष्क उद्देश्य का उपयोग कर के साथ भरा कक्ष में किए गए । (D) ऊंचाई प्रोफ़ाइल रंगीन डैश्ड रेखाओं के संगत (C), एक ही रंग कोड रखते हुए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: स्थिर और गतिशील विकास शंकु इमेजिंग. (A-B) वृद्धि शंकु ऊंचाई प्रोफाइल संबंधित छवियों में प्रदर्शित पीले लाइनों के साथ ऊंचाई रूपांतरण के लिए तीव्रता के बाद एक 3 µm उच्च कक्ष में प्राप्त की । अवलोकन के साथ एक को भरने का उपयोग किया 10,000 मेगावाट dextran को अवशोषित 488 एनएम और एक 40X, NA 0.8 शुष्क उद्देश्य । (ग) एक 12 µm उच्च 10,000 मेगावाट dextran से 647 एनएम में अवशोषित चैंबर में पूरे ंयूरॉन इमेजिंग । प्रेक्षणों दो फ्लोरोसेंट चैनल में किया गया है: विकास शंकु स्थानीयकरण के लिए GFP (पीली लाइनें धराशायी), और प्रतिदीप्ति अपवर्जन से GC मात्रा की गणना करने के लिए CY5. सतह डैश्ड पीली रेखाओं द्वारा शामिल GC वॉल्यूम की गणना करने के लिए उपयोग किया गया था । ग्राफ समय के साथ GC मात्रा की भिन्नता से पता चलता है, और दो प्रतिनिधि अलग समय बिंदुओं पर दोनों GFP और CY5 चैनल में जुड़े morphologies. सभी डेटा एक 40x NA 0.8 शुष्क उद्देश्य हर 3 मिनट का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे. स्केल बार्स: 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

कदम मास्क 1:8 µm परत मुखौटा 2:30 µm परत मास्क 3:40 µm परत
एसयू-8 प्रकार 2007 2025 2050
Spincoating 30 s @ 2000 आरपीएम 30 s @ 3050 आरपीएम 30 एस @ 3250 आरपीएम
शीतल सेंकना 3 मिनट @ 95 ° c 2 min @ 65 ° c + 6 min @ 95 ° c 3 मिनट @ 65 ° c + 7 min @ 95 ° c
एक्सपोजर एनर्जी 110 माइकल क्/2 155 माइकल क्/2 170 माइकल क्/2
पोस्ट-एक्सपोजर सेंकना 4 min @ 95 ° c 1 मिनट @ 65 ° c + 6 min @ 95 ° c 2 min @ 65 ° c + 7 min @ 95 ° c
विकास 2 मिनट 30 एस 5 min 6 min
हार्ड सेंकना (वैकल्पिक) 3-5 मिनट @ 200 ° c 3-5 मिनट @ 200 ° c 3-5 मिनट @ 200 ° c

तालिका 1: Photolithography चरण में 12 माइक्रोन की ऊंचाई वाले केंद्रीय कक्ष वाले डिवाइस बनाने के लिए प्रदर्शन किया गया. मध्यवर्ती मंडलों की ऊंचाइयां: 20, 50 और 90 µm ।

कदम मास्क 1:10 µm परत मुखौटा 2:30 µm परत मास्क 3:40 µm परत
एसयू-8 प्रकार 2007 2025 2050
Spincoating 30 s @ 1500 आरपीएम 30 s @ 3050 आरपीएम 30 एस @ 3250 आरपीएम
शीतल सेंकना 3 मिनट @ 95 ° c 2 min @ 65 ° c + 6 min @ 95 ° c 3 मिनट @ 65 ° c + 7 min @ 95 ° c
एक्सपोजर एनर्जी 125 माइकल क्/2 155 माइकल क्/2 170 माइकल क्/2
पोस्ट-एक्सपोजर सेंकना 4 min @ 95 ° c 1 मिनट @ 65 ° c + 6 min @ 95 ° c 2 min @ 65 ° c + 7 min @ 95 ° c
विकास 2 मिनट 30 एस 5 min 6 min
हार्ड सेंकना (वैकल्पिक) 3-5 मिनट @ 200 ° c 3-5 मिनट @ 200 ° c 3-5 मिनट @ 200 ° c

तालिका 2: Photolithography चरणों में 10 माइक्रोन की ऊंचाई में एक केंद्रीय कक्ष युक्त डिवाइस बनाने के लिए प्रदर्शन किया । मध्यवर्ती मंडलों की ऊंचाइयां: 20, 50 और 90 µm ।

कदम मास्क 1:12 µm परत मास्क 2:32 µm परत मास्क 3:40 µm परत
एसयू-8 प्रकार 2015 2025 2050
Spincoating 30 एस @ 3250 आरपीएम 30 s @ 2500 आरपीएम 30 एस @ 3250 आरपीएम
शीतल सेंकना 3 मिनट @ 95 ° c 2 min @ 65 ° c + 5 min @ 95 ° c 3 मिनट @ 65 ° c + 7 min @ 95 ° c
एक्सपोज़र समय 140 माइकल क्/2 157 माइकल क्/2 170 माइकल क्/2
पोस्ट-एक्सपोजर सेंकना 4 min @ 95 ° c 1 min @ 65 ° c + 5 min @ 95 ° c 2 min @ 65 ° c + 7 min @ 95 ° c
विकास 3 min 5 min 6 min
हार्ड सेंकना (वैकल्पिक) 3-5 मिनट @ 200 ° c 3-5 मिनट @ 200 ° c 3-5 मिनट @ 200 ° c

तालिका 3: Photolithography कदम ऊंचाई में 3 माइक्रोन की एक केंद्रीय चैंबर युक्त एक डिवाइस बनाने के लिए प्रदर्शन किया । मध्यवर्ती मंडलों की ऊंचाइयां: 18, 50 और 90 µm ।

अनुपूरक डेटा 1: masks_neuron_volume_chips. tiff. PDMS उपकरण (डरिए मास्क और मास्क 1-3) गढ़े इस्तेमाल मुखौटे का योजनाबद्ध दृश्य । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक डेटा 2: फ़ाइल "masks_neuron_volume_chips. dxf" । इलेक्ट्रॉनिक डरिए मास्क और मास्क के लिए 1-3 बनाना अनुमति फ़ाइलें । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक डेटा 3: "Mask_Photoresist-stripes. dxf" । इलेक्ट्रॉनिक photoresist धारियों के photolithography के लिए इस्तेमाल किया मुखौटा निर्माण की अनुमति फ़ाइलें । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक डेटा 4: फ़ाइल conversion_mattotiff. m कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक डेटा 5: फ़ाइल importfilevol. m कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

न्यूरॉन्स की मात्रा इमेजिंग इन कोशिकाओं के लंबे और पतले एक्सटेंशन के कारण FXm तकनीक के लिए एक चुनौती का गठन किया. इस प्रोटोकॉल microfluidic डिवाइस ंयूरॉन इमेजिंग करने के लिए समर्पित की एक ही प्रकार के वेरिएंट का वर्णन ।

microfluidic डिजाइन के पहलुओं के अलावा, उद्देश्य के विकल्प प्रतिदीप्ति अपवर्जन इमेजिंग के लिए मौलिक है और एक व्यापार से तात्पर्य पार्श्व संकल्प और छवि स्पष्टता के बीच । यह 13 में दिखाया गया है कि एक उच्च ना फोकस की गहराई के लिए अग्रणी चैंबर ऊंचाई से छोटे मात्रा माप की परिशुद्धता के लिए हानिकारक नहीं था अगर इमेजिंग ध्यान में किया गया था और अगर एक पर्याप्त मार्जिन की वस्तु के समोच्च के बीच छोड़ दिया है मैं nterest और एकीकरण सतह की सीमाएं । हालांकि, एक चैंबर का उपयोग बहुत अधिक ध्यान की गहराई से छवि फोटॉन प्रसार है, जो ब्याज की वस्तुओं के किनारों चिकनी के कारण स्पष्टता बिगड़ जाती है । एक 3 µm उच्च चैंबर के निर्माण इस पार्श्व धुंधला कम और असाधारण अच्छी तरह से परिभाषित फ्लोरोसेंट अपवर्जन छवियां भी उच्च NA (0.8) 40X उद्देश्यों का उपयोग करने के लिए उच्च पार्श्व संकल्प के साथ ंयूरॉंस शाखाओं कल्पना प्रदान की ।

चिप कोडांतरण एक महत्वपूर्ण कदम है, विशेष रूप से 3 µm उच्च मंडलों के मामले में, लेकिन सावधान हेरफेर के रूप में 4.1.2 में वर्णित छत के पतन से बचा जाता है । मात्रा इन पतले कक्षों से जुड़े अनुपात को उच्च सतह भी समय के साथ Dextran एकाग्रता की स्थिरता का मुद्दा उठाया । हम जांच की है कि गर्मी की एक रात के बाद Dextran की सतह अवशोषण नगण्य था: पंजाबियों द्वारा Dextran की जगह के बाद, स्तंभ और पृष्ठभूमि के बीच तीव्रता का अंतर के बीच प्रारंभिक तीव्रता के प्रति 1000 के बारे में 1 था Dextran की उपस्थिति में ये दोनों क्षेत्र. ध्यान रखें कि न्यूरॉन्स दोनों नीचे coverslip पर और PDMS छत पर पालन कर सकते हैं. यह प्रभाव जब नमूनों coverslips का उपयोग कर गायब हो जाता है (यानी जब हम PDMS चैंबर के भीतर चिपकने वाला अणुओं की मशीन नहीं है), के रूप में कोटिंग इसलिए कड़ाई से चैंबर के तल पर स्थानीयकृत है ।

उनके चुनौतीपूर्ण आकृति विज्ञान के अलावा, न्यूरॉन्स बल्कि इस तथ्य के कारण FXm के लिए अनुकूल हैं कि विधि की प्रमुख सीमा में से एक, यानी dextran endocytosis, इन कोशिकाओं में बहुत सीमित है. लंबी रेंज (घंटों) में किसी भी दिखाई endocytosis घटना को दबाने के लिए हम 10 केडीए तैयारियों का चुनाव करते हैं.

अंत में, FXm की वैचारिक सादगी प्रयोगात्मक मुद्दों का एक सेट है जो वर्तमान प्रोटोकॉल, जैसे nanometric PDMS असभ्यता और micrometric चैंबर ऊंचाई, या पृष्ठभूमि सुधार के द्वारा हल किया गया है द्वारा संतुलित है की असमानता के लिए सही करने के लिए खंभों के बीच PDMS सीलिंग । हालांकि, एक करीबी microfluidic चैंबर के उपयोग के लिए फ्लोरोसेंट मध्यम सीमित समर्थन स्तंभों की जरूरत है, जो प्रभावी सेल आसंजन, या केंद्रीय से सोमा को बाहर करने की आवश्यकता के लिए उपलब्ध सतह को कम करती है की आवश्यकता की तरह कुछ विशिष्ट बाधाओं पैदावार चैंबर उच्चतम स्पष्टता है, जो उच्च संकल्प अवलोकन के लिए सुलभ सेल के क्षेत्रों को प्रतिबंधित के साथ न्यूरॉन एक्सटेंशन का निरीक्षण करने के लिए । इस विधि के एक संभव विकास के लिए इस शारीरिक परिशोधन से छुटकारा पाने के लिए, एक ऑप्टिकल एक से प्रतिस्थापित किया जाएगा । प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के नए विकास के संयुक्त हो सकता है भविष्य में FXm के साथ हितकर है ।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgments

लेखक ChiLab, सामग्री और माइक्रोसिस्टंस प्रयोगशाला-Politecnico di ट्यूरिन-दिशात, प्रो सी एफ Pirri, डॉ एम Cocuzza और डॉ एस एल Marasso के व्यक्ति में, प्रक्रिया के विकास और उपकरण निर्माण में उनके बहुमूल्य समर्थन के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । हम चर्चा और छवि प्रसंस्करण में समर्थन के लिए Quantacell से विक्टर रेसिन धंयवाद । हम चूहों के लिए उनके समर्थन के लिए, और पाब्लो वर्गास और एना मारिया लेनन (institut क्यूरी) GFP LifeAct चूहों के साथ प्रदान करने के लिए हम इसाबेल क्यूरी के पशु सुविधा से Grandjean और Manon Chartier के लिए आभारी हैं । हम institut Langevin और Clotilde Cadart से ओलिवर Thouvenin के लिए आभारी हैं, Larisa Venkova और Matthieu Piel से institut क्यूरी-UMR 144, प्रतिदीप्ति अपवर्जन विधि की समझ में उनकी मदद के लिए । अंत में, हम microfabrication में उनके समर्थन के लिए Institut पियरे-गाइल्स de Gennes (CNRS UMS 3750) के तकनीकी मंच का शुक्र है । इस काम के हिस्से में यूरोपीय अनुसंधान परिषद के उंनत अनुदान सं ३२११०७ "वायलनचेलो," पीएसएल विश्विद्यालय (SwithNeuroTrails परियोजना), ANR Investissement d'Avenir, और IPGG Labex और Equipex द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Plasmalab System 100 Oxford Instruments To perform DRIE
MJB4 mask aligner SUSS MicroTec SU-8 photolithography
NXQ 4006 Mask aligner Neutronix Quintel Photolithography associated to DRIE
Plasma cleaner Diener Electronic Pico PCCE
Cell culture hood ADS Laminaire Optimale 12
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Multifuge X1R
Incubator 37 °C 5% CO2 Panasonic MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator
Epifluorescence microscope Leica DMi8
PDMS Oven between 65 and 80 °C Memmert
Mechanical profilometer Veeco Dektak 6M Stylus Profiler
Optical profilometer Veeco Wyko NT9100
Vacuum desiccator Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) 230KAR Diameter 200 mm
Ultrasonic bath sonicator Labo Moderne SHE1000 Volume of the bath: 0.8 liter
Hotplate Stuart SD162 SD162
Masks
DRIE Supplementary data
Su8 Mask 1 Supplementary data
Su8 Mask 2 Supplementary data
Su8 Mask 3 Supplementary data
S1805 calibration stripes Supplementary data
Small laboratory equipment
1.5 mm hole puncher Sigma-Aldrich 29002519 (US reference)
Scalpel or razor blade
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon VWR International 82027-532 To demold PDMS
Top Lip Wafer Handling VWR International 63042-096
Curved tweezer FST Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel To manipulate glass coverslips
Substrates
Silicon wafer Prolog Semicor Ltd
24x24 mm glass coverslips VWR 631-0127
Photoresists and developpers
AZ 1518 positive photoresist Microchemicals GmbH Before DRIE process, thicknes 1.8 µm
AZ 351B developer Microchemicals GmbH To develop positive AZ 1518 photoresist
SU-8 2007 MicroChem
SU-8 2025 MicroChem
SU-8 2050 MicroChem
PGMA developer Technic To develop SU-8 negative photoresist
Microposit S1805 resist Chimie Tech Services Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures
MF 26A developer Chimie Tech Services To develop positive S1805 photoresist
Laboratory consumables
Disposable plastic pipette 3 mL LifeTechnologies - ThermoFisher
P100 Petri dishes TPP 93100
20 mL syringe Terumo SS+20ES1
Transparent scotch tape
Square wipes VWR 115-2148
Parafilm DUTSCHER 90260 Plastic paraffin film
Chemicals
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane abcr AB 109004
PDMS and curing agent Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761036
isopropanol W292907
poly-ornithine Sigma-Aldrich P4957 - 50 mL
Ethanol absolute Sigma-aldrich 02865 99.8%
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane Sigma-aldrich M6514-25ML (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3
acetic acid Sigma-aldrich 71251-5ML-F
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 LifeTechnologies - ThermoFisher D22910 Absoprtion at 488 nm
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 LifeTechnologies - ThermoFisher D22914 Absoprtion at 647 nm
Culture medium
MEM LifeTechnologies - ThermoFisher 21090-022
Horse Serum LifeTechnologies - ThermoFisher 26050088
B27 LifeTechnologies - ThermoFisher 12587-010
Glutamax 200 mM LifeTechnologies - ThermoFisher 35050-061
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM LifeTechnologies - ThermoFisher 11360-070
Gentamicin LifeTechnologies - ThermoFisher 15710-049
PBS Sigma-Aldrich D8537-500ML
HBSS 10x LifeTechnologies - ThermoFisher 14180-046
Hepes 1M LifeTechnologies - ThermoFisher 15630-056
trypsin-EDTA Sigma-Aldrich 59418C-100ML
Neurobasal LifeTechnologies - ThermoFisher 21103-049
Neurobasal without phenol red LifeTechnologies - ThermoFisher 12348-017
Softwares
Routine in Matlab for background normalization Quantacell Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com
ImageJ To select specific ROI for image analysis
Routine ImageJ Supplementary data
Routine Matlab Supplementary data

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 133 प्रतिदीप्ति अपवर्जन ंयूरॉन microfluidics वृद्धि कोन axon dendrites मात्रा
प्रतिदीप्ति बहिष्करण विधि और समर्पित Microfluidic उपकरणों के उपयोग द्वारा न्यूरॉन्स की उच्च संकल्प मात्रा इमेजिंग
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Braïni, C., Mottolese, A.,… More

Braïni, C., Mottolese, A., Ferrante, I., Monnier, S., Villard, C. High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (133), e56923, doi:10.3791/56923 (2018).

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