Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

패-리 신에서 랄 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 캐스케이드 반응

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/56926
Automatic Translation
1, 1, 1
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

Summary

카이 랄 아미노 알콜 건설 기계 유기 합성에 사용 하기 위해 다양 한 분자입니다. 패-리 신에서 시작, 우리 diastereoselective C H 산화 촉매 dioxygenase에 의해 해당 수 아미노산의 carboxylic 산 moiety의 분열에 의해 다음에 의해 결합 하는 효소 캐스케이드 반응에 의해 아미노 알콜을 합성 한 decarboxylase입니다.

Abstract

아미노 알콜은 다양 한 응용 프로그램으로 다양 한 화합물. 예를 들어, 그들은 유기 합성에서 랄 공중 발판으로 사용 되었습니다. 기존의 유기 화학에 의해 그들의 합성은 종종 stereochemical 결과의 어려운 제어와 지루한 여러 단계의 합성 과정을 필요합니다. 선물이 효소 synthetize 아미노 알콜 48 h에 쉽게 사용할 수 있는 L 리 진에서 시작 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 매우 전통적인 유기 합성 하 여 수행 하기 어려운 두 화학 반응 결합 합니다. 신의 unactivated C H 본드의 첫 번째 단계, regio-와 diastereoselective 산화에 사이드 체인 dioxygenase;에 의해 촉매는 두 번째 regio-와 diastereoselective regiodivergent dioxygenase에 의해 촉매 산화는 1, 2-diols의 형성으로 이어질 수 있습니다. 마지막 단계에서 carboxylic 그룹의 알파 아미노산은 pyridoxal 인산 염 (PLP) decarboxylase (DC)에 의해 죽 습. 이 decarboxylative 단계 베타/감마 위치에 대체 hydroxy stereogenic 센터 유지 아미노산의 알파 탄소를만 영향을 줍니다. 결과 아미노 알콜은 광학 농축 따라서. 프로토콜의 4 개의 아미노 알콜 semipreparative 규모 합성에 성공적으로 적용 되었습니다. 반응의 모니터링 실시 했다 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 derivatization 후 1-플 루 오로-2, 4-dinitrobenzene에 의해. 고체 상 추출 (SPE)에 의해 간단 정화 받으면 우수한 수익률 아미노 알콜 (93% > 95%).

Introduction

Biocatalysis 제공 하는 혜택에도 불구 하 고 합성 경로 또는 총 biocatalytic 노선 biocatalytic 단계의 통합 주로 효소 키네틱 해상도 제한 남아 있습니다. 이러한 노선 비대칭 화학 효소 합성의 첫 번째 단계로 널리 사용 되었습니다 하지만 높은 stereoselectivity,12,3 기능 그룹 interconversions에 더 많은 가능성을 제공 하는 biocatalysis . 또한, biocatalytic 반응 비슷한 조건에서 실시 하 고로 그것은 가능한 한 냄비 패션4,5에서 캐스케이드 반응을 수행 하 따라서.

카이 랄 아미노 알콜은 보조 또는 유기 합성6공중 발판으로 사용 하기 위해 다양 한 분자. 아미노 알콜 moiety 이차 대사 산물 및 활성 제약 성분 (API)에 자주 발견 된다. 기본 β-아미노 알콜 랄 γ-아미노 알콜에는 기존의 화학 합성, 하지만 액세스 하 여 해당 α 아미노 산에서 쉽게 사용할 수 또는 보조 아미노 알콜은 종종 민감한 함께 지루한 합성 경로 필요 입체 화학7,8,,910의 제어 합니다. 그것의 높은 stereoselectivity 때문에 biocatalysis이 카이 랄 빌딩 블록11,12,,1314우수한 합성 경로 제공할 수 있습니다.

우리는 이전 diastereoselective 효소 hydroxylation 철 (II)의 dioxygenases에 의해 촉매에 의해 합성의 모노-및 디-hydroxy-L-lysines를 보고 / α-ketoacid-종속 oxygenase 가족 (αKAO) (그림 1)15. 특히, KDO1 dioxygenase-hydroxy 파생 (4R) 하면서 (1)-(3S)의 형성을 catalyzes L-리 신에서 시작, 파생 (2) KDO2 dioxygenase 가진 반응에 의해 형성 된다. KDO1와 KDO2에 의해 연속 regiodivergent hydroxylations-dihydroxy-L (3R, 4R)의 형성으로 이어질-광학적으로 순수한 형태로 lysine (3). 그러나,이 효소의 제한 된 기판 범위 α-아미노 그룹의 위치에 carboxylic 산 moiety 활동16를 위해 근본적으로 간단한 아민의 hydroxylation에 특히 화학 합성에 큰 사용률을 방해 한다.

Figure 1
그림 1: L-리 신 Biocatalytic 변환. (3S)으로 변환-hydroxy-L-리 신 (1) KDO1 dioxygenase;에 의해 촉매 (4R)-hydroxy-L-리 신 (2) KDO2 dioxygenase;에 의해 촉매 그리고 (3R, 4R)-dihydroxy-L-리 신 (3) 캐스케이드 반응 KDO1 및 KDO2 dioxygenases에 의해 연속적으로 촉매에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Decarboxylation 신진 대사17에 일반적인 반응입니다. 특히, 아미노산 Dc (EC 4.1.1) 공동 인자 없는 (pyruvoyl) 또는 PLP 의존 효소 이며 박테리아와 더 높은 유기 체18,19 에 해당 polyamines로 아미노산의 decarboxylation 촉매 , 20 , 21 , 22. hydroxylated cadaverine, L-리 신의 decarboxylation에 의해 얻은 diamine에 해당 하는 모노-및 dihydroxy 화합물 (그림 3) 4-7, 10,-11 . Cadaverine 화학 산업에 대 한 주요 빌딩 블록, 특히 폴 리아 미드와 폴리우레탄 중합체의 구성 요소입니다. 따라서,이 diamine 재생 가능 자원에서의 바이오 기반 생산 석유 기반 경로 대신 관심을 모으고 있다 그리고 다양 한 미생물이이 목적을 위해 설계 되어 있다. 이러한 대사 경로에서 lysine DC (LDC) 주요 효소 이다. LDC는 알라닌 racemase (AR) 구조 가족23에 속하는 PLP 의존 효소 이다. PLP 의존 Dc (PLP-DCs) 높은 기판 특정 알려져 있습니다. 그러나 몇 가지 효소 예를 들면 Selenomonas rumirantium (LDCSrum)에서 LDC로 L ornithine 및 L-리 신 아미노산으로 활성화 되 고 약간의 성행위의 기능을 소유 하는, 유사한 운동 상수에 대 한가 lysine과 ornithine decarboxylation24,25. 이 확장된 기질 특이성은이 효소 decarboxylation의 모노-및 디-hydroxy-L-리 신에 대 한 좋은 후보. 또한, Dc 찾을 신의 수 파생 상품으로 활성, 우리 인코딩 αKAO 효소 유전자의 genomic 컨텍스트를 검사 합니다. 실제로, prokaryotic 유전자에서 인코딩 효소 같은 생 합성 경로에 관여 하는 유전자는 일반적으로 공동 지역화 유전자 클러스터에. 공동 유전자 인코딩 putative PLP-DC (그림 2)와 지역화 ( Chitinophaga pinensis)에서 KDO2 유전자 발견. 반면, DC에 대 한 인코딩 없이 유전자 발견 되었습니다 KDO1 dioxygenase의 게놈 컨텍스트를 분석할 때. C. pinensis (DCCpin)에서 PLP DC 단백질 따라서 캐스케이드 반응의 decarboxylation 단계를 촉매를 유망한 후보자로 선정 되었다.

Figure 2
그림 2: C. pinensis에 KDO2 유전자의 Genomic 맥락. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

따라서, 우리는 dioxygenases 및 아미노산 (그림 3)에서 지방 족 랄 β-및 γ-아미노 알콜의 합성을 달성 하기 위해 Dc 효소 캐스케이드 반응 설계. 이전 보고는 αKAO에 의해 촉매 C H 산화 총 diastereoselectivity;와 hydroxy 대체 stereogenic 센터 소개 Cβ/γ 카이랄성 아미노산 moiety16의 Cα 탄소에만 영향을 줍니다 decarboxylative 단계에서 유지 됩니다.

Figure 3
그림 3: Retrosynthetic 분석. (R5) (4) β-및 γ-아미노 알콜 (R)-1, 5-diaminopentan-2-ol의 (A) Retrosynthesis-hydroxy-L-라이 신, 그리고 (S)-1, 5-diaminopentan-2-ol (5) 및 1, 5-diaminopentan-3-ol (6)에서 패-리 신입니다. (B) Retrosynthesis의 β, γ-β, δ-아미노 diols (2S, 3S)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (10) 및 (R,S4 2)-1, 5-diaminopentane-2, 4-diol (11) 5 (R)에서 시작- hydroxy-L-라이 신, 및 (R,R3 2)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (7) L-리 신에서 시작. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

패-리 신 (5R)에서 시작-hydroxy 파생, 우리 여기는 2/3 단계, 한 냄비, dioxygenases와 PLP-Dc를 대상 아미노 알콜 효소 절차 보고. 사전 종합 대상 분자의 실험실 규모에서 메서드는 반응 조건, 예를 들면, 원자재;의 전체 변환 수 있도록 하는 데 필요한 효소 농도 조정 분석 규모에서 개발 되었다 우리는 또한이 절차를 제시.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 효소 준비

  1. 표현 하 고 앞에서 설명한26으로 단백질 정화.
    참고: 재조합 단백질 다음 최종 농도와 가져온: αKAO에서 Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1.35 mg/mL; C. pinensis, UniProtKB ID에서에서 αKAO: C7PLM6 (KDO2), 2.29 mg/mL; PLP-Dc에서 S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), 셀 무료 12.44 mg/mL;에서 총 효소 추출 PLP-DC에서 C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCCpin), 2.62 mg/mL.

2입니다. 솔루션의 준비

참고: 아래의 모든 솔루션 이온된 수에 준비가 되어 있습니다.

  1. HEPES 버퍼, pH 7.5;의 1 M를 준비 5 m NaOH의 조정.
    참고: pH 조정 단계 동안 얼굴 보호 (P280), 눈 보호, 보호복, 보호 장갑 착용. 눈 (P338 P305, P351,)와 접촉, 여러 분 제거 콘택트 렌즈 가능 하면 물으로 조심 스럽게 씻어. 세 정을 계속 하 고 즉시 독극물 센터나 의사 (P310) 전화. P 코드 예방 문 참조 (위험 클래스 및 카테고리; 참조, 예를 들어, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
  2. 100 m m L-리 신, 100 mM (5S) 준비-hydroxy-L-리 신, 150 m m α-ketoglutaric 산, 100mm 나트륨 하는데, 10mm 암모늄 iron(II) 황산 염 hexahydrate (모어 소금), 100mm pyridoxal 5-인산 염 (PLP), 및 100 m m dithiothreitol (DTT).
  3. 1 M, 2 M, 그리고 37 %HCl 솔루션 (approximatively 12 M 솔루션), 염 산 (HCl)의 6 분 2.1에 설명 된 대로 동일한 안전 지침에 따라 준비 합니다.
    참고: α-ketoglutaric 산, 나트륨 하는데, 및 암모늄 iron(II) 황산 염 hexahydrate의 솔루션 이루어져야 합니다 신선한 사용 당일. 실 온에서 몇 달 동안 리 솔루션을 저장할 수 있습니다. PLP 솔루션 4 ° c.에 한 달 동안 저장 될 수 있다 DTT 솔루션-20 ° c.에 한 달 동안 저장 될 수 있다

3. 분석 규모 반응

  1. 5 (R)의 decarboxylation 반응에 대 한 방법 개발-hydroxy-L-리 신
    1. 11 µ L HEPES 버퍼 pH 7.5의 1 M 솔루션의 추가 (최종 농도 50 m m) 2 mL microtube 하. 다음, 100 mM (5S)의 22 µ L을 추가-hydroxy-L-리 신 (최종 농도 10 m m), 2.2 100mm PLP의 µ L (최종 농도 1 m m), 및 2.2 µ L 100 mM DTT의 (최종 농도 1 m m).
      참고: 경우 LDCSrum와 반응, DTT의 추가 필요 하지 않습니다.
    2. 순화 PLP DC를 추가 (최종 농도 0.1 mg/mL). H2O 220 µ L의 최종 볼륨에 대 한 완전 한.
    3. 3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
      참고: 반응 매체의 좋은 산소를 하면 야외에서 열린 뚜껑으로 반응 혼합물을 떨고. 따라서 반응 미디어에 산소 거품 필요가 있다.
    4. 6 단계에 설명 된 반응 모니터링 절차에 따라 분석 반응 혼합물의 10 µ L를 수집 합니다. 샘플은 가급적 derivatized 및 샘플링 후 직접 분석.
  2. 결합 한 hydroxylation 단계 PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation와 αKAO에 의해 촉매 작용을 미치는 효소 캐스케이드 반응 위한 방법 개발
    1. 11 µ L HEPES 버퍼 pH 7.5의 1 M의 추가 (최종 농도 50 m m) 2 mL microtube 하. 다음, α-ketoglutaric 산의 150 m m의 22 µ L을 추가 (최종 농도 15 m m), 5.5 µ L의 나트륨 하는데 100 m m의 (최종 농도 2.5 m m), 22 모어의 10 m m의 µ L의 소금 (최종 농도 1 m m), 그리고 L-리 신의 100 m m의 22 µ L (최종 농도 10 m m).
    2. H2O 단계 3.2.3에서에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려해 220 µ L의 최종 볼륨에 대 한 완전 한.
    3. 대상된 regioselectivity에 따라 필요한 정화 αKAO 효소 추가: 위치 C-4 L-리 신에 대 한 위치 C-3 또는 KDO2에에서 hydroxylation에 대 한 KDO1. 정제 효소의 최종 농도 (0.05-0.5 mg/mL) 3 h approximatively에 완전 한 변환 수 있도록 결정 했다.
    4. 3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    5. 2.2 µ L PLP의 100 mM의 추가 (최종 농도 ~ 1 m m) 및 DTT의 100 mM의 2.2 µ L (최종 농도 ~ 1 m m).
      참고: 경우 LDCSrum와 반응, DTT의 추가 필요 하지 않습니다.
    6. 18 h LDC: 완전 한 변환 사용 농도에 순화 된 PLP DC를 추가Srum 0.1 mg/ml KDO1, 및 DCCpin 0.5 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서 캐스케이드 반응에 대 한 대략적인 최종 농도 KDO2와 캐스케이드 반응입니다.
    7. 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    8. 3.1.4 단계와 모니터링 절차를 실행 합니다.
  3. PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation와 αKAOs에 의해 촉매 두 hydroxylation 단계를 결합 하 여 효소 캐스케이드 반응 위한 방법 개발
    1. 단계 3.2.1-3.2.2를 실행 합니다.
    2. 0.05 mg/mL의 최종 농도에 KDO1를 추가 합니다. 3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    3. 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에 KDO2를 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    4. 3.2.5 단계를 실행 합니다.
    5. 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에서 순화 PLP DC DCCpin 을 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    6. 3.1.4 단계와 모니터링 절차를 실행 합니다.

4. 반 대리점 한 냄비 Biocatalytic 반응

참고: 효소 반응 노천 250 mL 유리 10 ml 전체 볼륨에 대 한 삼각 플라스 크에에서 0.1 mmol의 L-리 신에 수행 됩니다.

  1. Monohydroxylated 유도체의 합성
    1. 1 M HEPES 버퍼, pH 7.5의 0.5 mL을 추가 (최종 농도 50 m m) 플라스 크에. 다음, 100 m L-리 신 m 1 개 mL를 추가 (최종 농도 10 m m), 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m), 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도 1 m m).
    2. H2O 10 mL, 4.1.3 단계에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려의 마지막 볼륨에 대 한 완전 한.
    3. 대상된 regioselectivity에 따라 필요한 정화 αKAO 효소 추가: 0.075 m g/l L-리 신의 위치 C-4 0.5 mg/mL의 최종 농도에서 C-3 또는 KDO2 위치에 hydroxylation의 최종 농도에 KDO1. 정제 효소의 최종 농도 3 h approximatively에 완전 한 변환 수 있도록 결정 했다.
    4. 적절 한 기간 동안 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어. 때 완료 된 hydroxylation 반응 (반응 프로토콜 모니터링에 대 한 6 단계에 자세히 설명 하는 모든 단계를 실행 하는)를 나타냅니다 반응 모니터링, 4.1.5 단계로 진행 합니다. 전형적인 반응 시간은 3 h 이다.
    5. ΑKAO 반응 혼합물에 100mm PLP의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m). 그런 다음, 100 mM DTT의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m), LDCSrum사용 하는 경우를 제외 하 고.
    6. 순화 PLP-DC 추가: LDCSrum KDO1 또는 KDO2와 캐스케이드 반응에 대 한 0.5 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서 DCCpin 캐스케이드 반응에 대 한 0.05 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서.
    7. 실내 온도에, 18 h 300 rpm, 반응 혼합물을 흔들어 고 직접 단계 4.3에에서 대 한 자세한 단계를 계속 합니다.
  2. Dihydroxylated 유도체의 합성
    1. 1 M HEPES 버퍼, pH 7.5의 0.5 mL을 추가 (최종 농도 50 m m), 100 m L-리 신 m의 1 mL (최종 농도 10 m m), 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m) 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도가 1 m m). H2O 10 mL, 4.2.2 단계에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려의 마지막 볼륨에 대 한 완전 한.
    2. 0.075 mg/mL의 최종 농도에 KDO1를 추가 합니다. 적절 한 기간 동안 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    3. 때 완료 된 hydroxylation 반응 나타냅니다 반응 모니터링 (프로토콜을 모니터링 하는 반응에 대 한 6 단계 참조), 4.2.5 단계로 진행. 전형적인 반응 시간은 3 h 이다.
    4. 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL를 추가 (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m), 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도 1 m m).
    5. 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에 KDO2를 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    6. 때 완료 된 dihydroxylation 반응 나타냅니다 반응 모니터링 (프로토콜을 모니터링 하는 반응에 대 한 6 단계 참조), 4.2.7 단계로 진행. 전형적인 반응 시간은 18 h 이다.
    7. DTT의 100 m m의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m), LDCSrum사용 하는 경우를 제외 하 고.
    8. 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에서 순화 된 DCCpin 을 추가 합니다.
    9. 18 h 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
  3. 냉각
    1. 얼음 목욕에서 250 mL 유리 삼각 플라스 크를 배치 하 여 반응 혼합물을 식혀.
    2. 신중 하 게, approximatively 1 분, 0.25 mL 6 M HCl 수동으로 부드럽게 흔들어 냉각된 반응 혼합물의 이상 추가 합니다. 2.1 단계에서 설명한 대로 동일한 안전 지침을 따르십시오.
    3. 50 mL 원뿔 바닥 원심 분리기로 산 성 혼합물 튜브 전구, 파스퇴르 피 펫 장비는 유리를 사용 하 여 전송 다음 1680 x g와 15 분 동안 4 ° C에서 원심.
    4. 철회는 상쾌한 고 250 mL 둥근 바닥 플라스 크에 옆으로 계속.
    5. 펠 릿을 포함 하는 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브에 이온을 제거 된 물 10 mL를 추가 합니다. 다시는 펠 릿을 일시 중단 하는 소용돌이.
    6. 1680 x g에서 원심 분리기, 4 ° C, 15 분.
    7. 철회는 상쾌한 고 첫 번째 상쾌한 (4.3.4 단계)를 포함 하 250 mL 둥근 바닥 플라스 크에 추가 합니다.
    8. 소용돌이, 지속적인 손으로 수집된 supernatants 액체 질소에는 플라스 크의 침수로 고정 하 고 벤치탑 매니폴드 녹고에서 물자를 방지 하기 위해 동결 건조 기에 플라스 크를 즉시 전송.
    9. 완료 된 후 동결 과정 (야간), 동결 건조 기에서 플라스 크를 제거 합니다.

5. 정화 조 효소 반응 혼합물에서 아미노 알콜의

  1. 이온 교환 수 지
    1. 수성 0.1 m HCl (approximatively 4 mL)의 최소 금액에 동결된 제품을 용 해 고체 입자는 더 이상 벌 거 벗은 눈을 볼 수 때까지.
    2. 방출 대기압에서 1 M HCl (4 열 볼륨) 0.1 뒤 여는 술 폰 산 기능 그룹 양이온 교환 수 지, 유리 열 (20 x 250 m m)에 200-400 메쉬 조건 M HCl (4 열 볼륨; 열 볼륨 10 mL =).
    3. 신중 하 게 사용 하 여 1000 µ L micropipette 유리 열 벽에 수 지의 상단에 샘플을 로드 합니다. 다음, 린스 조 제품을 포함 하는 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브 세 번 1 mL 0.1 M HCl 용액 당의 세척와 같은 방법으로 열에 결과 린스 볼륨을 로드.
    4. 비-선형으로 elute 그라데이션: 4 열 양의 0.1 M HCl, 4 열 양의 물, 4 열 양의 5% NH4오, 4 열 양의 10% NH4오, 4 열 양의 15% NH4오, 4 열 양의 20% NH4오 4 열 양의 25% NH4오 및 마지막으로 4 열 28% NH4오의.
    5. HPLC에 의해 정화 모니터링 (6 단계 참조).
    6. 수영장 분수 화합물 (NH4오 20-28%)를 포함 하 고 단계 4.3.8-4.3.9에 설명 된 대로 freeze-dry.
      참고: 이온 교환 열 이온 물 차입 물 (approximatively 50 mL) 1 m HCl의 50 mL와 함께 방출 하 여 가공 뒤의 중립화로 차입 후 다시 수 있습니다.
  2. SPE
    1. H3포4/water (20 µ L/mL)의 2 ml approximatively 동결된 화합물 solubilize
    2. 장소는 혼합된 모드 양이온 교환 SPE 6 mL-카트리지 추출 매니폴드에 물 펌프에 연결. 매니폴드에서 제공 하는 감압에서 메탄올의 조건 4 mL를 통해 여 카트리지. H3의 4 mL를 통해 포4/water (20 µ L/mL) 여 카트리지를 equilibrate.
    3. 유리 열 벽에 수 지의 상단에 1000 µ L micropipette를 사용 하 여 카트리지에 샘플을 로드 하 고 세 번 세척 당 H3포4/water (20 µ L/mL)의 0.75 mL와 함께 제품을 포함 하는 유리병을 씻어. 같은 방법으로 열에 결과 린스 볼륨을 로드 합니다.
    4. 매니폴드, 2%의 4 mL를 제공한 감소 압력 방출 하 여 카트리지를 씻어 HCOOH 물, 그리고 물 4 mL와 함께. NH4물에서 오의 그라데이션으로 elute (4% NH4오에서에서 시작 각 차입에 대 한 4 mL: 10%, 15%, 15%, 20%, 및 28%).
    5. 6 단계에 설명 된 프로토콜을 모니터링 하는 반응에 따라 각 분수를 분석 하 여 HPLC에 의해 정화를 모니터링 합니다. 자외선 (UV) 크로마에 따르면 순수 원하는 파생 상품을 포함 하는 모든 분수를 유지 하 고 5.2.6 단계로 진행.
    6. 수영장 원하는 포함 된 분수 100 mL 둥근 바닥 플라스 크에 복합, 물으로 분수를 포함 하는 튜브를 헹 구 고 린스 볼륨 100 mL을 추가 둥근 바닥 플라스 크.
    7. 40 ° C에서 온도 물 목욕 주전자를 장착 하 고 10 mbar에서 진공 펌프에 연결 된 회전 증발 기를 사용 하 여 감소 압력에서 용 매를 제거 합니다.
    8. 물의 최소 볼륨에서 솔리드를 solubilize 고 무게 25 mL 둥근 바닥 플라스 크에 솔루션을 전송. 린스 물 최소 볼륨으로 플라스 크 25 mL 플라스 크에 린스 볼륨을 추가 하 고 5.2.9 단계로 진행.
    9. 정화 제품 무게 하 고 수익률을 계산 합니다.
    10. 고체 입자는 더 이상 벌 거 벗은 눈을 볼 수 때까지 2 m HCl의 최소 볼륨에서 정화 제품을 녹이 고 단계 4.3.8-4.3.9에 설명 된 대로 freeze-dry.
      참고: 아미노 알콜 민감한 화합물 및 그들의 염 산 염 소금으로 유지 됩니다.

6. 반응 모니터링 및 제품 분석

  1. 기판 및 HPLC 분석에 앞서 제품의 derivatization
    참고: 기판 및 제품 증가 그들의 UV 컬럼에 detectivity 방향족 유도체로 derivatized를 해야 합니다. 1-플 루 오로-2, 4-dinitrobenzene (DNFB) 사용 했습니다. 각 샘플은 derivatization 직후는 HPLC에 주입 했다.
    1. 효소 반응 및 전송의 10 µ L 1.5 mL microtube 가져가 라. 에탄올에 0.25 m NaHCO3 수성 해결책의 10 µ L, 에탄올, 100 µ L 및 DNFB 솔루션의 2.5 mg/mL의 30 µ L를 추가 합니다.
    2. microtube 닫고 1000 rpm에서 65 ° C에서 1 시간에 대 한 결과 솔루션을 흔들어. 10 µ L로 끄다 1 M HCl의.
    3. 0.22 μ m 기 공 크기 친수성 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막 1 mL 루어 주사기를 사용 하 여 4 m m 직경 비 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링.
  2. Derivatized 아미노산 분리의 모든 시스템을 사용 하 여 dioxygenase 반응의 모니터링을 수행 합니다. 이 프로토콜 dinitrobenzene (DNB) 발 색 단 그룹27여 derivatized 아미노산의 자외선 탐지를 포함 한다.
    1. 유통 silyl endcapping 반전된 단계 열 (5 µ m, 3 x 150 m m)와 C18와 HPLC를 맞습니다.
    2. (과) eluent B C18 열 equilibrate (MeCN + 0.1 %TFA) eluent A (H2O + 0.1 %TFA) (approximatively 20 열 볼륨에 해당) 15 분 동안 35 ° C의 1 mL/min 흐름 속도로.
    3. 10 µ L derivatized 반응 혼합물의 주입 (단계 6.1 참조) HPLC C18 열에. MeCN, 0.1 %TFA / H2O와 0.1%의 혼합물을 사용 하 여 선형 그라데이션으로 eluent로 TFA (9 분, 온도 35 ° C에에서과 하 비과 흐름 1 mL/min).
    4. UV 탐지 400 설정을 사용 하 여 크로마 열에 eluted 제품 분석 nm. DNB lysine은 일반적으로 약 6.5 분, hydroxylated DNB-신 약 5.5 분, DNB-신 약 4.2 분, dihydroxylated 및 DNB-aminodiol 약 5.3 분을 elutes.

7. NMR 분석의 정화 아미노 알콜

  1. D2O 정화 아미노 알콜 분해 (700 µ L) 핵 자기 공명 (NMR) 튜브를 솔루션을 전송.
  2. 1H 및 13C NMR 스펙트럼에 따라 적절 한 NMR 시설 프로토콜28습득.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

우리가 이전에 보고 된 합성의 모노-및 디-hydroxy-L-lysines diastereoselective 효소 hydroxylation 철 (II)의 dioxygenases에 의해 촉매에 의해 / αKAO 가족 (그림 1)16. PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation 단계 뒤는 αKAO에 의해 촉매는 하나 또는 두 개의 hydroxylation 단계를 결합 하는 여기, 전체 폭포의 프로토콜 최적화 반응 조건 모두의 요구 사항을 충족 조정 되었다 효소 반응입니다. 우리는 두 개의 Dc, LDCSrum 및 DCCpin, 상용 (5R)으로 활동을 조사 하 여 시작-hydroxy-L-리 신. 다음 우리는 적절 한 αKAO에 의해 촉매 산화 단계 캐스케이드에서 모노 파생 상품, 3-hydroxy-L-라이 신 (1) 및 4-hydroxy-L-라이 신 (2) 쪽으로 DC 활동 분석. 표 1 은 모노-hydroxy-L-lysines의 biocatalytic decarboxylations의 결과 제공합니다. 변환 후 해당 DNB 주고 DNFB로 반응 혼합물의 derivatization derivatized 기판 및 제품 HPLC에 의해 측정 되었다.

항목 기판 PLP-DC 제품 변환
1 (5R)-hydroxy-L-리 신 LDCSrumb) 4 100%
2 (5R)-hydroxy-L-리 신 DCCpinb) 4 노스다코타
3 1 는) LDCSrumb) 5 100%
4 1 는) DCCpinb) 5 29%
5 2 는) LDCSrumc) 6 60%
6 2 는) DCCpinc) 6 100%

표 1: monohydroxy-L-lysines의 Biocatalytic decarboxylation. 반응 조건: 기판 (10 m m), PLP-DC (0.1 0.15 mg mL-1), HEPES (50mm, pH 7.5), 버퍼 PLP (1mm), DTT (1 mM; 하지 사용 LDCSrum), 하룻밤, RT, 300 rpm. (a) 합성 효소 에 해 라. (b) 0.1 mg/mL. (c) 0.15 mg/mL; 노스다코타: 인식 되지 않음

S. rumirantium (LDCSrum)에서 DC 최고의 변환의 3-및 5-파생 상품 해당 랄 hydroxy 디 (항목 1, 3, 및 5)에 모든 모노 hydroxy lysines로 활동 전시. 예상 했던 대로, DCCpin, αKAO 게놈 컨텍스트 DC 판명 (4R)의 decarboxylation에 대 한 가장 적합 한-hydroxy-L-라이 신 (2) (6 항목). 표준 반응에서 조건 (3S)의 변환-hydroxy-L-decarboxylated 대응 (5) DCCpin 와 리 (1) 낮은 (4 항목), 그리고 아무 활동 했다 (5R)으로 관찰 되었다- hydroxy-L-리 신 (항목 2).

마지막으로, 우리 디-hydroxy-L-리 신 파생 상품 3, 8, 및 9는 두 개의 Dc의 활동, KDO1, KDO2, 또는 2의 조합에 의해 촉매는 하나 또는 두 개의 hydroxylation 단계에 의해 원래의에 합성 (그림 2).는 디-hydroxy-L-lysines의 biocatalytic decarboxylation의 결과 표 2에 요약 되어 있습니다.

항목 기판 PLP-DC 제품 변환
1 3 LDCSrumb) 7 노스다코타
2 3 DCCpinb) 7 100%
3 8 는) LDCSrumb) 10 19%
4 8 는) DCCpinb) 10 12%
5 9 는) LDCSrumc) 11 노스다코타
6 9 는) DCCpinc) 11 노스다코타

표 2: dihydroxy-L-lysines의 Biocatalytic decarboxylation. 반응 조건: 기판 (10 m m), PLP-DC (0.1 0.15 mg/mL), HEPES (50mm, pH 7.5), 버퍼 PLP (1mm), DTT (1 mM; 하지 사용 LDCSrum), 하룻밤, RT, 300 rpm. (a) 합성 효소 에 해 라. (b) 0.1 mg/mL. (c) 0.15 mg/mL; 노스다코타: 인식 되지 않음.

Dihydroxy-L-lysines 3, 8및 9의 decarboxylation에 관한 결과 완전히 만족 되지 않았습니다. 표준 반응 조건에서만 (3R, 4R)-dihydroxy-L-리 (3) 양적 해당 dihydroxy diamine 7 로 개조 되었다 (항목 1-2). 4, 5-dihydroxy 패-리 신 (8)의 변환 이었다 보통 (항목 3-4) 하지만 그것은 크게 효소 로드 증가 의해 향상 될 수 지적 가치. 두 개의 테스트 PLP-Dc의 3, 5-dihydroxy 패-리 신 (9) (항목 5-6)으로 활성 발견 됐다.

HPLC를 모니터링 하 여 결정으로 양적 변환 전시 효소 폭포 반응 (그림 4) 수평 성공적으로.

Figure 4
그림 4: 3 단계 효소 폭포에 대 한 대표적인 분석 데이터. (A) HPLC 모니터링 biocatalytic L-리 신으로 변환 (R,R3 2)-1, 5-diaminopentan-2, 3-diol (7). RT = 보존 시간. (B) 1H NMR 및 (C) 13C NMR의 정화 후 아미노 알코올 (7). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

여기에 소개 하는 정화 프로토콜 복잡 한 효소 반응 혼합물에서 아미노 알콜의 효율적인 추출 수 있습니다. 아미노 알콜 4, 5, 6및 7 우수한 수익률 (그림 5)에서 얻은 했다.

Figure 5
그림 5: 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 폭포. 합성 (R)-1, 5-diaminopentan-2-ol (4), (S)-1, 5-diaminopentan-2-ol (5), 1, 5-diaminopentan-3-ol (6), 및 (R,R3 2)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (7). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

카이 랄 아미노 알콜 및 파생 상품 유기 합성 제약 치료에 대 한 카이 랄 조력자에서 응용 프로그램의 넓은 범위가 있다. 아미노 알콜 기존의 유기 합성에 의해 생산을 위한 다단계 합성 수많은, 하지만 않을 수 있습니다 항상 효율적인 입체 화학16의 민감한 컨트롤과 함께 지루한 보호/deprotection 단계. Biocatalytic 접근 보호/deprotection 단계 dispenses 이며 일반적으로 매우 stereoselective 좋은 대안을 나타냅니다.

이전 작업 동적 운동 비대칭 변환 (DYKAT)에 의해 2-phenylethan-1-아민의 백본와 다양 한 β-아미노 알콜의 합성을 보고. 이 경로에서 hydroxy 대체 stereogenic 센터 aldolisation benzaldehyde와 파생 상품, 트레오닌 aldolase에 의해 촉매에 의해 소개 되었다. 낮은 diastereoselectivity 및 적당 한 수익률이 첫 번째 단계는 후속 stereospecific decarboxylation enantioenriched 아로마 β-아미노 알콜11,12로 이어지는 L-티로신 DC에서 촉매에 의해 극복 되었다.

우리 보고 여기 쉽게 사용할 수 있는 L-리 신에서 시작 하는 다양 한 아미노 알콜의 합성에 대 한 간단한 프로토콜. 매우 효율적 이지만이 프로토콜 단점 때문에 αKAO와 PLP DC 효소의 범위를 제한 된 기판에서에서 겪고 있다. 그럼에도 불구 하 고, 다양 한 아미노 알콜의 biocatalytic 합성 다른 αKAO 및 아미노산 Dc29,30,,3132의 다른 조합을 사용 하 여 여겨질 수 있다. 그것은 2 단계 순서는 PLP Dc L-리 신으로 활성도 폭포에서 중요 한 지적 가치가 있다. 모든 L-리는 PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation 반응을 실행 하기 전에 첫 번째 산화 단계에서 소비 되도록 주의 해야 합니다. 이 후 발 색 단 에이전트에 의해 반응 미디어의 derivatization HPLC에 의해 반응의 주의 깊은 모니터링을 통해 보장 됩니다. 효소의 높은 기질 농도 낮은 내성을 추가 개발에 대 한 제한 사항입니다. 효소 진화 전략,이 문제를 해결 하기 위해 효소 속성의 기질 농도 허용치33등을 최적화 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 효소 동원 정지 수 효소의 재사용을 보장 하기 위해 간주 됩니다.

이 프로토콜은, 수행 하기 쉬운 그리고 가장 매력적인 기능 중 하나는 정화 단계의 효율성. 우리의 이전 작품에서 복잡 한 효소 반응 혼합물에서 극 지 분자의 직접 추출 문제가 되었고 소수 그룹에 의해 화합물의 derivatization는 필요한16. 아미노 알콜 직접 정화 derivatization 없이 반응에서 광범위 한 작업이 필요합니다. 이 프로토콜에서 고체 상 추출 및 이온 교환 수 지를 결합 하는 2 단계 정화 절차 글리세롤 (효소 솔루션에 포함 된)를 제거 하 고 HEPES, 버퍼의 그들에 가까운 물리 화학 특성을 가진 2 개의 극 지 분자는 아미노 알콜을 대상으로 어렵고 따라서 이들이 혼합물에서 분리. 이 정화 프로토콜 효소 반응에서 그와 같은 복잡 한 반응 혼합물에서 다양 한 극 지 분자의 추출에 대 한 적용할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 유익한 토론에 대 한 베로 니 크 드 Berardinis와 알랭 Perret, 크리스틴 Pellé, 및 기술 지원에 대 한 페 기 Sirvain 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma Aldrich H3375
L-lysine hydrochloride Sigma Aldrich L5626
(5S)-hydroxy-L-lysine Sigma Aldrich GPS NONH Out sourcing
α-ketoglutaric acid Sigma Aldrich 75892
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate Acros 201370250
Pyridoxal phosphate (PLP) Sigma Aldrich 82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) Sigma Aldrich D0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) Sigma Aldrich D1529
Ethanol VWR 20825.290
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 71631
HCl 37% Sigma Aldrich 435570
HCl 0.1M Fluka 35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acid VWR 153112E
Ammonia 28% VWR 21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83638.32
Formic acid Acros 270480010
Phosphoric acid 85% Acros 201145000
Deuterium oxide Acros 320,710,075
NaOH Sigma Aldrich S5881
C18 HPLC column Phenomenex 00F-4601-Y0
Accela UHPLC System ThermoFisher Scientific
Accela PDA detector ThermoFisher Scientific
4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF Merck SLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip VWR HSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 mesh Sigma Aldrich 217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL Waters 186000776
Extraction manifold Waters WAT200609
Rotary evaporator Büchi 531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus Christ L083302
Micropipette 20 µL Eppendorf 3121000031
Micropipette 100 µL Eppendorf 3121000074
Micropipette 500 µL Eppendorf 3121000112
Micropipette 1000 µL Eppendorf 3121000120
300 MHz spectrometer Bruker
2 mL microtube CLEARLine CL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tube Fischer Scientific 05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23 Fischer Scientific 10353331
100 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL erlenmeyer flask Fischerbrand 15496143

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
  2. Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  3. Turner, N. J., O'Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
  4. Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
  5. Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
  6. Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
  7. Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
  8. McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
  9. Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
  10. Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
  11. Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
  12. Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
  13. Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
  14. Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114 (0), 65-71 (2015).
  15. Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
  16. Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
  17. Suzuki, H., Kurihara, S. Ch. 4. Polyamines. Kusano, T., Suzuki, H. 4, Springer Japan. 47-59 (2015).
  18. Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
  19. Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
  20. Qian, Z. -G., Xia, X. -X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
  21. Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
  22. Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
  23. Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
  24. Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
  25. Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
  26. Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
  27. Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
  28. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017).
  29. Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
  30. Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
  31. Kourist, R., Guterl, J. -K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
  32. Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
  33. Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).

Tags

화학 문제점 132 랄 아미노 알콜 계단식 반응 효소 dioxygenases decarboxylases biocatalysis
패-리 신에서 랄 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 캐스케이드 반응
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fossey-Jouenne, A.,… More

Fossey-Jouenne, A., Vergne-Vaxelaire, C., Zaparucha, A. Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine. J. Vis. Exp. (132), e56926, doi:10.3791/56926 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter