Summary
الكحوليات الأمينية مراوان جزيئات تنوعاً للاستخدام السقالات في التوليف العضوي. بدءاً من L-يسين، نحن توليف الكحوليات الأمينية بفعل تتالي الانزيمية الجمع بين أكسدة دياستيريوسيليكتيفي ح ج تحفزها ديوكسيجيناسي متبوعاً بانشقاق مجموعة حمض الكربوكسيلية الأحماض الأمينية هيدروكسيل المقابلة من ديكاربوكسيلاسي.
Abstract
الكحوليات الأمينية مركبات تنوعاً مع طائفة واسعة من التطبيقات. على سبيل المثال، فقد استخدمت مراوان السقالات في التوليف العضوي. على توليف بالكيمياء العضوية التقليدية وغالباً ما يتطلب عمليات التوليف متعددة خطوة شاقة، مع صعوبة السيطرة على نتائج الخبراء. نقدم بروتوكول انزيماتيكالي سينثيتيزي الكحوليات الأمينية بدءاً من L-يسين متاحة بسهولة في 48 ساعة. هذا البروتوكول ويجمع بين اثنين من التفاعلات الكيميائية التي يصعب جداً القيام بتجميع العضوية التقليدية. في أول خطوة ريدجو-ودياستيريوسيليكتيفي أكسدة السندات ح ج اونكتيفتد ليسين هو الجانب-سلسلة تحفزها ديوكسيجيناسي؛ أكسدة ريدجو ودياستيريوسيليكتيفي ثانية تحفزها ديوكسيجيناسي ريجيوديفيرجينت يمكن أن يؤدي إلى تشكيل 1، 2-ديولس. في الخطوة الأخيرة، هو المشقوق كاربوكسيليك مجموعة الحمض الأميني ألفا من ديكاربوكسيلاسي pyridoxal-فوسفات (حزب العمال التقدمي) (DC). هذه الخطوة ديكاربوكسيلاتيفي يؤثر فقط على الكربون ألفا من الأحماض الأمينية، الاحتفاظ بمركز ستيريوجينيك هيدروكسي استبداله في وضع بيتا/غاما. ولذلك يتم إثراء الكحوليات الأمينية الناتجة بصريا. البروتوكول تم تطبيقها بنجاح على توليف سيميبريباراتيفي-مقياس للكحوليات الأمينية الأربعة. رصد ردود الفعل التي أجرى بها كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) بعد derivatization 1-مخفضات-2، 4-دينيتروبينزيني. تنقية مباشرة باستخراج المرحلة الصلبة (SPE) أتاحت الكحوليات الأمينية مع المحاصيل ممتازة (93 في المائة إلى > 95%).
Introduction
على الرغم من المزايا التي تتيحها بيوكاتاليسيس، تكامل الخطوات بيوكاتاليتيك في المسارات الاصطناعية أو مجموع طرق بيوكاتاليتيك يظل معظمها يقتصر على القرارات الحركية الانزيمية. تستخدم هذه الطرق على نطاق واسع كخطوة أولى في توليف الكيماوي الانزيمية غير متماثلة، ولكن بيوكاتاليسيس يوفر العديد من الإمكانيات أكثر في المجموعة الوظيفية إينتيركونفيرسيونس مع ستيريوسيليكتيفيتي عالية1،2،3 . وعلاوة على ذلك، كردود فعل بيوكاتاليتيك تجري في ظروف مماثلة، أنه من الممكن ولذلك القيام بسلسلة من ردود الفعل في وعاء واحد أزياء4،5.
مراوان الكحوليات الأمينية جزيئات تنوعاً للاستخدام كمساعدين أو السقالات في توليف العضوية6. كثيرا ما يتم العثور على مجموعة الأمينية الكحول في نواتج الأيض الثانوية والمكونات الصيدلانية الفعالة (API). كحول β الأمينية الأساسية متوفرة بسهولة من الأحماض الأمينية α المقابلة بالتوليف الكيميائي التقليدية، ولكن الوصول إلى كحول γ الأمينية مراوان أو الكحوليات الأمينية الثانوية يتطلب في أغلب الأحيان مملة المسارات الاصطناعية جنبا إلى جنب مع الحساسة مراقبة الفراغية7،،من89،10. نظراً لأن ستيريوسيليكتيفيتي عالية، بيوكاتاليسيس قد توفر طريقا اصطناعية متفوقة على هذه اللبنات مراوان11،12،،من1314.
نحن سابقا عنها التوليف من مونو-ودي-هيدروكسي-L-ليسينيس دياستيريوسيليكتيفي هيدروكسيليشن الانزيمية تحفزها ديوكسيجيناسيس الحديد (II)/α-كيتواسيد-تعتمد على الأسرة أوكسيجيناسي (αKAO) (الشكل 1)15. على وجه الخصوص، بدءاً من L-يسين، ديوكسيجيناسي KDO1 يحفز التشكيل (ق3)-هيدروكسي مشتقة من (1)، بينما (ص4)-يتشكل مشتق (2) برد فعل مع ديوكسيجيناسي KDO2. هيدروكسيليشنز ريجيوديفيرجينت المتعاقبة ب KDO1 و KDO2 يؤدي إلى التشكيل (3ص،ص4)-ديهيدروكسي-L-يسين (3) في شكل نقي بصريا. ومع ذلك، يعوق الركازة محدودية نطاق هذه الإنزيمات الاستفادة منها كبيرة في التوليف الكيميائي، خاصة في هيدروكسيليشن الأمينات البسيطة، كما ضروري لنشاط16مجموعة حمض الكربوكسيلية في α-موقف المجموعة الأمينية.
رقم 1: تحويلات بيوكاتاليتيك من L-يسين- تحويل (3ق)-هيدروكسي-L-يسين (1) تحفزها ديوكسيجيناسي KDO1؛ (4ص)-هيدروكسي-L-يسين (2) تحفزها ديوكسيجيناسي KDO2؛ و (3ص،ص4)-ديهيدروكسي-L-يسين (3) فعل تتالي تحفزها تباعا ديوكسيجيناسيس KDO1 و KDO2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
إزالة رد فعل مشترك في الأيض17. على وجه الخصوص، الأحماض الأمينية DCs (EC 4.1.1) هي خالية من مساعد (بيروفويل-التابعة) أو الإنزيمات تعتمد على حزب العمال التقدمي، وتحفيز إزالة الأحماض الأمينية إلى بوليامينيس المقابلة في البكتيريا والكائنات أعلى18،19 , 20 , 21 , 22-مونو-وديهيدروكسي المركبات (الشكل 3) 4–7، 10–11 تناظر الهيدروكسيلية كادافيريني، ديامينى التي حصل عليها إزالة L-يسين. كادافيريني لبنة أساسية للصناعة الكيميائية، وعلى وجه التحديد مكون بوليمرات البولي أميد والبولي. ولذلك، الإنتاج القائم على السيرة الذاتية لهذا ديامينى من الموارد المتجددة جذبت الاهتمام كبديل للمسار القائم على النفط، والكائنات الحية الدقيقة المختلفة وقد تم تصميمها لهذا الغرض. في هذه المسارات الأيضية، يسين DC (أقل البلدان نمواً) هو إنزيم الرئيسية. أقل البلدان نمواً إنزيم تعتمد على حزب العمال التقدمي المنتمين إلى ألانين راسيماسي (ع) هيكلية الأسرة23. حزب العمال التقدمي-تعتمد على وحدات تحكم المجال Dc (حزب العمال التقدمي-DCs) معروفة لتكون الركيزة الخاصة بدرجة عالية. ومع ذلك، تملك الإنزيمات قليلة القدرة على المجون طفيف، بنشاط نحو L ornithine و L-يسين من الأحماض الأمينية، كما على سبيل المثال أقل البلدان نمواً من روميرانتيوم سيلينوموناس (سروممن أقل البلدان نمواً)، الذي لديه ثوابت الحركية مماثلة ل يسين و ornithine إزالة24،25. هذه الركيزة الموسعة خصوصية يجعل هذا الإنزيم مرشح جيد لإزالة من مونو-ودي-هيدروكسي-L-يسين. وبالإضافة إلى ذلك، للبحث عن وحدات تحكم المجال Dc النشطة نحو مشتقات جذور الهيدروكسيل ليسين، قمنا بدراسة سياق الجينوم الجينات ترميز الإنزيمات αKAO. وفي الواقع، في جينومات بدائية الجينات ترميز الإنزيمات المشاركة في نفس مسار السكروز هي عموما شارك مترجمة في مجموعات الجينات. تم العثور على الجين KDO2 (من بينينسيس تشيتينوفاجا) المترجمة يشترك مع أحد جينات ترميز المفترضة حزب العمال التقدمي-DC (الشكل 2). وفي المقابل، لا ترميز الجينات للعاصمة قد وجد عند تحليل سياق المجينية ديوكسيجيناسي KDO1. ولذلك اختير البروتين حزب العمال التقدمي-العاصمة من بينينسيس جيم (DCCpin) كمرشح واعدة لتحفيز هذه الخطوة إزالة من رد فعل تتالي.
رقم 2: سياق المجينية جين KDO2 في بينينسيس جيم-- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ونتيجة لذلك، قمنا بتصميم تتالي الانزيمية ردود الفعل التي تنطوي على ديوكسيجيناسيس ووحدات تحكم المجال Dc لتحقيق توليف كحول الاليفاتيه مراوان β و γ-الأمينية من الأحماض الأمينية (الشكل 3). وكما ذكر سابقا، يدخل أكسدة ج-ح تحفزها αKAO مركز ستيريوجينيك هيدروكسي استبداله مع مجموع دياستيريوسيليكتيفيتي؛ سيتم الاحتفاظ عدم التطابق Cβ/γ في الخطوة ديكاربوكسيلاتيفي، الذي يؤثر فقط على الكربون Cα من مجموعة من الأحماض الأمينية16.
رقم 3: تحليل ريتروسينثيتيك- ريتروسينثيسيس (A) من الكحوليات الأمينية β و γ (R)-1، 5-ديامينوبينتان-2-ol (4) من (5ص)-هيدروكسي-L-يسين، وديامينوبينتان (S)-1، 5--2-الرتب الأخرى (5) و 1، 5-ديامينوبينتان-3-الرتب الأخرى (6) من L-يسين. (ب) ريتروسينثيسيس β، γ-وبيتا، δ الأمينية ديولس (2ق، 3S)-1، 5-ديامينوبينتاني-2، 3-ديول (10) و (2ص، 4S) ديامينوبينتاني-1، 5--2، 4-ديول (11) بدءاً من (5ص)- هيدروكسي-L-يسين، و (2ص، 3R) ديامينوبينتاني-1، 5--2، 3-ديول (7) بدءاً من L-يسين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
بدءاً من L-يسين وبه (ص5)-مشتق هيدروكسي، نحن تقرير هنا اثنين/ثلاثة الخطوة، وعاء واحد، الإجراء الانزيمية الجمع بين ديوكسيجيناسيس ووحدات تحكم المجال Dc--حزب العمال التقدمي للحصول على الهدف الكحوليات الأمينية. قبل تركيب على نطاق المختبر من الجزيئات المستهدفة، طور الأسلوب في جدول تحليلي لضبط شروط رد فعل، مثلاً، وتركيزات الإنزيم، المطلوبة للسماح للتحويل الكامل لانطلاق المواد؛ أننا نقدم هذا الإجراء أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد إنزيم
- ويعرب وتنقية البروتينات كما هو موضح سابقا26.
ملاحظة: تم الحصول على البروتينات المؤتلف مع التركيزات النهائية التالية: αKAO من أسيديفيلا كاتينوليسبورا، معرف أونيبروتكب: C7QJ42 (KDO1)، 1.35 مغ/مل؛ ΑKAO من بينينسيس جيم، معرف أونيبروتكب: C7PLM6 (KDO2)، 2.29 مغ/مل؛ وحدات تحكم المجال Dc--حزب العمال التقدمي من س. روميرانتيوم، معرف أونيبروتكب: O50657 (سروممن أقل البلدان نمواً)، استخراج الخلية الحرة مع إنزيم المجموع في 12.44 مغ/مل؛ حزب العمال التقدمي-العاصمة من بينينسيس جيم، معرف أونيبروتكب: C7PLM7 (DCCpin)، 2.62 ملغ/مل.
2-إعداد الحلول
ملاحظة: تعد جميع الحلول أدناه في المياه.
- تحضير 1 م حبيس المخزن المؤقت، درجة الحموضة 7.5؛ ضبط مع 5 أمتار من هيدروكسيد الصوديوم.
ملاحظة: أثناء الخطوة تعديل درجة الحموضة، ارتداء قفازات واقية والملابس الواقية، وحماية العين والوجه حماية (P280). في حالة اتصال مع عيون (P305، P351، P338)، تشطف بالماء لعدة الحد الأدنى إزالة العدسات اللاصقة إذا أمكن. يستمر الشطف والاتصال فورا بمركز السموم أو الطبيب (P310). رمز P يشير إلى البيان التحذيري (الخطر وفئة؛ انظر، مثلاً، pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/). - إعداد 100 مم L-يسين، 100 مم (5ق)-هيدروكسي-L-يسين حمض كيتوجلوتاريك α 150 مم، اسكوربات الصوديوم 100 مم، وسداسي هيدرات كبريتات الحديد الثنائي 10 ملم الأمونيوم (ملح موهر)، 100 مم بيريدكسال 5-الفوسفات (حزب العمال التقدمي) وديثيوثريتول 100 مم (DTT).
- إعداد م 1، 2، و 6 متر مربع من حمض الهيدروكلوريك (HCl) من حل HCl 37 في المائة (أبروكسيماتيفيلي حل م 12)، اتباع إرشادات السلامة نفس كتلك المبينة في 2-1.
ملاحظة: الحلول من حمض كيتوجلوتاريك α، اسكوربات الصوديوم، وسداسي هيدرات كبريتات الحديد الثنائي الأمونيوم يجب بذل الطازجة في يوم الاستخدام. ويمكن تخزين الحل يسين لعدة أشهر في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تخزين حل حزب العمال التقدمي لمدة شهر واحد في 4 درجات مئوية. ويمكن تخزين الحل DTT لمدة شهر واحد في-20 درجة مئوية.
3-التحليل مقياس ردود الفعل
- تطوير أسلوب لإزالة رد فعل (ص5)-هيدروكسي-L-يسين
- إضافة 11 ميليلتر من الحل م 1 من حبيس المخزن المؤقت درجة الحموضة 7.5 (التركيز النهائي 50 مم) إلى microtube 2 مل. ثم قم بإضافة ميليلتر 22 من 100 مم (5ق)-هيدروكسي-L-يسين (التركيز النهائي 10 ملم)، 2.2 ميليلتر من 100 ملم حزب العمال التقدمي (التركيز النهائي 1 مم)، و 2.2 ميليلتر من 100 مم DTT (التركيز النهائي 1 مم).
ملاحظة: في حالة تفاعل مع أقل البلدان نمواًسروم، إضافة القيمة غير ضروري. - إضافة حزب العمال التقدمي المنقي-DC (التركيز النهائي 0.1 مغ/مل). كاملة مع ح2س لوحدة تخزين نهائي من 220 ميليلتر.
- اهتز رد فعل الخليط في درجة حرارة الغرفة، مع غطاء مفتوحة في الهواء الطلق، 300 لفة في الدقيقة ح 3.
ملاحظة: تهز الخليط رد الفعل مع غطاء مفتوحة في الهواء الطلق يضمن الأوكسجين جيدة من رد فعل وسائل الإعلام. ولذلك من الضروري عدم فقاعة الأكسجين في رد فعل وسائل الإعلام. - جمع 10 ميليلتر من خليط رد فعل يتم تحليلها وفقا لرصد رد فعل الإجراء الموضح في الخطوة 6. يفضل أن يكون ديريفاتيزيد العينات وتحليلها مباشرة بعد أخذ العينات.
- إضافة 11 ميليلتر من الحل م 1 من حبيس المخزن المؤقت درجة الحموضة 7.5 (التركيز النهائي 50 مم) إلى microtube 2 مل. ثم قم بإضافة ميليلتر 22 من 100 مم (5ق)-هيدروكسي-L-يسين (التركيز النهائي 10 ملم)، 2.2 ميليلتر من 100 ملم حزب العمال التقدمي (التركيز النهائي 1 مم)، و 2.2 ميليلتر من 100 مم DTT (التركيز النهائي 1 مم).
- تطوير أسلوب لرد فعل تتالي الانزيمية الجمع بين خطوة واحدة hydroxylation تحفزها αKAO مع إزالة تحفزها حزب العمال التقدمي-العاصمة
- إضافة ميليلتر 11 م 1 من حبيس المخزن المؤقت درجة الحموضة 7.5 (التركيز النهائي 50 مم) إلى microtube 2 مل. ثم قم بإضافة ميليلتر 22 من 150 مم حمض كيتوجلوتاريك α (التركيز النهائي 15 ملم)، 5.5 ميليلتر من 100 ملم اسكوربات الصوديوم (التركيز النهائي 2.5 ملم)، 22 ميليلتر من 10 ملم مور للملح (التركيز النهائي 1 مم)، و 22 ميليلتر من 100 ملم من L-يسين (التركيز النهائي 10 ملم).
- كاملة مع ح2س لوحدة تخزين نهائي من 220 ميليلتر، آخذا في الاعتبار حجم الحل إنزيم المراد إضافتها في الخطوة 3.2.3.
- إضافة الإنزيم αKAO المنقي المطلوبة وفقا ريجيوسيليكتيفيتي المستهدفة: KDO1 ل hydroxylation في موقف C-3 أو KDO2 لموقف C-4 L-يسين. التركيز النهائي لأنزيم المنقي (0.05-0.5 ملغ/مل) مصممة لتمكين تحويل كامل في أبروكسيماتيفيلي ح 3.
- اهتز رد فعل الخليط في درجة حرارة الغرفة، مع غطاء مفتوحة في الهواء الطلق، 300 لفة في الدقيقة ح 3.
- إضافة ميليلتر 2.2 من 100 ملم من حزب العمال التقدمي (التركيز النهائي ~ 1 مم) و 2.2 ميليلتر من 100 ملم DTT (التركيز النهائي ~ 1 مم).
ملاحظة: في حالة تفاعل مع أقل البلدان نمواًسروم، إضافة القيمة غير ضروري. - إضافة حزب العمال التقدمي المنقي-DC بتركيز تمكين التحويل الكامل في ح 18: أقل البلدان نمواًسروم بتركيز نهائي تقريبي قدرة 0.1 مغ/مل لرد فعل تتالي مع KDO1، و العاصمةCpin بتركيز نهائي تقريبي قدرة 0.5 ملغ/مل تتالي رد فعل مع KDO2.
- اهتز رد فعل الخليط في درجة حرارة الغرفة، مع غطاء مفتوحة في الهواء الطلق في 300 دورة في الدقيقة ح 18.
- تشغيل إجراء رصد كما هو الحال في الخطوة 3.1.4.
- تطوير أسلوب لرد فعل تتالي الانزيمية الجمع بين هاتين الخطوتين hydroxylation تحفزها αKAOs مع إزالة تحفزها حزب العمال التقدمي-العاصمة
- تشغيل الخطوات 3.2.1-3.2.2.
- إضافة KDO1 بتركيز 0.05 مغ/مل نهائي. اهتز رد فعل الخليط في درجة حرارة الغرفة، مع غطاء مفتوحة في الهواء الطلق، 300 لفة في الدقيقة ح 3.
- إضافة KDO2 بتركيز نهائي تقريبي 0.5 ملغ/مل، محسوبة باستخدام حجم رد الفعل الأولى. اهتز رد فعل الخليط في درجة حرارة الغرفة، مع غطاء مفتوحة في الهواء الطلق، 300 لفة في الدقيقة ح 18.
- تشغيل الخطوة 3.2.5.
- إضافة حزب العمال التقدمي-العاصمة العاصمة المنقيCpin بتركيز نهائي تقريبي 0.5 ملغ/مل، محسوبة باستخدام حجم رد الفعل الأولى. اهتز رد فعل الخليط في درجة حرارة الغرفة، مع غطاء مفتوحة في الهواء الطلق، 300 لفة في الدقيقة ح 18.
- تشغيل إجراء الرصد كما هو الحال في الخطوة 3.1.4.
4-شبه محضرة وعاء واحد رد فعل بيوكاتاليتيك
ملاحظة: تجري التفاعلات الانزيمية على 0.1 ميللي مول من L-يسين في زجاج في الهواء الطلق 250 مل قارورة Erlenmeyer لإجمالي حجم 10 مل.
- توليف لمشتقات مونوهيدروكسيلاتيد
- إضافة 0.5 مل من 1 م حبيس المخزن المؤقت، ودرجة الحموضة 7.5 (التركيز النهائي 50 مم) إلى قارورة. ثم أضف 1 مل من 100 مم L-يسين (تركيز نهائي 10 ملم)، 1 مل حمض كيتوجلوتاريك α 150 مم (التركيز النهائي 15 ملم)، 0.25 مل اسكوربات الصوديوم 100 مم (التركيز النهائي 2.5 ملم)، والملح 1 مل 10 مم مور (التركيز النهائي 1 مم).
- كاملة مع ح2س لوحدة تخزين نهائي من 10 مل، آخذا في الاعتبار حجم الحل إنزيم المراد إضافتها في الخطوة 4.1.3.
- إضافة الإنزيم αKAO المنقي المطلوبة وفقا ريجيوسيليكتيفيتي المستهدفة: KDO1 بتركيز 0.075 mg/mL ل hydroxylation في موقف C-3 أو KDO2 بتركيز 0.5 ملغ/مل لموقف C-4 L-يسين نهائي نهائي. التركيز النهائي لأنزيم المنقي مصممة لتمكين تحويل كامل في أبروكسيماتيفيلي ح 3.
- اهتز الخليط رد فعل في درجة حرارة الغرفة 300 لفة في الدقيقة لمدة مناسبة. عند رصد رد فعل يشير إلى رد فعل hydroxylation مكتملة (تشغيل جميع الخطوات بالتفصيل في الخطوة 6 لرد الفعل رصد البروتوكول)، انتقل إلى الخطوة 4.1.5. وقت رد فعل نموذجي ح 3.
- إضافة 100 ميليلتر من 100 ملم حزب العمال التقدمي إلى خليط رد فعل αKAO (التركيز النهائي ~ 1 مم). ثم قم بإضافة 100 ميليلتر من 100 مم DTT (التركيز النهائي ~ 1 مم)، باستثناء عند استخدامسروممن أقل البلدان نمواً.
- إضافة حزب العمال التقدمي المنقي-العاصمة: أقل البلدان نمواًسروم بتركيز نهائي تقريبي قدرة 0.05 مغ/مل لرد فعل تتالي مع KDO1 أو DCCpin بتركيز نهائي تقريبي 0.5 ملغ/مل لرد فعل تتالي مع KDO2.
- يهز رد فعل الخليط في درجة حرارة الغرفة، 300 دورة في الدقيقة، على ح 18 وتابع مباشرة إلى الخطوات المفصلة في الخطوة 4، 3.
- توليف لمشتقات ديهيدروكسيلاتيد
- إضافة 0.5 مل من 1 م حبيس المخزن المؤقت، ودرجة الحموضة 7.5 (التركيز النهائي 50 مم)، 1 مل من 100 مم L-يسين (تركيز نهائي 10 ملم)، 1 مل حمض كيتوجلوتاريك α 150 مم (التركيز النهائي 15 ملم)، 0.25 مل اسكوربات الصوديوم 100 مم (التركيز النهائي 2.5 ملم) ، وملح 1 مل 10 مم مور (التركيز النهائي 1 مم). كاملة مع ح2س لوحدة تخزين نهائي من 10 مل، آخذا في الاعتبار حجم الحل إنزيم المراد إضافتها في الخطوة 4-2-2.
- إضافة KDO1 إلى تركيز 0.075 mg/mL نهائي. اهتز رد فعل الخليط في درجة حرارة الغرفة، 300 لفة في الدقيقة لمدة مناسبة.
- عندما رصد رد فعل يشير إلى رد فعل hydroxylation مكتملة (راجع الخطوة 6 لرد الفعل رصد البروتوكول)، انتقل إلى الخطوة 4.2.5. وقت رد فعل نموذجي ح 3.
- أضف 1 مل حمض كيتوجلوتاريك α 150 مم (التركيز النهائي 15 ملم)، 0.25 مل اسكوربات الصوديوم 100 مم (التركيز النهائي 2.5 ملم)، والملح 1 مل 10 مم مور (التركيز النهائي 1 مم).
- إضافة KDO2 إلى بتركيز 0.5 ملغ/مل، محسوبة باستخدام حجم رد الفعل الأولى نهائي تقريبي. اهتز خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة 300 لفة في الدقيقة ح 18.
- عندما رصد رد فعل يشير إلى رد فعل ديهيدروكسيليشن مكتملة (راجع الخطوة 6 لرد الفعل رصد البروتوكول)، انتقل إلى الخطوة 4.2.7. وقت رد فعل نموذجي ح 18.
- إضافة 100 ميليلتر من 100 ملم DTT (التركيز النهائي ~ 1 مم)، باستثناء حالة استخدام أقل البلدان نمواًسروم.
- إضافة DC المنقيCpin بتركيز نهائي تقريبي 0.5 ملغ/مل، محسوبة باستخدام حجم رد الفعل الأولى.
- اهتز خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة 300 لفة في الدقيقة ح 18.
- تبريد
- يبرد الخليط رد فعل عن طريق وضع زجاج 250 مل قارورة Erlenmeyer في حمام الثلج.
- إضافة بعناية، أكثر من أبروكسيماتيفيلي 1 دقيقة، 0.25 مل من HCl م 6 بالهز يدوياً بلطف الرد يبرد الخليط. اتبع إرشادات الأمان نفسها كتلك الموضحة في الخطوة 2، 1.
- نقل الخليط الحمضي إلى الطرد مركزي مخروطية الشكل السفلي 50 مل أنبوب استخدام زجاج ماصة باستور مزودة بمصباح، ثم الطرد المركزي في 1,680 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- سحب المادة طافية ونضع جانبا في قارورة مستديرة قاع 250 مل.
- إضافة 10 مل مياه إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطية الشكل السفلي المحتوية على بيليه. دوامة إعادة تعليق بيليه.
- أجهزة الطرد المركزي في س 1,680 ز، 4 درجة مئوية، لمدة 15 دقيقة.
- سحب المادة طافية وإضافته إلى قارورة مستديرة القاع 250 مل يحتوي على المادة طافية الأولى (الخطوة 4.3.4).
- تجميد supernatants جمعها بالانغماس قارورة إلى النيتروجين السائل مع اليد ثابتة يحوم، ونقل في قارورة فورا مشعب benchtop مجفف التجميد لمنع المواد من ذوبان الجليد.
- بعد إتمام عملية التجفيف (بين عشية وضحاها)، إزالة قارورة من التجميد-المجفف.
5-تنقية الكحوليات الأمينية من مزيج النفط الخام من رد الفعل الأنزيمي
- راتنج التبادل الأيوني
- حل المنتج المعصوفه في الحد الأدنى من مائي م 0.1 من HCl (أبروكسيماتيفيلي 4 مل) حتى الجسيمات الصلبة لم تعد مرئية بالعين المجردة.
- شرط حمض السلفونيك مجموعة الوظيفية تبادل الأيونات الموجبة راتنج، مش 200-400، في عمود زجاج (20 × 250 ملم) من الوتينج في الضغط الجوي 1 M HCl (العمود 4 مجلدات) تليها 0.1 M HCl (4 وحدات تخزين العمود؛ وحجم العمود = 10 مل).
- تحميل العينة بعناية في الجزء العلوي من الراتنج على الجدران من الزجاج العمود باستخدام ميكروبيبيتي ميليلتر 1,000. ثم شطف الأنبوب الطرد المركزي مخروطية الشكل السفلي يحتوي المنتج الخام ثلاث مرات مع 1 مل 0.1 M من محلول مائي HCl الواحدة تغسل، وتحميل وحدات التخزين الشطف الناتجة على العمود بنفس الطريقة.
- الوت بغير الخطية التدرج: أحجام العمود 4 من 0.1 M HCl، 4 عمود كميات من المياه، ووحدات تخزين العمود 4 5% NH4أوه، أحجام العمود 4 من 10% NH4أوه، أحجام العمود 4 من 15% NH4أوه، أحجام العمود 4 من 20% NH4يا ، أحجام العمود 4 من 25% NH4أوه وأخيراً 4 أحجام العمود من 28% NH4يا.
- مراقبة التنقية قبل [هبلك] (راجع الخطوة 6).
- تجمع الكسور التي تحتوي على المركب (NH4يا 20-28%)، وفريزيدري كما هو موضح في الخطوات 4.3.8-4.3.9.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام العمود التبادل الأيوني بعد شطف مع المياه إلى تحييد شطف المياه (أبروكسيماتيفيلي 50 مل) متبوعاً بتجديدها قبل التينج مع 50 مل م 1 من HCl.
- جمعية مهندسي البترول
- جعل المجمع المعصوفه في أبروكسيماتيفيلي 2 مل من ح3ص4/water (20 ميليلتر/mL).
- مكان وضع مختلط تبادل الأيونات الموجبة جمعية مهندسي البترول 6 مل-خرطوشة على مشعب استخراج متصل بمضخة لمياه. شرط الخرطوشة بالرسم عن طريق 4 مل من الميثانول تحت ضغط انخفاض توفرها المتشعبة. حجته الخرطوشة بالرسم عن طريق 4 مل ح3ص4/water (20 ميليلتر/mL).
- تحميل العينة على خرطوشة استخدام ميكروبيبيتي ميليلتر 1,000 في الجزء العلوي من الراتنج على جدران العمود الزجاج، وشطف القنينة التي تحتوي على المنتج ثلاث مرات مع مل 0.75 من ح3ص4/water (20 ميليلتر/mL) للمياه والصرف الصحي. تحميل وحدة التخزين الشطف الناتجة على العمود بنفس الطريقة.
- أغسل الخرطوشة من الوتينج تحت ضغط انخفاض، قدمتها المتشعبة، مل 4% 2 هكووه في الماء، ثم مع 4 مل من الماء. الوتي مع تدرج من NH4يا في الماء (4 مل لكل شطف، ابتداء من 4% NH4أوه: 10%، 15%، 15%، 20%، ونسبة 28%).
- مراقبة التنقية قبل [هبلك] بتحليل كل جزء وفقا لرد فعل رصد البروتوكول هو موضح في الخطوة 6. إبقاء جميع الكسور تتضمن نقية مشتق المطلوب وفقا للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) chromatogram والمضي قدما إلى الخطوة 5.2.6.
- الجولة تجمع الكسور التي تحتوي على المطلوب المركبة إلى 100 مل جولة أسفل قارورة وشطف هذه الأنابيب التي تحتوي على الكسور مع الماء، وإضافة حجم شطف إلى 100 مل قارورة السفلي.
- إزالة المذيب تحت ضغط انخفاض استخدام مبخر دوراني مجهزة بغلاية حمام الماء الحرارة عند 40 درجة مئوية ومتصل بمضخة فراغ في 10 [مبر].
- جعل الصلبة بحجم أدنى في المياه ونقل الحل إلى وزنه 25 مل جولة قارورة السفلي. شطف قارورة مع حجم الحد أدنى من المياه وإضافة حجم شطف إلى قارورة 25 مل والمضي قدما إلى الخطوة 5.2.9.
- وزن المنتج المنقي وحساب العائد.
- حل المنتج المنقي في حجم الحد الأدنى 2 م من HCl حتى الجسيمات الصلبة لم تعد مرئية بالعين المجردة وفريزيدري كما هو موضح في الخطوات 4.3.8-4.3.9.
ملاحظة: الكحوليات الأمينية هي المركبات الحساسة ويتم الاحتفاظ بها كأملاح هيدروكلوريد بهم.
6-رد الفعل رصد وتحليل المنتج
- Derivatization من ركائز والمنتجات قبل التحليل [هبلك]
ملاحظة: ركائز ومنتجات تحتاج إلى أن تكون ديريفاتيزيد كالمشتقات العطرية لزيادة ديتيكتيفيتي الكروماتوغرافي الأشعة فوق البنفسجية. فنحن نستخدم 1-مخفضات-2، 4-دينيتروبينزيني (دنفب). كان يحقن كل عينة [هبلك] مباشرة بعد derivatization.- تأخذ 10 ميليلتر من رد الفعل الأنزيمي ونقل إلى microtube 1.5 مل. إضافة 10 ميليلتر من 0.25 M من محلول مائي3 ناكو، 100 ميليلتر من الإيثانول، و 30 ميليلتر من 2.5 ملغ/مل من محلول دنفب في الإيثانول.
- أغلق microtube ويهز الحل الناتجة عن ح 1 في 65 درجة مئوية، 1,000 لفة في الدقيقة. آرو مع 10 ميليلتر م 1 من HCl.
- تصفية على عامل تصفية المحاقن غير معقمة قطرها 4 مم مع الفينيليدن ماء حجم مسام ميكرومتر 0.22 فلوريد (PVDF) غشاء استخدام المحاقن اللوير 1 مل.
- إجراء رصد لرد فعل ديوكسيجيناسي باستخدام أي نظام قادر على فصل الأحماض الأمينية ديريفاتيزيد. ويشمل هذا البروتوكول الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية من الأحماض الأمينية ديريفاتيزيد ب فريق chromophore دينيتروبينزيني (DNB)27.
- يصلح [هبلك] مع C18 مع trimethyl سيليل اندكابينج مرحلة عكس عمود (5 ميكرومتر، 3 × 150 مم).
- حجته عمود C18 مع الوينت (30:70) ب (ميكن + 0.1% تفا) إلى الوينت أ (ح2س + 0.1% تفا) بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة و 35 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (المقابلة لوحدات تخزين العمود 20 أبروكسيماتيفيلي).
- حقن 10 ميليلتر من خليط رد فعل ديريفاتيزيد (راجع الخطوة رقم 6، 1) على عمود C18 [هبلك]. استخدام خليط من ميكن و 0.1% تفا/ح2س و 0.1% تفا الوينت مع تدرج خطي (30:70 نسبة لمشروعاتها في 9 دقيقة، درجة الحرارة 35 درجة مئوية، تدفق 1 مل/دقيقة).
- استخدام الأشعة فوق البنفسجية الكشف عن تعيين 400 نانومتر لتحليل المنتجات التيد في العمود الكروماتوغرافي. DNB-يسين التيس عادة حوالي 6.5 دقيقة الهيدروكسيلية DNB-يسين حوالي 5.5 دقيقة، ديهيدروكسيلاتيد DNB-يسين حوالي 4.2 دقيقة و DNB-أمينوديول حوالي 5.3 دقيقة.
7-الرنين المغناطيسي تحليل لكحول الأمينية المنقاة
- حل الكحوليات الأمينية المنقاة في د2س (700 ميليلتر) ونقل الحل إلى أنبوب "الرنين المغناطيسي النووي" (الرنين المغناطيسي النووي).
- الحصول على 1ح وأطياف "الرنين المغناطيسي النووي ج" 13وفقا لمرفق الرنين المغناطيسي النووي المناسبة البروتوكولات28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أبلغنا سابقا التوليف من مونو-ودي-هيدروكسي-L-ليسينيس من دياستيريوسيليكتيفي هيدروكسيليشن الانزيمية تحفزها ديوكسيجيناسيس الحديد (II)/αKAO الأسرة (الشكل 1)16. لتحسين بروتوكول كامل الشلالات المعروضة هنا، التي تجمع بين واحد أو اثنين من الخطوات hydroxylation تحفزها αKAO تليها خطوة إزالة تحفزها حزب العمال التقدمي-DC، تم تعديل شروط رد فعل لتلبية متطلبات كل التفاعلات الانزيمية. لقد بدأنا بالتحقيق في أنشطة اثنين من وحدات تحكم المجال Dc، وأقل البلدان نمواًسروم والعاصمةCpin، نحو المتاحة تجارياً (5ص)-هيدروكسي-L-يسين. ثم أننا جزيئي أنشطة العاصمة نحو مشتقات أحادية، 3-هيدروكسي-L-يسين (1) و 4-هيدروكسي-L-يسين (2) وفي تتالي الخطوة أكسدة تحفزها αKAO المناسبة. ويعرض الجدول 1 نتائج ديكاربوكسيليشنز بيوكاتاليتيك مونو-هيدروكسي-L-ليسينيس. وقيست التحويلات قبل [هبلك] بعد derivatization خليط التفاعل مع دنفب لإعطاء DNB المقابلة ديريفاتيزيد ركائز والمنتجات.
| دخول | الركيزة | حزب العمال التقدمي-العاصمة | المنتج | التحويل |
| 1 | (ص5)-هيدروكسي-L-يسين | أقل البلدان نمواًسرومب) | 4 | 100 ٪ |
| 2 | (ص5)-هيدروكسي-L-يسين | DCCpinب) | 4 | بلا تاريخ |
| 3 | 1 ) | أقل البلدان نمواًسرومب) | 5 | 100 ٪ |
| 4 | 1 ) | DCCpinب) | 5 | 29 في المائة |
| 5 | 2 ) | أقل البلدان نمواًسرومج) | 6 | 60 في المائة |
| 6 | 2 ) | DCCpinج) | 6 | 100 ٪ |
الجدول 1: إزالة بيوكاتاليتيك من مونوهيدروكسي-L-ليسينيس- شروط رد فعل: الركيزة (10 ملم)، وحزب العمال التقدمي-العاصمة (0.1 إلى 0.15 مغ مل-1)، حبيس المخزن المؤقت (50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.5)، حزب العمال التقدمي (1 ملم)، DTT (1 مم؛ ولا تستخدم مع أقل البلدان نمواًسروم)، بين عشية وضحاها، الرايت، 300 دورة في الدقيقة. () تجميع انزيماتيكالي في الموقع. (ب) 0.1 ملغ/مل. (ج) 0.15 مغ/مل؛ بلا تاريخ: لم يتم الكشف عن
وحدة تحكم المجال DC من س. روميرانتيوم (سروممن أقل البلدان نمواً) أظهرت النشاط نحو جميع ليسينيس هيدروكسي أحادية مع تحويل أفضل من 3-5-المشتقات وإلى ديامينيس هيدروكسي مراوان المقابلة (إدخالات 1 و 3 و 5). كما هو متوقع، DCCpin، وحدة تحكم المجال DC سياق المجينية αKAO، تبين أن الأكثر مناسبة لإزالة (4ص)-هيدروكسي-L-يسين (2) (إدخال 6). تحت معيار رد الفعل شروط التحويل (3ق)-هيدروكسي-L-يسين (1) إلى نظيره ديكاربوكسيلاتيد (5) مع DCCpin كانت منخفضة (إدخال 4)، ولا يوجد نشاط لوحظ اتجاه (5ص)- هيدروكسي-L-يسين (إدخال 2).
أخيرا، نحن فحص أنشطة DCs اثنين نحو مشتقات دي-هيدروكسي-L-يسين 3و 8، و 9، وتوليفها في الموقع من قبل واحد أو اثنين من الخطوات hydroxylation تحفزها KDO1 أو KDO2، أو مزيج من الاثنين (الشكل 2). ويرد في الجدول 2نتائج إزالة بيوكاتاليتيك دي-هيدروكسي-L-ليسينيس.
| دخول | الركيزة | حزب العمال التقدمي-العاصمة | المنتج | التحويل |
| 1 | 3 | أقل البلدان نمواًسرومب) | 7 | بلا تاريخ |
| 2 | 3 | DCCpinب) | 7 | 100 ٪ |
| 3 | 8 ) | أقل البلدان نمواًسرومب) | 10 | 19 في المائة |
| 4 | 8 ) | DCCpinب) | 10 | 12% |
| 5 | 9 ) | أقل البلدان نمواًسرومج) | 11 | بلا تاريخ |
| 6 | 9 ) | DCCpinج) | 11 | بلا تاريخ |
الجدول 2: إزالة بيوكاتاليتيك من ديهيدروكسي-L-ليسينيس- شروط رد فعل: الركيزة (10 ملم)، وحزب العمال التقدمي-العاصمة (0.1 إلى 0.15 مغ/مل)، حبيس المخزن المؤقت (50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.5)، حزب العمال التقدمي (1 ملم)، DTT (1 مم؛ ولا تستخدم مع أقل البلدان نمواًسروم)، بين عشية وضحاها، الرايت، 300 دورة في الدقيقة. () تجميع انزيماتيكالي في الموقع. (ب) 0.1 ملغ/مل. (ج) 0.15 مغ/مل؛ بلا تاريخ: لم يتم الكشف عن.
وفيما يتعلق بإزالة من ديهيدروكسي-L-ليسينيس 3و 8، و 9، لم تكن النتائج مرضية تماما. في الظروف القياسية رد فعل، فقط (3ص،ص4)-ديهيدروكسي-L-يسين (3) تم تحويل الكمية في ديامينى ديهيدروكسي المقابلة 7 (إدخالات 1-2). تم تحويل 4، 5-ديهيدروكسي-L-يسين (8) متوسطة (إدخالات 3-4) ولكن من الجدير بالذكر أنه يمكن تحسينها بدرجة كبيرة زيادة تحميل الإنزيم. تم العثور على أي من اختبار هما حزب العمال التقدمي-DCs النشطة نحو 3.5-ديهيدروكسي-L-يسين (9) (إدخالات 5-6).
تم تصعيد ردود الفعل الأنزيمي تتالي العارضة التحويل الكمي حسبما تقرره الرصد [هبلك] بنجاح (الشكل 4).
الشكل 4: بيانات تحليلية تمثيلية لتتالي الانزيمية ثلاث خطوات- (أ) [هبلك] رصد بيوكاتاليتيك تحويل L-يسين (2ص، 3R)-1، 5-ديامينوبينتان-2، 3-ديول (7). RT = الوقت الاستبقاء. (ب) 1ح الرنين المغناطيسي النووي و (ج) 13"الرنين المغناطيسي النووي ج" الكحوليات الأمينية (7) بعد تنقيتها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
يسمح البروتوكول تنقية المعروضة هنا كفاءة استخراج الكحول الأمينية من خليط التفاعل الأنزيمي المعقدة. وتم الحصول على الكحوليات الأمينية 4، 5، 6، و 7 في غلال ممتازة (الشكل 5).
الرقم 5: الشلالات الانزيمية لتوليف الكحوليات الأمينية. توليف (R)-1، 5-ديامينوبينتان-2-الرتب الأخرى (4)، ديامينوبينتان (S)-1، 5--2-ol (5)، 1، 5-ديامينوبينتان-3-ol (6)، و (2ص،ص3) ديامينوبينتاني-1، 5--2، 3-ديول (7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مراوان الكحوليات الأمينية ومشتقاتها لديها مجموعة واسعة من التطبيقات، من المساعدين مراوان للتوليف العضوي للعلاج بالأدوية. التوليف متعددة الخطوات لإنتاج الكحوليات الأمينية بتوليف العضوية التقليدية عديدة، ولكن قد لا تكون دائماً فعالة بسبب الخطوات مملة الحماية/deprotection جنبا إلى جنب مع عنصر تحكم حساسة الفراغية16. اتباع نهج بيوكاتاليتيك يوزع مع خطوات الحماية/deprotection وهي عادة ما تكون شديدة تراكما أحيائياً فراغي النوعية يمثل بديلاً جيدا.
الأعمال السابقة عنها توليف كحول β الأمينية المختلفة مع العمود الفقري 2-فينيليثان-1-أمين دينامية التحول غير المتناظر الحركية (ديكات). في هذا المسار، قدم مركز الاستعاضة عن هيدروكسي ستيريوجينيك الدوليسيشن في بينزالديهيدي ومشتقاتها، تحفزها الدلاس ثريونين. تم التغلب على دياستيريوسيليكتيفيتي منخفض والعائد المعتدل لهذه الخطوة الأولى بإزالة stereospecific اللاحقة التي تحفزها DC لتيروزين، مما يؤدي إلى انانتيونريتشيد كحول β الأمينية العطرية11،12.
أبلغنا هنا بروتوكولا مباشرة لتوليف الكحوليات الأمينية المختلفة بدءاً من L-يسين متاحة بسهولة. على الرغم من أن كفاءة جداً، يعاني هذا البروتوكول من العوائق بسبب نطاقات محدودة الركيزة αKAO وحزب العمال التقدمي-DC الإنزيمات. ومع ذلك، يمكن اعتبار التوليف بيوكاتاليتيك من الكحوليات الأمينية المختلفة باستخدام تركيبات مختلفة من الأخرى αKAO والأحماض الأمينية DCs29،30،،من3132. تجدر الإشارة إلى أن ترتيب خطوتين أمر حاسم في تتالي كما تنشط أيضا وحدات تحكم المجال Dc--حزب العمال التقدمي نحو L-يسين. يجب الحرص على التأكد من أن جميع L-يسين يستهلك في أول خطوة الأكسدة قبل تشغيل رد فعل إزالة تحفزها حزب العمال التقدمي-DC. هذا وتكفل من خلال الرصد الدقيق لرد فعل [هبلك] بعد derivatization من رد فعل وسائل الإعلام بعامل chromophore. التسامح منخفضة من الإنزيم الركازة عالية التركيز قيد لمزيد من التطوير. لمعالجة هذه المسألة، واستراتيجيات التطور الإنزيم قد تستخدم لتحسين خصائص الإنزيم، مثل الركازة التركيز التسامح33. أيضا، يمكن اعتبار تجميد إنزيم لضمان إعادة استخدام الإنزيم.
من السهل القيام بهذا البروتوكول، وإحدى السمات الأكثر جاذبية هو كفاءة خطوات التنقية. في أعمالنا السابقة، مسألة استخراج الجزيئات القطبية المباشرة من خليط التفاعل الأنزيمي المعقدة، و derivatization المركبات حسب الفئات مسعور اللازمة16. تنقية الكحول الأمينية مباشرة من رد فعل دون derivatization المطلوب عمل واسع النطاق. في هذا البروتوكول، يزيل الإجراء تنقية خطوتين يجمع بين راتنج التبادل الأيوني واستخراج المرحلة الصلبة والغليسيرول (الواردة في حل الإنزيم) وحبيس المخزن المؤقت، هما الجزيئات القطبية مع الخصائص الفيزيائية والكيميائية قريبة من تلك استهدفت الكحوليات الأمينية وبالتالي يصعب فصل من هذه المركبات. هذا البروتوكول تنقية يمكن تكييفها لاستخراج مختلف الجزيئات القطبية من الخلائط المعقدة رد فعل مثل تلك من ردود فعل الإنزيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون بيريت العين، كريستين Pellé، فيرونيك دي بيراردينيس لمناقشة مثمرة وسيرفين بيغي للدعم التقني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
| α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
| Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
| Ethanol | VWR | 20825.290 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
| Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| Formic acid | Acros | 270480010 | |
| Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
| Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
| 4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
| Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
| Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
| Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz spectrometer | Bruker | ||
| 2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
References
- Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
- Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
- Turner, N. J., O'Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
- Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
- Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
- Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
- Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
- McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
- Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
- Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
- Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
- Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
- Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
- Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114 (0), 65-71 (2015).
- Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
- Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
- Suzuki, H., Kurihara, S. Ch. 4. Polyamines. Kusano, T., Suzuki, H. 4, Springer Japan. 47-59 (2015).
- Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
- Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
- Qian, Z. -G., Xia, X. -X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
- Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
- Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
- Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
- Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
- Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
- Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
- Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
- JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017).
- Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
- Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
- Kourist, R., Guterl, J. -K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
- Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
- Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).
