Summary
카이 랄 아미노 알콜 건설 기계 유기 합성에 사용 하기 위해 다양 한 분자입니다. 패-리 신에서 시작, 우리 diastereoselective C H 산화 촉매 dioxygenase에 의해 해당 수 아미노산의 carboxylic 산 moiety의 분열에 의해 다음에 의해 결합 하는 효소 캐스케이드 반응에 의해 아미노 알콜을 합성 한 decarboxylase입니다.
Abstract
아미노 알콜은 다양 한 응용 프로그램으로 다양 한 화합물. 예를 들어, 그들은 유기 합성에서 랄 공중 발판으로 사용 되었습니다. 기존의 유기 화학에 의해 그들의 합성은 종종 stereochemical 결과의 어려운 제어와 지루한 여러 단계의 합성 과정을 필요합니다. 선물이 효소 synthetize 아미노 알콜 48 h에 쉽게 사용할 수 있는 L 리 진에서 시작 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 매우 전통적인 유기 합성 하 여 수행 하기 어려운 두 화학 반응 결합 합니다. 신의 unactivated C H 본드의 첫 번째 단계, regio-와 diastereoselective 산화에 사이드 체인 dioxygenase;에 의해 촉매는 두 번째 regio-와 diastereoselective regiodivergent dioxygenase에 의해 촉매 산화는 1, 2-diols의 형성으로 이어질 수 있습니다. 마지막 단계에서 carboxylic 그룹의 알파 아미노산은 pyridoxal 인산 염 (PLP) decarboxylase (DC)에 의해 죽 습. 이 decarboxylative 단계 베타/감마 위치에 대체 hydroxy stereogenic 센터 유지 아미노산의 알파 탄소를만 영향을 줍니다. 결과 아미노 알콜은 광학 농축 따라서. 프로토콜의 4 개의 아미노 알콜 semipreparative 규모 합성에 성공적으로 적용 되었습니다. 반응의 모니터링 실시 했다 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 derivatization 후 1-플 루 오로-2, 4-dinitrobenzene에 의해. 고체 상 추출 (SPE)에 의해 간단 정화 받으면 우수한 수익률 아미노 알콜 (93% > 95%).
Introduction
Biocatalysis 제공 하는 혜택에도 불구 하 고 합성 경로 또는 총 biocatalytic 노선 biocatalytic 단계의 통합 주로 효소 키네틱 해상도 제한 남아 있습니다. 이러한 노선 비대칭 화학 효소 합성의 첫 번째 단계로 널리 사용 되었습니다 하지만 높은 stereoselectivity,12,3 기능 그룹 interconversions에 더 많은 가능성을 제공 하는 biocatalysis . 또한, biocatalytic 반응 비슷한 조건에서 실시 하 고로 그것은 가능한 한 냄비 패션4,5에서 캐스케이드 반응을 수행 하 따라서.
카이 랄 아미노 알콜은 보조 또는 유기 합성6공중 발판으로 사용 하기 위해 다양 한 분자. 아미노 알콜 moiety 이차 대사 산물 및 활성 제약 성분 (API)에 자주 발견 된다. 기본 β-아미노 알콜 랄 γ-아미노 알콜에는 기존의 화학 합성, 하지만 액세스 하 여 해당 α 아미노 산에서 쉽게 사용할 수 또는 보조 아미노 알콜은 종종 민감한 함께 지루한 합성 경로 필요 입체 화학7,8,,910의 제어 합니다. 그것의 높은 stereoselectivity 때문에 biocatalysis이 카이 랄 빌딩 블록11,12,,1314우수한 합성 경로 제공할 수 있습니다.
우리는 이전 diastereoselective 효소 hydroxylation 철 (II)의 dioxygenases에 의해 촉매에 의해 합성의 모노-및 디-hydroxy-L-lysines를 보고 / α-ketoacid-종속 oxygenase 가족 (αKAO) (그림 1)15. 특히, KDO1 dioxygenase-hydroxy 파생 (4R) 하면서 (1)-(3S)의 형성을 catalyzes L-리 신에서 시작, 파생 (2) KDO2 dioxygenase 가진 반응에 의해 형성 된다. KDO1와 KDO2에 의해 연속 regiodivergent hydroxylations-dihydroxy-L (3R, 4R)의 형성으로 이어질-광학적으로 순수한 형태로 lysine (3). 그러나,이 효소의 제한 된 기판 범위 α-아미노 그룹의 위치에 carboxylic 산 moiety 활동16를 위해 근본적으로 간단한 아민의 hydroxylation에 특히 화학 합성에 큰 사용률을 방해 한다.
그림 1: L-리 신 Biocatalytic 변환. (3S)으로 변환-hydroxy-L-리 신 (1) KDO1 dioxygenase;에 의해 촉매 (4R)-hydroxy-L-리 신 (2) KDO2 dioxygenase;에 의해 촉매 그리고 (3R, 4R)-dihydroxy-L-리 신 (3) 캐스케이드 반응 KDO1 및 KDO2 dioxygenases에 의해 연속적으로 촉매에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Decarboxylation 신진 대사17에 일반적인 반응입니다. 특히, 아미노산 Dc (EC 4.1.1) 공동 인자 없는 (pyruvoyl) 또는 PLP 의존 효소 이며 박테리아와 더 높은 유기 체18,19 에 해당 polyamines로 아미노산의 decarboxylation 촉매 , 20 , 21 , 22. hydroxylated cadaverine, L-리 신의 decarboxylation에 의해 얻은 diamine에 해당 하는 모노-및 dihydroxy 화합물 (그림 3) 4-7, 10,-11 . Cadaverine 화학 산업에 대 한 주요 빌딩 블록, 특히 폴 리아 미드와 폴리우레탄 중합체의 구성 요소입니다. 따라서,이 diamine 재생 가능 자원에서의 바이오 기반 생산 석유 기반 경로 대신 관심을 모으고 있다 그리고 다양 한 미생물이이 목적을 위해 설계 되어 있다. 이러한 대사 경로에서 lysine DC (LDC) 주요 효소 이다. LDC는 알라닌 racemase (AR) 구조 가족23에 속하는 PLP 의존 효소 이다. PLP 의존 Dc (PLP-DCs) 높은 기판 특정 알려져 있습니다. 그러나 몇 가지 효소 예를 들면 Selenomonas rumirantium (LDCSrum)에서 LDC로 L ornithine 및 L-리 신 아미노산으로 활성화 되 고 약간의 성행위의 기능을 소유 하는, 유사한 운동 상수에 대 한가 lysine과 ornithine decarboxylation24,25. 이 확장된 기질 특이성은이 효소 decarboxylation의 모노-및 디-hydroxy-L-리 신에 대 한 좋은 후보. 또한, Dc 찾을 신의 수 파생 상품으로 활성, 우리 인코딩 αKAO 효소 유전자의 genomic 컨텍스트를 검사 합니다. 실제로, prokaryotic 유전자에서 인코딩 효소 같은 생 합성 경로에 관여 하는 유전자는 일반적으로 공동 지역화 유전자 클러스터에. 공동 유전자 인코딩 putative PLP-DC (그림 2)와 지역화 ( Chitinophaga pinensis)에서 KDO2 유전자 발견. 반면, DC에 대 한 인코딩 없이 유전자 발견 되었습니다 KDO1 dioxygenase의 게놈 컨텍스트를 분석할 때. C. pinensis (DCCpin)에서 PLP DC 단백질 따라서 캐스케이드 반응의 decarboxylation 단계를 촉매를 유망한 후보자로 선정 되었다.
그림 2: C. pinensis에 KDO2 유전자의 Genomic 맥락. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
따라서, 우리는 dioxygenases 및 아미노산 (그림 3)에서 지방 족 랄 β-및 γ-아미노 알콜의 합성을 달성 하기 위해 Dc 효소 캐스케이드 반응 설계. 이전 보고는 αKAO에 의해 촉매 C H 산화 총 diastereoselectivity;와 hydroxy 대체 stereogenic 센터 소개 Cβ/γ 카이랄성 아미노산 moiety16의 Cα 탄소에만 영향을 줍니다 decarboxylative 단계에서 유지 됩니다.
그림 3: Retrosynthetic 분석. (R5) (4) β-및 γ-아미노 알콜 (R)-1, 5-diaminopentan-2-ol의 (A) Retrosynthesis-hydroxy-L-라이 신, 그리고 (S)-1, 5-diaminopentan-2-ol (5) 및 1, 5-diaminopentan-3-ol (6)에서 패-리 신입니다. (B) Retrosynthesis의 β, γ-β, δ-아미노 diols (2S, 3S)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (10) 및 (R,S4 2)-1, 5-diaminopentane-2, 4-diol (11) 5 (R)에서 시작- hydroxy-L-라이 신, 및 (R,R3 2)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (7) L-리 신에서 시작. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
패-리 신 (5R)에서 시작-hydroxy 파생, 우리 여기는 2/3 단계, 한 냄비, dioxygenases와 PLP-Dc를 대상 아미노 알콜 효소 절차 보고. 사전 종합 대상 분자의 실험실 규모에서 메서드는 반응 조건, 예를 들면, 원자재;의 전체 변환 수 있도록 하는 데 필요한 효소 농도 조정 분석 규모에서 개발 되었다 우리는 또한이 절차를 제시.
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Protocol
1. 효소 준비
- 표현 하 고 앞에서 설명한26으로 단백질 정화.
참고: 재조합 단백질 다음 최종 농도와 가져온: αKAO에서 Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1.35 mg/mL; C. pinensis, UniProtKB ID에서에서 αKAO: C7PLM6 (KDO2), 2.29 mg/mL; PLP-Dc에서 S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), 셀 무료 12.44 mg/mL;에서 총 효소 추출 PLP-DC에서 C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCCpin), 2.62 mg/mL.
2입니다. 솔루션의 준비
참고: 아래의 모든 솔루션 이온된 수에 준비가 되어 있습니다.
- HEPES 버퍼, pH 7.5;의 1 M를 준비 5 m NaOH의 조정.
참고: pH 조정 단계 동안 얼굴 보호 (P280), 눈 보호, 보호복, 보호 장갑 착용. 눈 (P338 P305, P351,)와 접촉, 여러 분 제거 콘택트 렌즈 가능 하면 물으로 조심 스럽게 씻어. 세 정을 계속 하 고 즉시 독극물 센터나 의사 (P310) 전화. P 코드 예방 문 참조 (위험 클래스 및 카테고리; 참조, 예를 들어, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/). - 100 m m L-리 신, 100 mM (5S) 준비-hydroxy-L-리 신, 150 m m α-ketoglutaric 산, 100mm 나트륨 하는데, 10mm 암모늄 iron(II) 황산 염 hexahydrate (모어 소금), 100mm pyridoxal 5-인산 염 (PLP), 및 100 m m dithiothreitol (DTT).
- 1 M, 2 M, 그리고 37 %HCl 솔루션 (approximatively 12 M 솔루션), 염 산 (HCl)의 6 분 2.1에 설명 된 대로 동일한 안전 지침에 따라 준비 합니다.
참고: α-ketoglutaric 산, 나트륨 하는데, 및 암모늄 iron(II) 황산 염 hexahydrate의 솔루션 이루어져야 합니다 신선한 사용 당일. 실 온에서 몇 달 동안 리 솔루션을 저장할 수 있습니다. PLP 솔루션 4 ° c.에 한 달 동안 저장 될 수 있다 DTT 솔루션-20 ° c.에 한 달 동안 저장 될 수 있다
3. 분석 규모 반응
- 5 (R)의 decarboxylation 반응에 대 한 방법 개발-hydroxy-L-리 신
- 11 µ L HEPES 버퍼 pH 7.5의 1 M 솔루션의 추가 (최종 농도 50 m m) 2 mL microtube 하. 다음, 100 mM (5S)의 22 µ L을 추가-hydroxy-L-리 신 (최종 농도 10 m m), 2.2 100mm PLP의 µ L (최종 농도 1 m m), 및 2.2 µ L 100 mM DTT의 (최종 농도 1 m m).
참고: 경우 LDCSrum와 반응, DTT의 추가 필요 하지 않습니다. - 순화 PLP DC를 추가 (최종 농도 0.1 mg/mL). H2O 220 µ L의 최종 볼륨에 대 한 완전 한.
- 3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
참고: 반응 매체의 좋은 산소를 하면 야외에서 열린 뚜껑으로 반응 혼합물을 떨고. 따라서 반응 미디어에 산소 거품 필요가 있다. - 6 단계에 설명 된 반응 모니터링 절차에 따라 분석 반응 혼합물의 10 µ L를 수집 합니다. 샘플은 가급적 derivatized 및 샘플링 후 직접 분석.
- 11 µ L HEPES 버퍼 pH 7.5의 1 M 솔루션의 추가 (최종 농도 50 m m) 2 mL microtube 하. 다음, 100 mM (5S)의 22 µ L을 추가-hydroxy-L-리 신 (최종 농도 10 m m), 2.2 100mm PLP의 µ L (최종 농도 1 m m), 및 2.2 µ L 100 mM DTT의 (최종 농도 1 m m).
- 결합 한 hydroxylation 단계 PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation와 αKAO에 의해 촉매 작용을 미치는 효소 캐스케이드 반응 위한 방법 개발
- 11 µ L HEPES 버퍼 pH 7.5의 1 M의 추가 (최종 농도 50 m m) 2 mL microtube 하. 다음, α-ketoglutaric 산의 150 m m의 22 µ L을 추가 (최종 농도 15 m m), 5.5 µ L의 나트륨 하는데 100 m m의 (최종 농도 2.5 m m), 22 모어의 10 m m의 µ L의 소금 (최종 농도 1 m m), 그리고 L-리 신의 100 m m의 22 µ L (최종 농도 10 m m).
- H2O 단계 3.2.3에서에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려해 220 µ L의 최종 볼륨에 대 한 완전 한.
- 대상된 regioselectivity에 따라 필요한 정화 αKAO 효소 추가: 위치 C-4 L-리 신에 대 한 위치 C-3 또는 KDO2에에서 hydroxylation에 대 한 KDO1. 정제 효소의 최종 농도 (0.05-0.5 mg/mL) 3 h approximatively에 완전 한 변환 수 있도록 결정 했다.
- 3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
- 2.2 µ L PLP의 100 mM의 추가 (최종 농도 ~ 1 m m) 및 DTT의 100 mM의 2.2 µ L (최종 농도 ~ 1 m m).
참고: 경우 LDCSrum와 반응, DTT의 추가 필요 하지 않습니다. - 18 h LDC: 완전 한 변환 사용 농도에 순화 된 PLP DC를 추가Srum 0.1 mg/ml KDO1, 및 DCCpin 0.5 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서 캐스케이드 반응에 대 한 대략적인 최종 농도 KDO2와 캐스케이드 반응입니다.
- 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
- 3.1.4 단계와 모니터링 절차를 실행 합니다.
- PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation와 αKAOs에 의해 촉매 두 hydroxylation 단계를 결합 하 여 효소 캐스케이드 반응 위한 방법 개발
- 단계 3.2.1-3.2.2를 실행 합니다.
- 0.05 mg/mL의 최종 농도에 KDO1를 추가 합니다. 3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
- 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에 KDO2를 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
- 3.2.5 단계를 실행 합니다.
- 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에서 순화 PLP DC DCCpin 을 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
- 3.1.4 단계와 모니터링 절차를 실행 합니다.
4. 반 대리점 한 냄비 Biocatalytic 반응
참고: 효소 반응 노천 250 mL 유리 10 ml 전체 볼륨에 대 한 삼각 플라스 크에에서 0.1 mmol의 L-리 신에 수행 됩니다.
- Monohydroxylated 유도체의 합성
- 1 M HEPES 버퍼, pH 7.5의 0.5 mL을 추가 (최종 농도 50 m m) 플라스 크에. 다음, 100 m L-리 신 m 1 개 mL를 추가 (최종 농도 10 m m), 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m), 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도 1 m m).
- H2O 10 mL, 4.1.3 단계에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려의 마지막 볼륨에 대 한 완전 한.
- 대상된 regioselectivity에 따라 필요한 정화 αKAO 효소 추가: 0.075 m g/l L-리 신의 위치 C-4 0.5 mg/mL의 최종 농도에서 C-3 또는 KDO2 위치에 hydroxylation의 최종 농도에 KDO1. 정제 효소의 최종 농도 3 h approximatively에 완전 한 변환 수 있도록 결정 했다.
- 적절 한 기간 동안 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어. 때 완료 된 hydroxylation 반응 (반응 프로토콜 모니터링에 대 한 6 단계에 자세히 설명 하는 모든 단계를 실행 하는)를 나타냅니다 반응 모니터링, 4.1.5 단계로 진행 합니다. 전형적인 반응 시간은 3 h 이다.
- ΑKAO 반응 혼합물에 100mm PLP의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m). 그런 다음, 100 mM DTT의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m), LDCSrum사용 하는 경우를 제외 하 고.
- 순화 PLP-DC 추가: LDCSrum KDO1 또는 KDO2와 캐스케이드 반응에 대 한 0.5 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서 DCCpin 캐스케이드 반응에 대 한 0.05 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서.
- 실내 온도에, 18 h 300 rpm, 반응 혼합물을 흔들어 고 직접 단계 4.3에에서 대 한 자세한 단계를 계속 합니다.
- Dihydroxylated 유도체의 합성
- 1 M HEPES 버퍼, pH 7.5의 0.5 mL을 추가 (최종 농도 50 m m), 100 m L-리 신 m의 1 mL (최종 농도 10 m m), 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m) 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도가 1 m m). H2O 10 mL, 4.2.2 단계에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려의 마지막 볼륨에 대 한 완전 한.
- 0.075 mg/mL의 최종 농도에 KDO1를 추가 합니다. 적절 한 기간 동안 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
- 때 완료 된 hydroxylation 반응 나타냅니다 반응 모니터링 (프로토콜을 모니터링 하는 반응에 대 한 6 단계 참조), 4.2.5 단계로 진행. 전형적인 반응 시간은 3 h 이다.
- 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL를 추가 (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m), 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도 1 m m).
- 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에 KDO2를 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
- 때 완료 된 dihydroxylation 반응 나타냅니다 반응 모니터링 (프로토콜을 모니터링 하는 반응에 대 한 6 단계 참조), 4.2.7 단계로 진행. 전형적인 반응 시간은 18 h 이다.
- DTT의 100 m m의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m), LDCSrum사용 하는 경우를 제외 하 고.
- 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에서 순화 된 DCCpin 을 추가 합니다.
- 18 h 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
- 냉각
- 얼음 목욕에서 250 mL 유리 삼각 플라스 크를 배치 하 여 반응 혼합물을 식혀.
- 신중 하 게, approximatively 1 분, 0.25 mL 6 M HCl 수동으로 부드럽게 흔들어 냉각된 반응 혼합물의 이상 추가 합니다. 2.1 단계에서 설명한 대로 동일한 안전 지침을 따르십시오.
- 50 mL 원뿔 바닥 원심 분리기로 산 성 혼합물 튜브 전구, 파스퇴르 피 펫 장비는 유리를 사용 하 여 전송 다음 1680 x g와 15 분 동안 4 ° C에서 원심.
- 철회는 상쾌한 고 250 mL 둥근 바닥 플라스 크에 옆으로 계속.
- 펠 릿을 포함 하는 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브에 이온을 제거 된 물 10 mL를 추가 합니다. 다시는 펠 릿을 일시 중단 하는 소용돌이.
- 1680 x g에서 원심 분리기, 4 ° C, 15 분.
- 철회는 상쾌한 고 첫 번째 상쾌한 (4.3.4 단계)를 포함 하 250 mL 둥근 바닥 플라스 크에 추가 합니다.
- 소용돌이, 지속적인 손으로 수집된 supernatants 액체 질소에는 플라스 크의 침수로 고정 하 고 벤치탑 매니폴드 녹고에서 물자를 방지 하기 위해 동결 건조 기에 플라스 크를 즉시 전송.
- 완료 된 후 동결 과정 (야간), 동결 건조 기에서 플라스 크를 제거 합니다.
5. 정화 조 효소 반응 혼합물에서 아미노 알콜의
- 이온 교환 수 지
- 수성 0.1 m HCl (approximatively 4 mL)의 최소 금액에 동결된 제품을 용 해 고체 입자는 더 이상 벌 거 벗은 눈을 볼 수 때까지.
- 방출 대기압에서 1 M HCl (4 열 볼륨) 0.1 뒤 여는 술 폰 산 기능 그룹 양이온 교환 수 지, 유리 열 (20 x 250 m m)에 200-400 메쉬 조건 M HCl (4 열 볼륨; 열 볼륨 10 mL =).
- 신중 하 게 사용 하 여 1000 µ L micropipette 유리 열 벽에 수 지의 상단에 샘플을 로드 합니다. 다음, 린스 조 제품을 포함 하는 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브 세 번 1 mL 0.1 M HCl 용액 당의 세척와 같은 방법으로 열에 결과 린스 볼륨을 로드.
- 비-선형으로 elute 그라데이션: 4 열 양의 0.1 M HCl, 4 열 양의 물, 4 열 양의 5% NH4오, 4 열 양의 10% NH4오, 4 열 양의 15% NH4오, 4 열 양의 20% NH4오 4 열 양의 25% NH4오 및 마지막으로 4 열 28% NH4오의.
- HPLC에 의해 정화 모니터링 (6 단계 참조).
- 수영장 분수 화합물 (NH4오 20-28%)를 포함 하 고 단계 4.3.8-4.3.9에 설명 된 대로 freeze-dry.
참고: 이온 교환 열 이온 물 차입 물 (approximatively 50 mL) 1 m HCl의 50 mL와 함께 방출 하 여 가공 뒤의 중립화로 차입 후 다시 수 있습니다.
- SPE
- H3포4/water (20 µ L/mL)의 2 ml approximatively 동결된 화합물 solubilize
- 장소는 혼합된 모드 양이온 교환 SPE 6 mL-카트리지 추출 매니폴드에 물 펌프에 연결. 매니폴드에서 제공 하는 감압에서 메탄올의 조건 4 mL를 통해 여 카트리지. H3의 4 mL를 통해 포4/water (20 µ L/mL) 여 카트리지를 equilibrate.
- 유리 열 벽에 수 지의 상단에 1000 µ L micropipette를 사용 하 여 카트리지에 샘플을 로드 하 고 세 번 세척 당 H3포4/water (20 µ L/mL)의 0.75 mL와 함께 제품을 포함 하는 유리병을 씻어. 같은 방법으로 열에 결과 린스 볼륨을 로드 합니다.
- 매니폴드, 2%의 4 mL를 제공한 감소 압력 방출 하 여 카트리지를 씻어 HCOOH 물, 그리고 물 4 mL와 함께. NH4물에서 오의 그라데이션으로 elute (4% NH4오에서에서 시작 각 차입에 대 한 4 mL: 10%, 15%, 15%, 20%, 및 28%).
- 6 단계에 설명 된 프로토콜을 모니터링 하는 반응에 따라 각 분수를 분석 하 여 HPLC에 의해 정화를 모니터링 합니다. 자외선 (UV) 크로마에 따르면 순수 원하는 파생 상품을 포함 하는 모든 분수를 유지 하 고 5.2.6 단계로 진행.
- 수영장 원하는 포함 된 분수 100 mL 둥근 바닥 플라스 크에 복합, 물으로 분수를 포함 하는 튜브를 헹 구 고 린스 볼륨 100 mL을 추가 둥근 바닥 플라스 크.
- 40 ° C에서 온도 물 목욕 주전자를 장착 하 고 10 mbar에서 진공 펌프에 연결 된 회전 증발 기를 사용 하 여 감소 압력에서 용 매를 제거 합니다.
- 물의 최소 볼륨에서 솔리드를 solubilize 고 무게 25 mL 둥근 바닥 플라스 크에 솔루션을 전송. 린스 물 최소 볼륨으로 플라스 크 25 mL 플라스 크에 린스 볼륨을 추가 하 고 5.2.9 단계로 진행.
- 정화 제품 무게 하 고 수익률을 계산 합니다.
- 고체 입자는 더 이상 벌 거 벗은 눈을 볼 수 때까지 2 m HCl의 최소 볼륨에서 정화 제품을 녹이 고 단계 4.3.8-4.3.9에 설명 된 대로 freeze-dry.
참고: 아미노 알콜 민감한 화합물 및 그들의 염 산 염 소금으로 유지 됩니다.
6. 반응 모니터링 및 제품 분석
- 기판 및 HPLC 분석에 앞서 제품의 derivatization
참고: 기판 및 제품 증가 그들의 UV 컬럼에 detectivity 방향족 유도체로 derivatized를 해야 합니다. 1-플 루 오로-2, 4-dinitrobenzene (DNFB) 사용 했습니다. 각 샘플은 derivatization 직후는 HPLC에 주입 했다.- 효소 반응 및 전송의 10 µ L 1.5 mL microtube 가져가 라. 에탄올에 0.25 m NaHCO3 수성 해결책의 10 µ L, 에탄올, 100 µ L 및 DNFB 솔루션의 2.5 mg/mL의 30 µ L를 추가 합니다.
- microtube 닫고 1000 rpm에서 65 ° C에서 1 시간에 대 한 결과 솔루션을 흔들어. 10 µ L로 끄다 1 M HCl의.
- 0.22 μ m 기 공 크기 친수성 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막 1 mL 루어 주사기를 사용 하 여 4 m m 직경 비 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링.
- Derivatized 아미노산 분리의 모든 시스템을 사용 하 여 dioxygenase 반응의 모니터링을 수행 합니다. 이 프로토콜 dinitrobenzene (DNB) 발 색 단 그룹27여 derivatized 아미노산의 자외선 탐지를 포함 한다.
- 유통 silyl endcapping 반전된 단계 열 (5 µ m, 3 x 150 m m)와 C18와 HPLC를 맞습니다.
- (과) eluent B C18 열 equilibrate (MeCN + 0.1 %TFA) eluent A (H2O + 0.1 %TFA) (approximatively 20 열 볼륨에 해당) 15 분 동안 35 ° C의 1 mL/min 흐름 속도로.
- 10 µ L derivatized 반응 혼합물의 주입 (단계 6.1 참조) HPLC C18 열에. MeCN, 0.1 %TFA / H2O와 0.1%의 혼합물을 사용 하 여 선형 그라데이션으로 eluent로 TFA (9 분, 온도 35 ° C에에서과 하 비과 흐름 1 mL/min).
- UV 탐지 400 설정을 사용 하 여 크로마 열에 eluted 제품 분석 nm. DNB lysine은 일반적으로 약 6.5 분, hydroxylated DNB-신 약 5.5 분, DNB-신 약 4.2 분, dihydroxylated 및 DNB-aminodiol 약 5.3 분을 elutes.
7. NMR 분석의 정화 아미노 알콜
- D2O 정화 아미노 알콜 분해 (700 µ L) 핵 자기 공명 (NMR) 튜브를 솔루션을 전송.
- 1H 및 13C NMR 스펙트럼에 따라 적절 한 NMR 시설 프로토콜28습득.
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Representative Results
우리가 이전에 보고 된 합성의 모노-및 디-hydroxy-L-lysines diastereoselective 효소 hydroxylation 철 (II)의 dioxygenases에 의해 촉매에 의해 / αKAO 가족 (그림 1)16. PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation 단계 뒤는 αKAO에 의해 촉매는 하나 또는 두 개의 hydroxylation 단계를 결합 하는 여기, 전체 폭포의 프로토콜 최적화 반응 조건 모두의 요구 사항을 충족 조정 되었다 효소 반응입니다. 우리는 두 개의 Dc, LDCSrum 및 DCCpin, 상용 (5R)으로 활동을 조사 하 여 시작-hydroxy-L-리 신. 다음 우리는 적절 한 αKAO에 의해 촉매 산화 단계 캐스케이드에서 모노 파생 상품, 3-hydroxy-L-라이 신 (1) 및 4-hydroxy-L-라이 신 (2) 쪽으로 DC 활동 분석. 표 1 은 모노-hydroxy-L-lysines의 biocatalytic decarboxylations의 결과 제공합니다. 변환 후 해당 DNB 주고 DNFB로 반응 혼합물의 derivatization derivatized 기판 및 제품 HPLC에 의해 측정 되었다.
항목 | 기판 | PLP-DC | 제품 | 변환 |
1 | (5R)-hydroxy-L-리 신 | LDCSrumb) | 4 | 100% |
2 | (5R)-hydroxy-L-리 신 | DCCpinb) | 4 | 노스다코타 |
3 | 1 는) | LDCSrumb) | 5 | 100% |
4 | 1 는) | DCCpinb) | 5 | 29% |
5 | 2 는) | LDCSrumc) | 6 | 60% |
6 | 2 는) | DCCpinc) | 6 | 100% |
표 1: monohydroxy-L-lysines의 Biocatalytic decarboxylation. 반응 조건: 기판 (10 m m), PLP-DC (0.1 0.15 mg mL-1), HEPES (50mm, pH 7.5), 버퍼 PLP (1mm), DTT (1 mM; 하지 사용 LDCSrum), 하룻밤, RT, 300 rpm. (a) 합성 효소 에 해 라. (b) 0.1 mg/mL. (c) 0.15 mg/mL; 노스다코타: 인식 되지 않음
S. rumirantium (LDCSrum)에서 DC 최고의 변환의 3-및 5-파생 상품 해당 랄 hydroxy 디 (항목 1, 3, 및 5)에 모든 모노 hydroxy lysines로 활동 전시. 예상 했던 대로, DCCpin, αKAO 게놈 컨텍스트 DC 판명 (4R)의 decarboxylation에 대 한 가장 적합 한-hydroxy-L-라이 신 (2) (6 항목). 표준 반응에서 조건 (3S)의 변환-hydroxy-L-decarboxylated 대응 (5) DCCpin 와 리 (1) 낮은 (4 항목), 그리고 아무 활동 했다 (5R)으로 관찰 되었다- hydroxy-L-리 신 (항목 2).
마지막으로, 우리 디-hydroxy-L-리 신 파생 상품 3, 8, 및 9는 두 개의 Dc의 활동, KDO1, KDO2, 또는 2의 조합에 의해 촉매는 하나 또는 두 개의 hydroxylation 단계에 의해 원래의에 합성 (그림 2).는 디-hydroxy-L-lysines의 biocatalytic decarboxylation의 결과 표 2에 요약 되어 있습니다.
항목 | 기판 | PLP-DC | 제품 | 변환 |
1 | 3 | LDCSrumb) | 7 | 노스다코타 |
2 | 3 | DCCpinb) | 7 | 100% |
3 | 8 는) | LDCSrumb) | 10 | 19% |
4 | 8 는) | DCCpinb) | 10 | 12% |
5 | 9 는) | LDCSrumc) | 11 | 노스다코타 |
6 | 9 는) | DCCpinc) | 11 | 노스다코타 |
표 2: dihydroxy-L-lysines의 Biocatalytic decarboxylation. 반응 조건: 기판 (10 m m), PLP-DC (0.1 0.15 mg/mL), HEPES (50mm, pH 7.5), 버퍼 PLP (1mm), DTT (1 mM; 하지 사용 LDCSrum), 하룻밤, RT, 300 rpm. (a) 합성 효소 에 해 라. (b) 0.1 mg/mL. (c) 0.15 mg/mL; 노스다코타: 인식 되지 않음.
Dihydroxy-L-lysines 3, 8및 9의 decarboxylation에 관한 결과 완전히 만족 되지 않았습니다. 표준 반응 조건에서만 (3R, 4R)-dihydroxy-L-리 (3) 양적 해당 dihydroxy diamine 7 로 개조 되었다 (항목 1-2). 4, 5-dihydroxy 패-리 신 (8)의 변환 이었다 보통 (항목 3-4) 하지만 그것은 크게 효소 로드 증가 의해 향상 될 수 지적 가치. 두 개의 테스트 PLP-Dc의 3, 5-dihydroxy 패-리 신 (9) (항목 5-6)으로 활성 발견 됐다.
HPLC를 모니터링 하 여 결정으로 양적 변환 전시 효소 폭포 반응 (그림 4) 수평 성공적으로.
그림 4: 3 단계 효소 폭포에 대 한 대표적인 분석 데이터. (A) HPLC 모니터링 biocatalytic L-리 신으로 변환 (R,R3 2)-1, 5-diaminopentan-2, 3-diol (7). RT = 보존 시간. (B) 1H NMR 및 (C) 13C NMR의 정화 후 아미노 알코올 (7). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
여기에 소개 하는 정화 프로토콜 복잡 한 효소 반응 혼합물에서 아미노 알콜의 효율적인 추출 수 있습니다. 아미노 알콜 4, 5, 6및 7 우수한 수익률 (그림 5)에서 얻은 했다.
그림 5: 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 폭포. 합성 (R)-1, 5-diaminopentan-2-ol (4), (S)-1, 5-diaminopentan-2-ol (5), 1, 5-diaminopentan-3-ol (6), 및 (R,R3 2)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (7). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
카이 랄 아미노 알콜 및 파생 상품 유기 합성 제약 치료에 대 한 카이 랄 조력자에서 응용 프로그램의 넓은 범위가 있다. 아미노 알콜 기존의 유기 합성에 의해 생산을 위한 다단계 합성 수많은, 하지만 않을 수 있습니다 항상 효율적인 입체 화학16의 민감한 컨트롤과 함께 지루한 보호/deprotection 단계. Biocatalytic 접근 보호/deprotection 단계 dispenses 이며 일반적으로 매우 stereoselective 좋은 대안을 나타냅니다.
이전 작업 동적 운동 비대칭 변환 (DYKAT)에 의해 2-phenylethan-1-아민의 백본와 다양 한 β-아미노 알콜의 합성을 보고. 이 경로에서 hydroxy 대체 stereogenic 센터 aldolisation benzaldehyde와 파생 상품, 트레오닌 aldolase에 의해 촉매에 의해 소개 되었다. 낮은 diastereoselectivity 및 적당 한 수익률이 첫 번째 단계는 후속 stereospecific decarboxylation enantioenriched 아로마 β-아미노 알콜11,12로 이어지는 L-티로신 DC에서 촉매에 의해 극복 되었다.
우리 보고 여기 쉽게 사용할 수 있는 L-리 신에서 시작 하는 다양 한 아미노 알콜의 합성에 대 한 간단한 프로토콜. 매우 효율적 이지만이 프로토콜 단점 때문에 αKAO와 PLP DC 효소의 범위를 제한 된 기판에서에서 겪고 있다. 그럼에도 불구 하 고, 다양 한 아미노 알콜의 biocatalytic 합성 다른 αKAO 및 아미노산 Dc29,30,,3132의 다른 조합을 사용 하 여 여겨질 수 있다. 그것은 2 단계 순서는 PLP Dc L-리 신으로 활성도 폭포에서 중요 한 지적 가치가 있다. 모든 L-리는 PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation 반응을 실행 하기 전에 첫 번째 산화 단계에서 소비 되도록 주의 해야 합니다. 이 후 발 색 단 에이전트에 의해 반응 미디어의 derivatization HPLC에 의해 반응의 주의 깊은 모니터링을 통해 보장 됩니다. 효소의 높은 기질 농도 낮은 내성을 추가 개발에 대 한 제한 사항입니다. 효소 진화 전략,이 문제를 해결 하기 위해 효소 속성의 기질 농도 허용치33등을 최적화 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 효소 동원 정지 수 효소의 재사용을 보장 하기 위해 간주 됩니다.
이 프로토콜은, 수행 하기 쉬운 그리고 가장 매력적인 기능 중 하나는 정화 단계의 효율성. 우리의 이전 작품에서 복잡 한 효소 반응 혼합물에서 극 지 분자의 직접 추출 문제가 되었고 소수 그룹에 의해 화합물의 derivatization는 필요한16. 아미노 알콜 직접 정화 derivatization 없이 반응에서 광범위 한 작업이 필요합니다. 이 프로토콜에서 고체 상 추출 및 이온 교환 수 지를 결합 하는 2 단계 정화 절차 글리세롤 (효소 솔루션에 포함 된)를 제거 하 고 HEPES, 버퍼의 그들에 가까운 물리 화학 특성을 가진 2 개의 극 지 분자는 아미노 알콜을 대상으로 어렵고 따라서 이들이 혼합물에서 분리. 이 정화 프로토콜 효소 반응에서 그와 같은 복잡 한 반응 혼합물에서 다양 한 극 지 분자의 추출에 대 한 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 유익한 토론에 대 한 베로 니 크 드 Berardinis와 알랭 Perret, 크리스틴 Pellé, 및 기술 지원에 대 한 페 기 Sirvain 감사합니다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
(5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
Ethanol | VWR | 20825.290 | |
Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
Formic acid | Acros | 270480010 | |
Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
300 MHz spectrometer | Bruker | ||
2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
References
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