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Chemistry

Réactions de Cascade enzymatique pour la synthèse des aminoalcools chiraux de L-lysine

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/56926
Automatic Translation
1, 1, 1
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

Summary

Aminoalcools chiraux sont des molécules polyvalents pour une utilisation comme échafaudages en synthèse organique. A partir de L-lysine, synthétiser des aminoalcools par une réaction enzymatique cascade combinant diastéréosélective Cabay oxydation catalysée par dioxygénase suivie d’un clivage de la portion d’acide carboxylique de l’acide aminé hydroxyle correspondant par un décarboxylase.

Abstract

Aminés alcools sont des composés polyvalents avec un large éventail d’applications. Par exemple, ils ont servi comme échafaudages chiraux en synthèse organique. Leur synthèse par classiques de chimie organique nécessite souvent des processus de synthèse à plusieurs étapes fastidieuses, avec contrôle difficile du résultat stéréochimique. Nous présentons un protocole enzymatiquement synthétiser des alcools aminés à partir de la L-lysine facilement disponible en 48 h. Ce protocole combine deux réactions chimiques qui sont très difficiles à mener en synthèse organique classique. Dans la première étape, la régio - et diastéréosélective l’oxydation d’une liaison C-H non activée de la lysine chaîne latérale est catalysée par une dioxygénase ; un deuxième régio - et diastéréosélective d’oxydation catalysée par une dioxygénase regiodivergent peut conduire à la formation des 1, 2-diols. Dans la dernière étape, le groupe carboxylique de l’acide aminé alpha est clivé par une décarboxylase de phosphate de pyridoxal (PLP) (DC). Cette étape décarboxylante affecte uniquement le carbone alpha de l’acide aminé, en conservant le centre stéréogène hydroxy substitué en position bêta/gamma. Les aminoalcools qui en résultent sont donc optiquement enrichis. Le protocole a été appliqué avec succès à la synthèse de quatre aminoalcools semipreparative-échelle. Surveillance des réactions a été réalisée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) après dérivatisation par 1-fluoro-2, 4-dinitrobenzène. Simple purification par extraction en phase solide (SPE) accordée les aminoalcools avec d’excellents rendements (93 % de > 95 %).

Introduction

Malgré les avantages offerts par biocatalyse, l’intégration des étapes biocatalytiques de voies synthétiques ou itinéraires biocatalytiques totales reste essentiellement limitée aux résolutions cinétiques enzymatiques. Ces itinéraires ont été largement utilisés dans un premier temps en synthèse asymétrique de chimio-enzymatique, mais biocatalyse offre beaucoup plus de possibilités dans le groupe fonctionnel interconversions avec grande stéréosélectivité1,2,3 . En outre, comme réactions biocatalytiques sont déroulent dans des conditions similaires, il est donc possible d’effectuer des réactions de la cascade dans un seul récipient fashion4,5.

Aminoalcools chiraux sont des molécules polyvalents pour une utilisation comme auxiliaires ou des échafaudages en synthèse organique6. La portion d’alcool aminé est fréquemment trouvée dans les métabolites secondaires et dans les ingrédients pharmaceutiques actifs (API). Β-aminoalcools primaires sont facilement disponibles auprès des acides α-aminés correspondantes par synthèse chimique conventionnelle, mais l’accès à γ-aminoalcools chiraux ou aminoalcools secondaires nécessite souvent fastidieux parcours synthétiques ainsi que de sensibles contrôle de la stéréochimie7,8,9,10. En raison de sa grande stéréosélectivité, biocatalyse peut fournir une voie de synthèse supérieure à ces briques chiraux11,12,13,14.

Nous avons déjà indiqué la synthèse des mono - et di-hydroxy-L-lysines par diastéréosélective hydroxylation enzymatique catalysée par dioxygénases du fer (II) / dépendante de le α-cétoacide famille oxygénase (αKAO) (Figure 1)15. En particulier, à partir de L-lysine, le KDO1 dioxygénase catalyse la formation du (3S) - dérivé hydroxylé (1), tandis que les 4R- dérivé (2) est formé par la réaction avec KDO2 dioxygénase. Hydroxylations successives regiodivergent par KDO1 et KDO2 conduisent à la formation des (3R, 4R) - dihydroxy - L-lysine (3) sous forme optiquement pure. Cependant, la gamme limitée de substrat de ces enzymes empêche leur grande utilisation en synthèse chimique, en particulier dans l’hydroxylation des amines simples, une portion d’acide carboxylique en position α du groupe amino est essentielle pour l’activité16.

Figure 1
Figure 1 : conversions biocatalytiques de L-lysine. Conversion en (3S) - hydroxy - L-lysine (1) catalysée par la KDO1 dioxygénase ; (4R)- hydroxy - L-lysine (2) catalysée par KDO2 dioxygénase ; et 3R, 4R- dihydroxy - L-lysine (3) par réaction en cascade catalysée successivement par KDO1 et KDO2 dioxygénases. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Décarboxylation est une réaction commune au métabolisme17. En particulier, les acides aminés DCs (EC 4.1.1) sont exemptes de cofacteur (pyruvoyl-dépendante) ou enzymes PLP-dépendantes et catalyser la décarboxylation des acides aminés dans les polyamines correspondants chez les bactéries et supérieur organismes18,19 , 20 , 21 , 22. les mono - et dihydroxy composés (Figure 3) 4–7, 10-11 correspondent aux hydroxylés cadavérine, la diamine obtenue par décarboxylation de la L-lysine. La cadavérine est une composante clée pour l’industrie chimique, plus précisément, c’est un composant de polymères polyamide et polyuréthane. Par conséquent, production bio de cette diamine provenant de ressources renouvelables a attiré l’attention comme une alternative à la route à base de pétrole, et divers micro-organismes ont été conçus à cet effet. Dans ces voies métaboliques, lysine DC (PMA) est l’enzyme clé. PMA est une enzyme dépendante du PLP, appartenant à la famille alanine racémase (AR) structurel23. Les contrôleurs de domaine de PLP-dépendantes (PLP-DCs) sont connus pour être fortement axée sur le substrat. Cependant, quelques enzymes possèdent la capacité de la promiscuité légère, étant actif vers acides aminés aussi bien L-lysine et L-ornithine, comme par exemple la PMD à partir de Selenomonas rumirantium (LDCSrum), qui a des constantes cinétiques similaires pour lysine et ornithine décarboxylation24,25. Ce substrat étendu spécificité fait cette enzyme un bon candidat pour la décarboxylation des mono - et di-hydroxy-L-lysine. En outre, pour trouver DCs active vers les dérivés hydroxyles de lysine, nous avons examiné le contexte génomique des gènes codant les enzymes αKAO. En effet, dans les génomes procaryotes les gènes codant les enzymes impliquées dans la biosynthèse des même sont généralement conjointement localisés dans des groupes de gènes. Le gène KDO2 (à partir de Chitinophaga pinensis) a été trouvé Co localisé avec un gène codant putatif PLP-DC (Figure 2). En revanche, aucun gène codant la DC n’a été trouvé en analysant le contexte génomique de la dioxygénase KDO1. La protéine PLP-DC de c. pinensis (DCCpin) fut donc choisie comme un candidat prometteur pour catalyser l’étape de la décarboxylation de la réaction en cascade.

Figure 2
Figure 2 : contexte génomique du gène KDO2 dans c. pinensis. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Par conséquent, nous avons conçu des réactions enzymatiques cascade dioxygénases et DCs pour réaliser la synthèse d’alcools aliphatiques chiraux β - et γ-amino acides aminés (Figure 3). Comme indiqué précédemment, l’oxydation de C-H, catalysée par la αKAO introduit le centre stéréogène substituant hydroxy avec diastéréosélectivité total ; la chiralité Cβ/γ est préservée dans l’étape décarboxylante, qui affecte uniquement le carbone Cα des acides aminés portion16.

Figure 3
Figure 3 : analyse rétrosynthétique. Retrosynthesis (A) de β - et γ-aminoalcools (R) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (4) (5R) - hydroxy - L-Lysine et le (S) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (5) et 1, 5-diaminopentan-3-ol (6) de L-lysine. (B) Retrosynthesis de β, γ et β, δ-amino diols (2S, 3S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-diol (10) et (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2, 4-diol (11) à partir de (5R)- hydroxy-L-lysine et 2R, 3R- 1,5 - diaminopentane-2, 3-diol (7) à partir de L-lysine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

À partir de L-lysine et ses 5R-dérivé hydroxylé, nous rapportons ici un deux/trois étape, un pot, procédure enzymatique combinant dioxygénases et PLP-DCs pour obtenir la cible aminoalcools. Avant la synthèse à l’échelle du laboratoire des molécules cibles, la méthode a été développée à l’échelle analytique pour ajuster les conditions de réaction, par exemple, les concentrations de l’enzyme, nécessaires pour permettre la conversion complète de produits de départ ; Nous présentons cette procédure aussi bien.

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Protocol

1. préparation enzymatique

  1. Express et purifier les protéines comme décrit précédemment26.
    Remarque : Les protéines recombinantes ont été obtenus avec les concentrations finales suivantes : αKAO Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID : C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL ; ΑKAO de c. pinensis, UniProtKB ID : C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL ; PLP-DCs de S. rumirantium, UniProtKB ID : O50657 (LDCSrum), cellule libre extrait avec de l’enzyme totale à 12,44 mg/mL ; PLP-ms du c. pinensis, UniProtKB ID : C7PLM7 (DCCpin), 2,62 mg/mL.

2. préparation des Solutions

Remarque : Toutes les solutions ci-dessous sont préparées dans l’eau désionisée.

  1. Préparer 1 M d’un tampon HEPES, pH 7.5 ; ajuster avec 5 M de NaOH.
    NOTE : Lors de l’étape de réglage pH, porter des gants de protection, vêtements de protection, lunettes de protection et protection du visage (P280). En cas de contact avec les yeux (P305, P351, P338), rincer avec précaution à l’eau pendant plusieurs minutes enlever lentilles de contact si possible. Continuer à rincer et appeler immédiatement un centre antipoison ou un médecin (P310). Le code P renvoie à la déclaration de précaution (risque de classe et catégorie ; voir, par exemple, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
  2. Préparer 100 mM L-lysine, 100 mM (5S) - hydroxy - L-lysine, acide α-cétoglutarique 150 mM, ascorbate de sodium 100 mM, 10 mM d’ammonium, sulfate de fer (II) hexahydrate (sel de Mohr), 100 mM 5-phosphate de pyridoxal (PLP) et 100 mM le dithiothréitol (DTT).
  3. Préparer 1 M, 2M et 6M d’acide chlorhydrique (HCl) d’une solution de HCl 37 % (approximativement 12 M solution), suivant les mêmes consignes de sécurité que ceux décrits en 2.1.
    Remarque : Les solutions d’acide α-cétoglutarique, ascorbate de sodium et d’ammonium hexahydrate de sulfate ferreux s’imposent fraîches le jour d’utilisation. La solution de lysine peut être conservée pendant plusieurs mois à température ambiante. La solution PLP peut être conservée pendant un mois à 4 ° C. La solution de la TNT peut être conservée pendant un mois à-20 ° C.

3. analyse à l’échelle des réactions

  1. Élaboration de méthodes pour la réaction de décarboxylation (5R) - hydroxy - L-lysine
    1. Ajouter 11 µL de la solution 1 M d’HEPES tampon pH 7,5 (concentration finale de 50 mM) à un microtube 2 mL. Puis, ajouter 22 µL de 100 mM (5S) - hydroxy - L-lysine (concentration finale 10 mM), 2,2 µL de 100 mM PLP (concentration finale de 1 mM) et 2,2 µL de 100 mM DTT (concentration finale 1 mM).
      Remarque : Dans le cas de la réaction avec le LDCSrum, l’ajout de la TNT n’est pas nécessaire.
    2. Ajouter le PLP-DC purifié (concentration finale de 0,1 mg/mL). Complet avec H2O pour un volume final de 220 µL.
    3. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert en plein air, à 300 tr/min pendant 3 h.
      NOTE : Secouer le mélange réactionnel avec un couvercle ouvert en plein air assure une bonne oxygénation du milieu réactionnel. Il n’est donc pas nécessaire bulles d’oxygène dans le milieu réactionnel.
    4. Prélever 10 µL du mélange réactionnel pour être analysés selon la procédure de suivi de réaction décrite à l’étape 6. Les échantillons sont de préférence dérivatisés et analysés directement après le prélèvement.
  2. Élaboration de méthodes pour la réaction de cascade enzymatique combinant une étape d’hydroxylation catalysée par αKAO avec décarboxylation catalysée par PLP-DC
    1. Ajouter 11 µL de 1 M de HEPES tampon pH 7,5 (concentration finale de 50 mM) à un microtube 2 mL. Puis, ajouter 22 µL de 150 mM de l’acide α-cétoglutarique (concentration finale 15 mM), 5,5 µL de 100 mM d’ascorbate de sodium (concentration finale 2,5 mM), 22 µL de 10 mM de Mohr de sel (concentration finale de 1 mM) et 22 µL de 100 mM de L-lysine (concentration finale 10 mM).
    2. Complet avec H2O pour un volume final de 220 µL, compte tenu du volume de la solution d’enzyme à être ajouté à l’étape 3.2.3.
    3. Ajoutez l’enzyme requis αKAO purifiée selon la régiosélectivité ciblée : KDO1 pour l’hydroxylation en position C-3 ou KDO2 poste C-4 de L-lysine. La concentration finale de l’enzyme purifiée (0,05 à 0,5 mg/mL) a été déterminé permettre une conversion complète à environ 3 h.
    4. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert en plein air, à 300 tr/min pendant 3 h.
    5. Ajouter 2,2 µL de 100 mM du PLP (concentration finale ~ 1 mM) et 2,2 µL de 100 mM de la TNT (concentration finale ~ 1 mM).
      Remarque : Dans le cas de la réaction avec le LDCSrum, l’ajout de la TNT n’est pas nécessaire.
    6. Ajouter le PLP-DC purifié à une concentration qui permet une conversion complète à 18 h: LDCSrum à une concentration finale approximative de 0,1 mg/mL pour la réaction en cascade avec KDO1 et DCCpin à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL pour les réaction en cascade avec KDO2.
    7. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert à l’air libre à 300 tr/min pendant 18 h.
    8. Exécuter une procédure de suivi comme au point 3.1.4.
  3. Élaboration de méthodes pour la réaction de cascade enzymatique combinant deux étapes d’hydroxylation catalysées par αKAOs avec décarboxylation catalysée par PLP-DC
    1. Exécutez les étapes 3.2.1-3.2.2.
    2. Ajouter KDO1 à une concentration finale de 0,05 mg/mL. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert en plein air, à 300 tr/min pendant 3h.
    3. Ajouter KDO2 à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL, calculée d’après le volume de la réaction initiale. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert en plein air, à 300 tr/min pendant 18 h.
    4. Exécutez l’étape 3.2.5.
    5. Ajouter la purifiée PLP-DC DCCpin à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL, calculée d’après le volume de la réaction initiale. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert en plein air, à 300 tr/min pendant 18 h.
    6. Exécutez la procédure de suivi comme au point 3.1.4.

4. semi-préparative monotope réactions biocatalytiques

Remarque : Les réactions enzymatiques sont réalisées sur 0,1 mmol de L-lysine dans un verre en plein air 250 mL fiole Erlenmeyer pour un volume total de 10 mL.

  1. Synthèse des dérivés monohydroxylated
    1. Ajouter 0,5 mL de tampon HEPES de 1 M, pH 7,5 (concentration finale de 50 mM) dans le ballon. Ensuite, ajouter 1 mL de 100 mM de L-lysine (concentration finale 10 mM), 1 mL d’acide α-cétoglutarique 150 mM (concentration finale 15 mM), 0,25 mL d’ascorbate de sodium 100 mM (concentration finale 2,5 mM), et sel de 1 mL de 10 mM Mohr (concentration finale de 1 mM).
    2. Complet avec H2O pour un volume final de 10 mL, en tenant compte du volume de la solution d’enzyme à être ajouté à l’étape 4.1.3.
    3. Ajoutez l’enzyme requis αKAO purifiée selon la régiosélectivité ciblée : KDO1 à une concentration finale de 0,075 mg/mL d’hydroxylation en position C-3 ou KDO2 à une concentration finale de 0,5 mg/mL pour le poste C-4 de L-lysine. La concentration finale de l’enzyme purifiée a été déterminée pour permettre une conversion complète à environ 3 h.
    4. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante à 300 tr/min pendant la durée appropriée. Lorsque le contrôle de la réaction indique une réaction d’hydroxylation dûment rempli (exécuter toutes les étapes décrites dans l’étape 6 pour la réaction de protocole de surveillance), passer au point 4.1.5. Un temps de réaction typique est de 3 h.
    5. Ajouter 100 µL de 100 mM PLP dans le mélange réactionnel de αKAO (concentration finale ~ 1 mM). Puis, ajouter 100 µL de 100 mM DTT (concentration finale ~ 1 mM), sauf quand on utilise la LDCSrum.
    6. Ajouter purifiée PLP-DC : LDCSrum à une concentration finale approximative de 0,05 mg/mL pour la réaction en cascade avec KDO1 ou DCCpin à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL pour la réaction en cascade avec KDO2.
    7. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, 300 tr/min, pour 18 h et continuer directement vers les étapes détaillées dans l’étape 4.3.
  2. Synthèse d’un dérivé dihydroxylé
    1. Ajouter 0,5 mL de tampon HEPES de 1 M, pH 7,5 (concentration finale de 50 mM), 1 mL de 100 mM de L-lysine (concentration finale 10 mM), 1 mL d’acide α-cétoglutarique 150 mM (concentration finale 15 mM), 0,25 mL d’ascorbate de sodium 100 mM (concentration finale 2,5 mM) , et sel de 1 mL de 10 mM Mohr (concentration finale de 1 mM). Complet avec H2O pour un volume final de 10 mL, en tenant compte du volume de la solution d’enzyme à être ajouté à l’étape 4.2.2.
    2. Ajouter KDO1 à une concentration finale de 0,075 mg/mL. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, à 300 tr/min pour la durée appropriée.
    3. Lorsque le suivi de la réaction indique une réaction d’hydroxylation dûment rempli (Voir l’étape 6 pour la réaction de protocole de surveillance), passez à l’étape 4.2.5. Un temps de réaction typique est de 3 h.
    4. Ajouter 1 mL d’acide α-cétoglutarique 150 mM (concentration finale 15 mM), 0,25 mL d’ascorbate de sodium 100 mM (concentration finale 2,5 mM), et sel de 1 mL de 10 mM Mohr (concentration finale de 1 mM).
    5. Ajouter KDO2 à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL, calculée d’après le volume de la réaction initiale. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante à 300 tr/min pendant 18 h.
    6. Lorsque le suivi de la réaction indique une réaction dihydroxylation dûment rempli (Voir l’étape 6 pour la réaction de protocole de surveillance), passez à l’étape 4.2.7. Un temps de réaction typique est de 18 h.
    7. Ajouter 100 µL de 100 mM de la TNT (concentration finale ~ 1 mM), sauf quand on utilise la LDCSrum.
    8. Ajouter la purifiée DCCpin à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL, calculée d’après le volume de la réaction initiale.
    9. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante à 300 tr/min pendant 18 h.
  3. Trempe
    1. Refroidir le mélange réactionnel en plaçant le verre de 250 mL fiole Erlenmeyer dans un bain de glace.
    2. Ajouter délicatement, pendant environ 1 min, 0,25 mL de HCl de 6 M en le secouant manuellement doucement le mélange réactionnel refroidi. Suivez les mêmes instructions de sécurité que ceux décrits à l’étape 2.1.
    3. Transfert le mélange acide dans une centrifugeuse de fond conique de 50 mL tube utilisant un verre pipette Pasteur équipée d’une ampoule, puis centrifuger à 1 680 x g et 4 ° C pendant 15 minutes.
    4. Retirer le surnageant et garder de côté dans un ballon à fond rond 250 mL.
    5. Ajouter 10 mL d’eau désionisée dans le tube à centrifuger conique-fond contenant le culot. Vortex pour remettre en suspension l’extrait concentré.
    6. Centrifuger à 1 680 x g, 4 ° C, pendant 15 minutes.
    7. Retirer le surnageant et ajoutez-le à la ballon à fond rond 250 mL contenant le premier surnageant (étape 4.3.4).
    8. Geler les surnageants recueillis par immersion du ballon dans l’azote liquide avec constante main tourbillonnant et transférer le ballon immédiatement vers un collecteur de benchtop lyophilisateur pour éviter que le matériau de la fonte.
    9. Après que le processus de lyophilisation est terminé (la nuit), enlever le ballon de la lyophilisateur.

5. purification des aminoalcools du mélange réactionnel enzymatique brut

  1. Résine échangeuse d’ions
    1. Dissoudre le produit lyophilisé dans le montant minimum de solution aqueuse 0,1 M de HCl (environ 4 mL) jusqu'à ce que les particules solides ne sont plus visibles à le œil nu.
    2. La condition d’une résine échangeuse de cations groupe fonctionnel de l’acide sulfonique, maille de 200-400, dans une colonne de verre (20 x 250 mm) par l’éluant à pression atmosphérique 1 M HCl (volumes de colonne 4) suivie de 0,1 M HCl (4 volumes de colonne ; de la colonne volume = 10 mL).
    3. Charger l’échantillon soigneusement dans la partie supérieure de la résine sur les parois de la colonne de verre à l’aide d’une micropipette 1 000 µL. Ensuite, rincer le tube à centrifuger conique-fond qui contenait le produit brut trois fois avec 1 mL 0,1 M de HCl solution aqueuse par laver et charger les volumes de rinçage qui en résultent sur la colonne de la même manière.
    4. Éluer avec un non-linéaire dégradé : 4 volumes de colonne de 0,1 M HCl, 4 volumes de colonne d’eau, 4 volumes de colonne de 5 % NH4OH, 4 volumes de colonne de 10 % NH4OH, 4 volumes de colonne de 15 % NH4OH, 4 volumes de colonne de 20 % NH4OH , 4 volumes de colonne 25 % NH4OH et enfin 4 volumes de colonne de 28 % NH4OH.
    5. Surveiller la purification par HPLC (voir étape 6).
    6. Mettre en commun les fractions contenant le composé (NH4OH 20-28 %) et Freeze-Dry comme décrit dans les étapes 4.3.8-4.3.9.
      Remarque : La colonne échangeuse d’ions peut être réutilisée après élution avec de l’eau déionisée à la neutralisation de l’eau d’élution (environ 50 mL), suivie de la remise en état par élution avec 50 mL de HCl 1 M.
  2. SPE
    1. Solubiliser le composé lyophilisé dans environ 2 mL d’H3PO4/water (20 µL/mL).
    2. Place une mode mixte échangeuse de cations SPE 6 mL-cartouche sur un collecteur d’extraction raccordé à une pompe à eau. Conditionner la cartouche de dessin par le biais de 4 mL de méthanol sous pression réduite fournie par le collecteur. Equilibrer la cartouche en aspirant à travers 4 mL de H3PO4/water (20 µL/mL).
    3. Charger l’échantillon sur la cartouche à l’aide d’une micropipette µL 1 000 dans la partie supérieure de la résine sur les parois de la colonne de verre et rincer le flacon contenant le produit trois fois avec 0,75 mL de H3PO4/water (20 µL/mL) / cycle de lavage. Charger le volume de rinçage résultant sur la colonne de la même manière.
    4. Laver la cartouche par élution sous pression réduite, fournie par le collecteur, 4 mL de 2 % HCOOH dans l’eau, puis avec 4 mL d’eau. Éluer avec une pente de NH4OH dans l’eau (4 mL pour chaque élution, à partir de 4 % NH4OH : 10 %, 15 %, 15 %, 20 % et 28 %).
    5. Surveiller la purification par HPLC en analysant chaque fraction selon la réaction de surveillance protocole décrit à l’étape 6. Gardez toutes les fractions contenant pur dérivé désiré selon ultraviolet chromatogramme (UV) et passez à l’étape 5.2.6.
    6. Piscine les fractions contenant le composé dans un 100 mL ballon à fond rond, rincer les tubes contenant les fractions avec de l’eau et ajouter le volume de rinçage à la 100 mL autour de ballon.
    7. Éliminer le solvant sous pression réduite, à l’aide d’un évaporateur rotatif équipé d’une bouilloire de bain thermostat à 40 ° C et relié à une pompe à vide à 10 mbar.
    8. Solubiliser le solide dans un volume minimal d’eau et transvaser la solution dans un taré mL 25 ballon à fond rond. Rincer le ballon avec un volume minimal d’eau, ajouter le volume de rinçage dans la fiole de 25 mL et passez à l’étape 5.2.9.
    9. Peser le produit purifié et calculer le rendement.
    10. Dissoudre le produit purifié dans le volume minimal de 2M de HCl jusqu'à ce que les particules solides ne sont plus visibles à le œil nu et lyophiliser tel que décrit dans les étapes 4.3.8-4.3.9.
      Remarque : Les aminoalcools sont des composés sensibles et sont gardés comme leurs chlorhydrates.

6. surveillance et analyse des produits

  1. Dérivation des substrats et des produits avant l’analyse HPLC
    Remarque : Les substrats et les produits doivent être dérivés comme les dérivés aromatiques pour augmenter leur detectivity chromatographique UV. Nous avons utilisé 1-fluoro-2, 4-dinitrobenzène (DNFB). Chaque échantillon est injecté dans la CLHP immédiatement après dérivatisation.
    1. Prendre 10 µL de la réaction enzymatique et le transfert à un microtube 1,5 mL. Ajouter 10 µL de 0,25 M de NaHCO3 solution aqueuse, 100 µL d’éthanol et 30 µL de 2,5 mg/mL de solution DNFB dans l’éthanol.
    2. Fermez le microtube et agiter la solution obtenue pendant 1 h à 65 ° C, à 1 000 tr/min. Étancher avec 10 µL 1 M de HCl.
    3. Filtrer sur un filtre de seringue non stérile diamètre 4 mm membrané 0,22 µm pore taille hydrophile Polyfluorure de vinylidène (PVDF) à l’aide d’une seringue à embout Luer 1 mL.
  2. Effectuer une surveillance de la réaction de dioxygénase en utilisant n’importe quel système capable de séparer des acides aminés dérivés. Ce protocole implique détection UV des acides aminés dérivés par le groupe de chromophore dinitrobenzène (DNB)27.
    1. La CLHP avec C18 dotée d’une colonne en phase inversée triméthyl silyl Capping (5 µm, 3 x 150 mm).
    2. Équilibrer la colonne C18 avec l’éluant (30 : 70) B (MeCN + 0,1 % TFA) d’éluant A (H2O + 0,1 % TFA) à un débit de 1 mL/min et 35 ° C pendant 15 min (correspondant à environ 20 volumes de colonne).
    3. Injecter 10 µL du mélange réactionnel dérivés (voir étape 6.1) sur la colonne CLHP C18. Utilisez un mélange de MeCN, 0,1 % TFA/H2O et 0,1 % TFA comme éluant avec un dégradé linéaire (ratio 30 : 70 à 70 : 30 en 9 min, température de 35 ° C, débit de 1 mL/min).
    4. Utiliser la détection UV fixée à 400 nm pour analyser les produits élués sur la colonne de chromatographie. DNB-lysine élue généralement environ 6,5 min, hydroxylé DNB-lysine autour de 5,5 min, dihydroxylé DNB-lysine environ 4,2 min et DNB-aminodiol environ 5,3 min.

7. RMN analyse des aminoalcools purifiées

  1. Dissoudre les aminoalcools purifiées en D2O (700 µL) et transvaser la solution dans un tube de résonance magnétique nucléaire (RMN).
  2. Acquisition de 1H et les spectres de RMN du 13C 13selon approprié NMR facility protocoles28.

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Representative Results

Nous avons déjà rapporté la synthèse des mono - et di-hydroxy-L-lysines par diastéréosélective hydroxylation enzymatique catalysée par dioxygénases du fer (II) / αKAO famille (Figure 1)16. Afin d’optimiser le protocole des cascades ensemble présenté ici, qui combinent une ou deux étapes d’hydroxylation catalysées par une αKAO suivie d’une étape de décarboxylation catalysée par un PLP-DC, les conditions de réaction ont été ajustées pour satisfaire aux exigences des deux réactions enzymatiques. Nous avons commencé en enquêtant sur les activités des deux contrôleurs de domaine, LDCSrum et DCCpin, vers le disponible dans le commerce (5R) - hydroxy - L-lysine. Puis nous dosés les activités DC vers les dérivés mono, 3-hydroxy-L-lysine (1) et 4-hydroxy-L-lysine (2), en cascade avec l’étape d’oxydation catalysée par le αKAO approprié. Le tableau 1 présente les résultats des biocatalytiques décarboxylations des mono-hydroxy-L-lysines. Les conversions ont été mesurées par HPLC après que dérivatisation du mélange réactionnel avec DNFB pour donner la DNB correspondante dérivatisés substrats et produits.

Entrée Substrat PLP-DC Produit Conversion
1 (5R) - hydroxy - L-lysine LDCSrumb) 4 100 %
2 (5R) - hydroxy - L-lysine DCCpinb) 4 n.d.
3 1 un) LDCSrumb) 5 100 %
4 1 un) DCCpinb) 5 29 %
5 2 un) LDCSrumc) 6 60 %
6 2 un) DCCpinc) 6 100 %

Tableau 1 : décarboxylation BIOCATALYTIQUE de monohydroxy-L-lysines. Conditions de la réaction : substrat (10 mM), PLP-DC (0,1 à 0,15 mg mL-1), HEPES buffer (50 mM, pH 7,5), PLP (1 mM), TNT (1 mM ; non utilisé avec LDCSrum), la nuit, RT, 300 tr/min. (un) synthétisé par voie enzymatique in situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0,15 mg/mL ; n.d. : non détecté

La ms du S. rumirantium (LDCSrum) montre une activité vers tous les lysines hydroxylés mono avec meilleure conversion de dérivés 3 - et 5 pour les diamines correspondantes de hydroxylés chiraux (rubriques 1, 3 et 5). Comme prévu, DCCpin, le contrôleur de domaine du contexte génomique αKAO, s’est avéré être le plus approprié pour la décarboxylation de(4R)- hydroxy - L-lysine (2) (rubrique 6). Dans une réaction standard des conditions de la conversion de (3S) - hydroxy - L-lysine (1) dans son homologue décarboxylé (5) avec DCCpin était faible (entrée 4) et aucune activité n’a été observée vers (5R)- hydroxy-L-lysine (entrée 2).

Enfin, nous avons examiné les activités des deux contrôleurs de domaine vers les dérivés di-hydroxy-L-lysine, 3, 8et 9, synthétisées in situ par une ou deux étapes d’hydroxylation catalysées par la KDO1, KDO2 ou une combinaison des deux (Figure 2). les résultats de la décarboxylation BIOCATALYTIQUE des di-hydroxy-L-lysines sont résumés dans le tableau 2.

Entrée Substrat PLP-DC Produit Conversion
1 3 LDCSrumb) 7 n.d.
2 3 DCCpinb) 7 100 %
3 8 un) LDCSrumb) 10 19 %
4 8 un) DCCpinb) 10 12 %
5 9 un) LDCSrumc) 11 n.d.
6 9 un) DCCpinc) 11 n.d.

Tableau 2 : décarboxylation BIOCATALYTIQUE de dihydroxy-L-lysines. Conditions de la réaction : substrat (10 mM), PLP-DC (0,1 à 0,15 mg/mL), HEPES buffer (50 mM, pH 7,5), PLP (1 mM), TNT (1 mM ; non utilisé avec LDCSrum), la nuit, RT, 300 tr/min. (un) synthétisé par voie enzymatique in situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0,15 mg/mL ; n.d. : non détecté.

Au sujet de la décarboxylation de la dihydroxy-L-lysines 3, 8et 9, les résultats n’étaient pas entièrement satisfaisants. Dans les conditions de réaction standard, seulement (3R, 4R) - dihydroxy - L-lysine (3) on a transformé quantitativement de la correspondante dihydroxy diamine 7 (entrées 1 - 2). La conversion de 4, 5-dihydroxy-L-lysine (8) a été modérée (3-4 entrées), mais il est intéressant de noter que ce pourrait être amélioré en augmentant considérablement le chargement de l’enzyme. Aucun des PLP-DCs testés deux trouvées actif vers 3, 5-dihydroxy-L-lysine (9) (entrées 5-6).

Les réactions de cascade enzymatique présentant une conversion quantitative telle que déterminée par HPLC surveillance ont été avec succès mis à l’échelle vers le haut (Figure 4).

Figure 4
Figure 4 : données analytiques représentatives pour la cascade de trois étapes enzymatique. (A), HPLC suivi de conversion BIOCATALYTIQUE de L-lysine (2R, 3R) - 1, 5 - diaminopentan-2, 3-diol (7). RT = temps de rétention. (B) 1H RMN et (C) 13RMN du 13C d’alcool aminé (7) après purification. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Le protocole de purification présenté ici permet une extraction efficace des alcools aminés du mélange réactionnel enzymatique complexe. Les aminoalcools, 4, 5, 6et 7 ont été obtenus avec d’excellents rendements (Figure 5).

Figure 5
Figure 5 : cascades enzymatiques pour la synthèse des aminoalcools. Synthèse des (R) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (4), (S) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (5), 1,5-diaminopentan-3-ol (6),, et 2R, 3R- 1,5 - diaminopentane-2, 3-diol (7). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dérivés et des aminoalcools chiraux ont un large éventail d’applications, allant des auxiliaires chiraux pour la synthèse organique à la thérapie pharmaceutique. Synthèse en plusieurs étapes de fabrication d’aminoalcools par synthèse organique classique sont nombreux, mais peut ne pas être efficace à cause de mesures de protection/déprotection fastidieux ainsi qu’un contrôle sensible de la stéréochimie16. Une approche BIOCATALYTIQUE qui distribue avec les mesures de protection/déprotection et est généralement très stéréosélective représente une bonne alternative.

Des travaux antérieurs selon la synthèse de la β-aminoalcools diverses avec une colonne vertébrale 2-phenylethan-1-amine transformation asymétrique cinétique dynamique (DYKAT). Sur cet itinéraire, le centre stéréogénique substituant hydroxy a été présenté par aldolisation sur le benzaldéhyde et dérivés, catalysées par une thréonine aldolase. La diastéréosélectivité faible et le rendement modéré de cette première étape ont été surmontés par la décarboxylation stéréospécifique subséquentes catalysée par la L-tyrosine DC, conduisant à enantioenriched β-aminoalcools aromatiques11,12.

Nous avons signalé ci-après un protocole simple pour la synthèse de divers alcools aminés à partir de la L-lysine facilement disponible. Bien que très efficace, ce protocole souffre d’inconvénients en raison des chaînes de substrat limitée des αKAO et enzymes PLP-DC. Néanmoins, BIOCATALYTIQUE synthèse de divers alcools aminés sont envisageables à l’aide de différentes combinaisons d’autres αKAO et les acides aminés DCs29,30,31,32. Il est à noter que l’ordre en deux étapes est essentielle dans la cascade que les PLP-DCs sont également actifs vers la L-lysine. Il faut pour s’assurer que tous la L-lysine est consommée dans la première étape d’oxydation avant d’exécuter la réaction de décarboxylation catalysée par le PLP-DC. Ceci est assuré grâce à un suivi attentif de la réaction par HPLC après dérivatisation du milieu réactionnel par un agent du chromophore. La faible tolérance de l’enzyme à la concentration du substrat haute est une limitation pour poursuivre son développement. Pour répondre à cette question, les stratégies d’évolution enzyme pourrait être utilisé pour optimiser les propriétés enzymatiques, comme substrat concentration tolérance33. En outre, immobilisation d’enzymes sont envisageables pour garantir la réutilisation de l’enzyme.

Ce protocole est facile à réaliser, et une de ses plus belles caractéristiques est l’efficacité de la procédure de purification. Dans notre travail précédent, l’extraction directe de molécules polaires du mélange réactionnel enzymatique complexe était un problème, et dérivation des composés de groupes hydrophobes était nécessaire16. La purification des alcools aminés directement de la réaction sans dérivatisation nécessaires travaux d’envergure. Dans ce protocole, la procédure de purification en deux étapes combinant la résine échangeuse d’ions et l’extraction en phase solide supprime glycérol (contenue dans la solution enzymatique) et tampon HEPES, deux molécules polaires avec les propriétés physiques et chimiques à proximité de ceux de la ciblée des aminoalcools et donc difficile à séparer de ces composés. Ce protocole de purification peut être adapté pour l’extraction de molécules polaires divers mélanges de réaction complexes telles que celles de réactions enzymatiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Véronique de Berardinis pour discussion fructueuse et Alain Perret, Christine Pellé et Peggy Sirvain pour le support technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma Aldrich H3375
L-lysine hydrochloride Sigma Aldrich L5626
(5S)-hydroxy-L-lysine Sigma Aldrich GPS NONH Out sourcing
α-ketoglutaric acid Sigma Aldrich 75892
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate Acros 201370250
Pyridoxal phosphate (PLP) Sigma Aldrich 82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) Sigma Aldrich D0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) Sigma Aldrich D1529
Ethanol VWR 20825.290
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 71631
HCl 37% Sigma Aldrich 435570
HCl 0.1M Fluka 35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acid VWR 153112E
Ammonia 28% VWR 21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83638.32
Formic acid Acros 270480010
Phosphoric acid 85% Acros 201145000
Deuterium oxide Acros 320,710,075
NaOH Sigma Aldrich S5881
C18 HPLC column Phenomenex 00F-4601-Y0
Accela UHPLC System ThermoFisher Scientific
Accela PDA detector ThermoFisher Scientific
4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF Merck SLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip VWR HSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 mesh Sigma Aldrich 217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL Waters 186000776
Extraction manifold Waters WAT200609
Rotary evaporator Büchi 531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus Christ L083302
Micropipette 20 µL Eppendorf 3121000031
Micropipette 100 µL Eppendorf 3121000074
Micropipette 500 µL Eppendorf 3121000112
Micropipette 1000 µL Eppendorf 3121000120
300 MHz spectrometer Bruker
2 mL microtube CLEARLine CL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tube Fischer Scientific 05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23 Fischer Scientific 10353331
100 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL erlenmeyer flask Fischerbrand 15496143

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Aminoalcools chiraux chimie numéro 132 cascade de réaction enzymes dioxygénases décarboxylases biocatalyse
Réactions de Cascade enzymatique pour la synthèse des aminoalcools chiraux de L-lysine
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Fossey-Jouenne, A., Vergne-Vaxelaire, C., Zaparucha, A. Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine. J. Vis. Exp. (132), e56926, doi:10.3791/56926 (2018).

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