Summary
Het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige genomic DNA van tumor weefsels is een essentiële eerste stap voor het analyseren van de genetische veranderingen met behulp van de volgende generatie sequencing. In dit artikel presenteren we een eenvoudige en snelle methode om tumorcellen te verrijken en te verkrijgen intact DNA touch Impressum cytologie specimens.
Abstract
Het is van cruciaal belang om te bepalen van de vogelgriepvirus status in kanker voor beheer en behandeling van specifieke moleculaire gerichte drugs voor kankerpatiënten. In de klinische setting, worden formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels veel gebruikt voor genetische tests. FFPE DNA is echter over het algemeen beschadigd en gefragmenteerd tijdens het proces van de fixatie met formaline. FFPE DNA is daarom soms niet voldoende voor genetische tests vanwege de lage kwaliteit en kwantiteit van DNA. Hier presenteren we een methode van aanraking Impressum Cytologie (TIC) te verkrijgen van genomic DNA van kankercellen, die onder een microscoop kan worden waargenomen. Cel morfologie en kanker cel nummers kan worden geëvalueerd met behulp van TIC exemplaren. Bovendien kan de extractie van DNA genomic van TIC monsters worden voltooid binnen twee dagen. De totale hoeveelheid en de kwaliteit van TIC DNA verkregen met behulp van deze methode was hoger dan die van FFPE DNA. Deze snelle en eenvoudige methode kunt onderzoekers voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige DNA voor genetische tests (bv, volgende generatie sequentie analyse, digitale PCR en kwantitatieve real-time PCR) en aan het verkorten van de doorlooptijd voor het rapporteren van resultaten.
Introduction
Volgende generatie sequencing technologie heeft verstrekt onderzoekers aanzienlijke vooruitgang bij het analyseren van de genoominformatie in genetische variaties, Mendelian ziekte, erfelijke aanleg en kanker 1,2,3 . De kanker genoom Atlas (TCGA) en de internationale kanker genoom Consortium (ICGC) hebben de identificatie van genetische wijzigingen in de verschillende soorten gemeenschappelijk kankers4nagestreefd. Honderden essentiële stuurprogramma kankergenen met succes zijn geïdentificeerd, en sommige van deze moleculen worden gericht voor drug ontwikkeling1,5,6.
In de klinische setting, worden FFPE specimens vaak gebruikt voor pathologische diagnose en moleculaire tests voor verschillende ziekten, waaronder kanker. Echter tijdens de fixatie met formaline, DNA-eiwit of DNA-DNA dwarsbinding optreedt en fragmentatie van DNA wordt geïnduceerd. Dus, FFPE DNA-monsters zijn niet altijd geschikt voor genetische analyse vanwege de lage kwaliteit en kwantiteit van DNA7,8,9. Bovendien duurt het enkele dagen te bereiden FFPE specimens en technische vaardigheid nodig is om te nauwkeurig bereiden de secties. Daarom is het wenselijk een eenvoudige en snelle methode voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige intact DNA te ontwikkelen.
Cytologie is een alternatieve methode voor pathologische diagnose. Cytologische monstervoorbereiding is een eenvoudiger, minder duur en sneller benadering in vergelijking met FFPE voorbereiding10. De TIC-techniek is uitgevoerd op sentinel lymfklieren en marginale weefsels van borstkankerpatiënten voor intraoperatieve snelle diagnose voor enkele jaren11,12. Echter, er zijn weinig rapporten die hebben onderzocht of genomic DNA van hoge kwaliteit kan worden geëxtraheerd uit TIC monsters en gebruikt voor volgende genetische analyse. Cytologische exemplaren zijn vaak gekleurd met Papanicolaou (Pap) of Giemsa-kleuring, en we eerder gemeld dat de hoeveelheid en de kwaliteit van DNA geëxtraheerd uit TIC monsters (vooral Giemsa gebeitste monsters) superieur aan monsters van FFPE zijn weefsels13. Vergeleken met Pap vlekken, heeft Giemsa-kleuring een voordeel in vereisen minder verkleurende procedures. In Pap vlekken, nadat de monsters zijn vaste en gekleurd, moeten zij worden gemonteerd met montage medium (bijvoorbeeld, Malinol) voor het monster inhoud, zoals tumorcellen, normale cellen en ontstekingscellen onder een microscoop te onderscheiden. Als het model van de Pap bereid is zonder de stap van de montage, is het bijna onmogelijk te observeren van de cellen onder een Microscoop, omdat het model wordt gedroogd. Ter vergelijking: Giemsa-kleuring kan worden waargenomen in de gedroogde staat, dus de montage stap is niet nodig voor snelle cellulaire evaluatie. Voor microdissection is Giemsa-kleuring geschikter omdat droge exemplaren.
In dit verslag, we voeren een eenvoudige en snelle methode voor het voorbereiden van de TIC exemplaren met Giemsa-kleuring en aantonen dat TIC een betere bron voor DNA in vergelijking met FFPE exemplaren is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. TIC voorbereiding voor snelle microscopische beoordeling gebruik normaal glas dia 's
- Uitvoeren de TIC voorbereiding zo spoedig mogelijk nadat de klinische pathologisch weefsel materialen beschikbaar zijn. Als TIC exemplaren kunnen niet onmiddellijk worden voorbereid, houden het weefsel materiaal bedekt met zoutoplossing bevochtigd steriel gaas en opslag in de ijskast om te voorkomen dat het drogen van de weefsels.
- Bereiden 5 mm3 weefsel materiaal zoals solide tumoren (bv, lever, longen en borstweefsels) klinisch verkregen door chirurgie of endoscopie.
- Zachtjes het weefsel wisser met steriel gaas bedekt met fysiologische zoutoplossing en verwijder bloed, als het oppervlak van het weefsel veel bloed heeft.
- Voor microscopische specimens zoals biopsie materiaal, houd het monster bevochtigd met steriel gaas gedrenkt in een fysiologische zoutoplossing.
- Knippen, trim van het normale weefsel met een mes trimmen en bloot van het oppervlak van de tumor laesie, als de massa van de tumor niet zichtbaar Grove.
- Raak het oppervlak van de tumor van de resected monsters op een normale glasplaatje verschillende malen met gehandschoende handen. Visueel bevestigen dat de aangeraakt oppervlakte bedraagt meer dan 80% van de normale glasplaatje.
- Licht druk op de normale glasplaatje tegen een polyethyleen poly(ethyleennaftalaat) (PEN) membraan dia en wrijf zachtjes 2 - 3 keer met gehandschoende handen. Visueel bevestigen dat de cellen worden overgebracht van de normale glasplaatje naar de PEN membraan dia.
- Zowel het glas en de PEN membraan-dia's gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur drogen.
- De normale glasplaatje voor directe cytologische onderzoek vlek. Dompel het glas dia's met kleefpoeders oplossing voor 5 s, en vervolgens vlek met Giemsa kleurstofoplossing voor 15 s.
- Beoordelen en de inhoud van de tumor en buiten op de normale glasplaatje scherm volledig met een Microscoop voor snelle beoordeling. Evalueren van tumorcellen op basis van verschillende criteria; nucleaire uitbreiding abnormale karyotype, overvloedige chromatine, ongelijke verdeling van de cellen is de verhouding tussen nucleaire component/cytoplasmatische component, de celgrootte en cel polariteit.
2. voorbereiding van de Film van de dia van het membraan van PEN voor genetische tests
- Als het monster toont tumor buiten meer dan 60% door snelle microscopische beoordeling (stap 1.8), knipt u de tumor-aangeraakt film van de dia's van PEN, membraan voor DNA-extractie met een mes en gehandschoende handen. De geknipte film overbrengen in een steriele microcentrifuge buis met een pincette en gehandschoende handen.
- Als de tumor buiten werd bepaald als laag (minder dan 60% van de inhoud van de tumor) door snelle microscopische beoordeling (stap 1.8), gebruik van de laser vangt microdissection en tumor monsters krijgen.
- Giemsa-kleuring voor de beoordeling van de tumorcellen met behulp van standaard protocollen uitvoeren.
- Snijd de film van de dia membraan PEM door passende laser vangt microdissection.
- De geknipte film overbrengen in een steriele microcentrifuge buis met een pincette en gehandschoende handen.
- De film-bevattende microcentrifuge buis bij 4 ° C bewaren tot DNA-extractie (het protocol kan worden onderbroken hier).
3. DNA-extractie
- DNA-extractie van de TIC of FFPE weefselsteekproeven met behulp van een FFPE DNA-extractie kit volgens de instructies van de fabrikant met kleine aanpassingen uit te voeren. Een gelijkwaardige kit is beschikbaar voor de FFPE DNA-extractie-stap.
- Voeg 180 µL van weefsel lysis buffer (pH = 8.3) aan de film-bevattende microcentrifuge buis met een handmatige 200-µL pipet. Voeg 20 µL van proteïnase K met een handmatige 20-µL pipet en meng door vortexing met een vortex-mixer op maximale snelheid (ongeveer 2500 rpm) voor 5 s.
- Incubeer de monsters bij 56 ° C's nachts met een lucht-incubator.
- Incubeer de FFPE en TIC monsters bij 90 ° C in een blok van de warmte voor 1 uur en 10 min, respectievelijk. Kort draaien naar beneden de buis van de microcentrifuge bij 1.500 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur met een mini centrifuge.
- Voeg 200 µL van lysis buffer aan het monster met een 200-µL pipet en meng grondig door vortexing bij maximumsnelheid voor 5 s.
- Voeg 200 µL van ethanol (96-100%) met een 200-µL pipet en meng door vortexing bij maximumsnelheid voor 5 s. kort spin naar beneden de buis van de microcentrifuge bij 1.500 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur met een mini centrifuge.
- De gehele lysate zorgvuldig overbrengen in de kolom van de spin met een 1.000-µL pipet en centrifuge op 6.000 x g voor 1 min bij 25 ° C.
- Plaats van de spin-kolom in een collectie van schone 2-mL tube met gehandschoende handen en negeren de buis van de collectie met de doorstroming in een doos kunststof verwijdering.
- Voeg 500 µL van was buffer naar de kolom van de spin met een 1.000-µL pipet en centrifuge op 6.000 x g voor 1 min bij 25 ° C.
- Plaats van de spin-kolom in een collectie van schone 2-mL tube met gehandschoende handen en negeren de buis van de collectie met de doorstroming in een doos kunststof verwijdering.
- Voeg 500 µL van was buffer naar de kolom van de spin met een 1.000-µL pipet en centrifuge op 6.000 x g voor 1 min bij 25 ° C.
- De buis van de collectie met de doorstroming in een doos kunststof verwijdering te negeren. Plaats van de spin-kolom in een schone 1.5-mL microcentrifuge buis met gehandschoende handen samen en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 3 minuten bij 25 ° C te drogen van het membraan.
- Plaats de spin-kolom in een DNA-lage bindende buis met gehandschoende handen.
- Voeg 40-50 µL van elutie buffer naar het midden van het membraan met een pipet 100 µL.
- Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min en centrifuge op 20.000 x g voor 1 min bij 25 ° C.
- De DNA-monsters bij-20 ° C bewaren tot de volgende stap (het protocol kan worden onderbroken hier).
4. schatting van DNA kwaliteit door kwantitatieve real-time PCR
- De master mix in een steriele microcentrifuge buis met een pipet, als volgt voorbereiden: 10 µL van 2 x Real-Time PCR Master Mix, 1 µL van 20 x RNase P Primer-Probe Mix (amplicon grootte: 87 bp), en 8 µL van steriele nuclease-gratis water.
- De tweede master mix in een steriele microcentrifuge buis als volgt voorbereiden: 10 µL van 2 x Real-Time PCR Master Mix, 1 µL van 20 x RNase P Primer-Probe Mix (amplicon grootte: 268 bp), en 8 µL van steriele nuclease-gratis water.
- Seriële verdunningen van menselijke controle genomic DNA (meegeleverd in de kit) 4 keer uitvoeren voor een vijf-punts standaard curve en de absolute DNA concentraties13bepalen.
- 19 µL van de twee bereid master mixen (bereid in stap 4.1 en 4.2) in aparte putjes van de plaat van een optische 96-Wells-reactie met een 20-µL pipet toevoegen.
- Voeg 1 µL van FFPE DNA of TIC DNA te scheiden van putten met de mix van de reactie met een 2-µL pipet. Voeg 1 µL nuclease-gratis water in een aparte goed met de reactie mix voor de geen sjabloon controle.
- Houd de niet-klevende kant van een optische kleeffilm en schil terug de beschermende back-ups maken vanaf het midden van de film. Zachtjes de applicator over de film sleept en verzegel de film over de 96-wells-plaat.
- Meng voorzichtig de 96-wells-plaat met behulp van een 96-wells-plaat mixer voor 10 s bij kamertemperatuur op 2.000 toeren per minuut. Centrifugeer de plaat kort bij 1.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Zet de real-time PCR-instrument en steek de 96-wells-plaat. De PCR reacties via het volgende protocol worden uitgevoerd: 95 ° C gedurende 20 s, gevolgd door 45 cycles van 95 ° C voor 1 s en 60 ° C gedurende 20 s. gebruik "standaard curve" en "fast-modus."
- Beoordelen van de fragmentatie van DNA met de verhouding van DNA (relatieve kwantificering; RQ) verkregen voor de lange amplicon (268 bp) aan de korte amplicon (87 bp). RQ is de gemiddelde waarde van de lange amplicon/de gemiddelde waarde van de korte amplicon13.
5. voorbereiding van de volgende generatie Sequencing bibliotheek
- Bereiden de sequencing-bibliotheek voor het volgende generatie rangschikken volgens de instructies van de fabrikant.
- De multiplex PCR master mix in een steriele microcentrifuge buis per monster als volgt voorbereiden: 4 µL van 5 x Multiplex PCR reactie oplossing, 4 µL van 5 x primer zwembad, ≤6 µL TIC of FFPE DNA (1-100 ng), en voeg water tot 20 µL nuclease-vrij.
- De multiplex PCR master mix aan een PCR buis en meng zachtjes toevoegen door te tikken op de buis.
- Kort draaien naar beneden de buis van de microcentrifuge bij 1.500 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur met een mini centrifuge.
- De PCR reacties via het volgende protocol worden uitgevoerd: 99 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 20 cycli van 99 ° C voor 15 s en 60 ° C voor 4 min en bedrijf stap 10 ° C. Kort spin down de PCR-buis met een mini Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur.
Opmerking: Het aantal cycli op basis van het aantal primerparen bepalen. - Open het deksel van de PCR-buis, en voeg 2 µL van het restrictie-enzym met een 2-µL pipet. Sluit het deksel van PCR buis en meng zachtjes door te tikken op de PCR-buis. Kort spin down de PCR-buis met een mini Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur.
- De PCR reacties via het volgende protocol worden uitgevoerd: 50 ° C gedurende 10 min, 55 ° C gedurende 10 minuten, 60 ° C gedurende 20 minuten, en bedrijf stap 10 ° C. Kort spin down de PCR-buis met een mini Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur.
- De adapter afbinding master mix in de elk putje met de verteerd PCR waarbij met een pipet als volgt toevoegen: 4 µL van adapter afbinding oplossing 0,5 µL van barcode, 0,5 µL van adapter, 2 µL van nuclease-gratis water en 2 µL van DNA ligase. Sluit het deksel van PCR buis toe en meng zachtjes door te onttrekken. Kort spin down de PCR-buis met een mini Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur.
- De PCR reacties via het volgende protocol worden uitgevoerd: 22 ° C gedurende 30 minuten, 68 ° C gedurende 5 min, 72 ° C gedurende 5 minuten, en bedrijf stap 10 ° C.
- Zuiveren de sequencing-bibliotheek met magnetische kralen volgens de instructies van de fabrikant.
- Breng de oplossing van de adapter-afgebonden bibliotheek in de 1.5-mL DNA laag-bindende buis. Voeg 45 µL van magnetische kralen in de DNA-laag-bindende buis voor de 1st zuivering. Meng zachtjes door te tikken op de buis en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis van de bindende DNA-laag in een magnetische rek en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur totdat de oplossing helder is. Verwijder het supernatant met een 200-µL pipet zorgvuldig zonder verstoring van de magnetische kralen.
- Voeg 150 µL van vers bereide 70% ethanol met een 200-µL Pipet, dan verplaatsen de buis side-to-side van de magneet te wassen van de kralen. Verwijder het supernatant zorgvuldig zonder verstoring van de magnetische kralen.
- Herhaal stap 5.11 voor een tweede wassen.
- Kort spin naar beneden de buis met mini Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur. Plaats de buis van de lage-bindende DNA in een magnetische rek en zorgvuldig negeren de ethanol druppels met een 10-µL pipet.
- Voeg 50 µL voor laag TE in de DNA-laag-bindende buis met de magnetische kralen pellet het verspreiden van de kralen. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis van de lage-bindende DNA in een magnetische rek en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten totdat de oplossing helder is.
- Breng de 50 µL van de bovendrijvende substantie in de nieuwe DNA laag-bindende buis en voeg 75 µL van magnetische kralen met een pipet 100 µL voor de zuivering van 2nd . Meng zachtjes door te tikken op de buis en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis van de lage-bindende DNA in een magnetische rek en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur totdat de oplossing helder is. Verwijder het supernatant met een 200-µL pipet zorgvuldig zonder verstoring van de magnetische kralen.
- Voeg 150 µL van vers bereide 70% ethanol met een 200-µL Pipet, dan verplaatsen de buis side-to-side van de magneet te wassen van de kralen. Verwijder het supernatant zorgvuldig zonder verstoring van de magnetische kralen.
- Herhaal stap 5.18 voor een tweede wassen.
- Kort spin naar beneden de buis met een mini Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 s bij kamertemperatuur. Plaats de buis van de lage-bindende DNA in een magnetische rek en zorgvuldig negeren de ethanol druppels met een 10-µL pipet.
- Voeg 50 µL voor lage TE in de DNA-laag-bindende buis met de magnetische kralen pellet het verspreiden van de kralen. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis van de lage-bindende DNA in een magnetische rek en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten totdat de oplossing helder is.
- Breng de 45 µL van supernatans met gezuiverde library in de nieuwe DNA laag-bindende buis met een pipet 100 µL.
6. het kwantificeren van de concentratie van de bibliotheek door kwantitatieve real-time PCR
- Bepaal de concentratie van elke bibliotheek volgens13instructies van de fabrikant.
- Bereid de oplossing van een 20-fold verdunning als volgt: Meng 2 µL van gezuiverde bibliotheek en 38 µL van nuclease-gratis water in een buis van de lage-bindende DNA met een 2-µL en 100-µL pipet.
- Bewaren de onverdunde bibliotheken bij-20 ° C tot stap 7.3.
- Bereid de oplossing van een 200-fold verdunning als volgt: Meng 5 µL van de 20-fold verdunde gezuiverde bibliotheek (bereid in stap 6.1) en 45 µL van nuclease-gratis water in een buis van de lage-bindende DNA.
- Bereid de oplossing van een 2,000-fold verdunning als volgt: Meng 5 µL van de 200-fold verdunde gezuiverde bibliotheek (bereid in stap 6.2) en 45 µL van nuclease-gratis water in een buis van de lage-bindende DNA.
- Voorbereiding van de master mix van de reactie als volgt: Meng 10 µL van 2 x master mix oplossing en 1 µL van 20 x primer-probe assay oplossing in steriele microcentrifuge buis met een pipet en meng door te tikken op de buis. Voeg 11 µL van de master mix van de reactie in de putten van een optische 96-Wells-reactie.
- 9 µL van de 2,000-fold verdunde bibliotheek, 9 µL van elk standaard besturingselement of 9 µL van nuclease-gratis water toevoegen aan elk putje met een 10-µL pipet.
- Houd de niet-klevende kant van optische kleeffilm en schil terug de beschermende back-ups maken vanaf het midden van de film.
- Zachtjes de applicator over de film sleept en verzegel de film over de 96-wells-plaat.
- Meng voorzichtig de 96-wells-plaat met behulp van een 96-wells-plaat mixer voor 10 s bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de plaat kort bij 1.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Zet de real-time PCR-instrument en steek de 96-wells-plaat. De PCR reacties via het volgende protocol worden uitgevoerd: 50 ° C gedurende 2 minuten, 95 ° C gedurende 20 s, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 1 s en 60 ° C gedurende 20 s. gebruik "standaard curve" en "fast-modus."
- Bereken de concentratie van de onverdunde bibliotheek door vermenigvuldiging van de concentratie bepaald met qPCR door 2.000.
7. volgende generatie Sequencing
- Plan het uitvoeren voorwaarde en stelt de run parameter binnen de software.
- Klik op [Plan tabblad] en [Template], en selecteer de juiste uitvoering.
- Selecteer de toepassing en het type van de techniek, en klik op [Next].
- Selecteer de instrument steekproef voorbereiding kit (optioneel), soort van bibliotheek kit, sjabloon kit, sequencing kit, baseren kalibratie-modus, chip type, controle van de reeks (optioneel) en barcode set en klik op [Next].
- Selecteer plugins en klik op [Next].
- Selecteer project en klik op [Next].
- Selecteer standaard referentie en BED bestanden van de gerichte regio.
- Typ de naam van het monster, selecteert u de streepjescode en klik op [Plan uitvoeren].
- Sjabloon voorbereiding uitvoeren en chip laden in een geautomatiseerd instrument volgens de instructies van de fabrikant. Ontdooi de cartridge reagens bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten vóór gebruik.
- Verdun de onverdunde bibliotheek met nuclease-gratis water volgens de bibliotheek concentratie berekend in stap 6.8 en 20 pM bibliotheken maken.
- Een gepaarde bibliotheek voorbereiden door sequentiebepaling en winkel op ijs.
- Voeg 25 µL van de gebundelde bibliotheek Pipetteer 100 µL naar de onderkant van het monsterbuisje. Gebruik de gepaarde bibliotheek binnen 48u.
- Macht op en open het klepje van het geautomatiseerde instrument.
- Plaats de sequencing chip chip adapter, verrijking cartridge, tip cartridge, PCR plaat, PCR frame zegel, herstel buis, oplossing cartridge en reagens cartridge naar de juiste positie van het geautomatiseerde instrument.
- Raak de [set-up Run] en [stap voor stap] op het scherm.
- Sluit de klep en touch [Start check] op het scherm.
- Na het dek scan proces, touch [Next] op het scherm.
- Controleert u de inhoud van de weergave (Interfacekit type, chip type, chip ID, monster ID, plannen), de tijd instellen en touch [OK] op het scherm.
- Na het beëindigen van het laden van de chip:
- [Volgende] Raak op het scherm en open het klepje.
- De chip van de volgorde van chip adapter met gehandschoende handen gelost.
- Plaatsen van de chip in de chip container, rap met parafilm en bewaren bij 4 ° C tot de sequentiebepaling reactie.
- De verrijking cartridge, plaat van PCR, PCR frame zegel, herstel buis, oplossing cartridge en reagens cartridge verwijderd van de juiste positie van het geautomatiseerde instrument met gehandschoende handen.
- Een tip voor lege cartridge overbrengen in de afval tip positie van de geautomatiseerde instrument met gehandschoende handen.
- Raak [volgende] en sluit de klep.
- Raak [Start] en het geautomatiseerde instrument schoon door ultraviolette stralen voor 4 min.
- Ontbinden van een natrium chloriet tablet in 1000 mL van ultrazuiver water en filter oplossing met een 0.22-µm filter flow filter eenheid.
- Zet de sequencing-instrument.
- Touch [Clean] en [volgende] op het scherm van de sequencing-instrument.
- Reinig het instrument sequencing met 250 mL filter-gesteriliseerde natrium chloriet oplossing en vervolgens 250 mL ultrazuiver water.
- Raak [initialiseren] en selecteer de juiste volgorde kit op het scherm.
- Installeer een grijze verzender op de juiste locatie met gehandschoende handen.
- Initialiseer de sequencing-instrument met de oplossing van de wasbeurt (meegeleverd in de kit), de pH aanpassing oplossing (met 350 µL van 100 mM natriumhydroxide) en de pH-standaardoplossing (meegeleverd in de kit).
- Voeg 20 µL van dATP, dGTP, dCTP en dTTP nucleotiden (meegeleverd in de kit) in 50 mL tubes (meegeleverd in de kit) met een pipet 100 µL.
- Installeer een grijze verzender op de juiste locatie met gehandschoende handen.
- De tube 50 mL en de schroef op de sequencing instrument laden.
- Raak de [Next] op het scherm om te beginnen met de initialisatie stap, die ongeveer 25 minuten duurt.
- Na de voltooiing van de initialisatie-stap:
- [Uitvoeren] Raak op het scherm en selecteer de juiste bibliotheek voorbereiding instrument.
- Scan de tweedimensionale barcode van de chip.
- Plaats de sequencing-chip op de juiste positie.
- De chip-klem en instrument-deur dicht.
- Touch [Chip check], [volgende], en [OK] op het scherm om te beginnen de volgorde uitvoeren.
- Na de sequencing-reactie, de gegevensoverdracht en uitvoeren van data-analyse pijpleiding op de sequencing server13,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont het hele proces van het voorbereiden van de TIC specimens DNA-extractie. Met name neemt de procedure slechts twee dagen aan de genomic DNA verkrijgen TIC monsters. We geëvalueerd eventuele effecten van tumor opslag vóór de dia verwerking. We vonden dat tumorcellen gekoppeld waren op het glasplaatje weefsel exemplaren werden onmiddellijk aangeraakt op de dia als wanneer weefsels werden gehouden in zoute bevochtigd steriel-gaas voor 1 h (Figuur 2). Echter wanneer weefsels werden bewaard bij kamertemperatuur, de tumorcellen waren niet goed is gekoppeld aan de dia. Voorbereide dia's kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor drie maanden. Daarom is het belangrijk niet toe te staan van de specimens te drogen.
Wij onderzocht het nut van onze werkwijze en vergelijk deze met specimens verkregen met behulp van FFPE. TIC en FFPE monsters waren voorbereid van 14 exemplaren van de tumor, en we hebben bevestigd dat tumor inhoud en zuiverheid van de TIC-exemplaren kunnen worden beoordeeld. Nadat we uitgevoerd Giemsa-kleuring, kon het aantal tumorcellen en de morfologie van de tumor worden beoordeeld door microscopie. We konden dus regelmatig evalueren de tumorcellen en vervolgens het uitvoeren van een DNA-kwaliteitscontrole.
De DNA kwantiteit en kwaliteit werden geraamd door kwantitatieve real-time PCR13,14,15. Wij vastbesloten de absolute hoeveelheden van DNA en de RQ-waarde, die een indicatie van het niveau van de afbraak van genomic DNA. De resultaten toonden aan dat een hogere opbrengst van DNA werd bereikt met behulp van de specimens van de TIC in vergelijking met de FFPE specimens (tabel 1). Daarnaast de RQ-waarden van de TIC DNA waren aanzienlijk hoger in vergelijking met die van het FFPE-DNA (Figuur 3, p = 2.3 x 10-8, tweezijdige Student t -test). Wij beoordeeld ook de RQ-waarden van de TIC en FFPE DNA geëxtraheerd uit verschillende tumor typen en vond dat de TIC DNA hoger in kwaliteit in vergelijking met het DNA van de FFPE (Figuur 3). Deze resultaten aangegeven dat de TIC DNA minder gefragmenteerd dan het FFPE-DNA was.
Wij vervolgens beoordeeld of de TIC DNA kan worden gebruikt voor de volgende generatie sequentie-analyse. FFPE en TIC DNA werden bereid uit primaire colorectal kanker en gemetastaseerde leverkanker verkregen van een patiënt (figuur 4A). PCR versterking en bibliotheek voorbereiding verliepen de kanker Hotspot Configuratiescherm en vervolgens gerichte sequencing werd uitgevoerd. Dientengevolge, werd APC Q1367 * geïdentificeerd in zowel de FFPE als de TIC DNA geëxtraheerd uit Site 1 (tabel 2). Bovendien, APC S1356 *, G12D van KRAS en TP53 M237I werden ontdekt in beide FFPE en TIC DNA geëxtraheerd uit Site 2, 3 en 4 (tabel 2). Deze resultaten voorgesteld dat de identieke somatische mutaties werden geïdentificeerd in gepaarde FFPE en TIC DNA-monsters bereid van de zelfde plaats van de tumor (figuur 4B en tabel 2). Met name de dezelfde somatische mutaties ontdekt tussen primair colorectaal carcinoom (Site 2, niet Site 1) en twee metastatische leverkanker monsters, wat suggereert dat de tumor klonen van Site 2 aan lever (figuur 4B en tabel 2 metastaseren). Samen suggereren deze bevindingen dat de TIC-DNA is van hoge kwaliteit en geschikt voor een breed scala is van genetische tests met inbegrip van de volgende generatie sequencing.
Cijfer 1. schema voor het verkrijgen van DNA van de bereiding van de monsters van een TIC. De tumor weefsel is aangeraakt op het glas van de dia te bereiden van het TIC monster. Na beoordeling van de morfologie van de tumor en de inhoud onder een Microscoop, kan de tumor DNA worden gewonnen en gebruikt voor genetische tests. Met behulp van TIC, de tumor DNA kan worden verkregen uit een klinisch monster. pathologische binnen twee dagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Bereiding van de monsters van de TIC. Resected tumor exemplaren werden onmiddellijk aangeraakt op een normale glasplaatje (linker paneel), gehouden in zoute bevochtigd steriel-gaas voor 1 h (midden), en bewaard bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (rechts). Voorbeeld #1 was hepatocellulaire carcinoom en monster #2 was borstkanker. Microscopische foto's werden gevangen met behulp van een digitale camera gemonteerd op een microscoop. Schaal bar: 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. DNA kwaliteitscontrole geschat door kwantitatieve real-time PCR analyse. TIC en FFPE DNA werden gehaald uit 14 tumor weefsels van colorectale (n = 8), maag (n = 4), en metastatische leverkanker (n = 2). Vergelijking van de relatieve kwantificering scores tussen de TIC-Giemsa en FFPE-HE monsters. RQ waarden van TIC DNA waren aanzienlijk hoger dan die van FFPE DNA. Statistische analyse tussen de twee groepen werd uitgevoerd en p-waarden werden berekend door ongepaarde tweezijdige Student t -test met behulp van Excel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Volgende generatie sequencing analysegegevens met behulp van TIC en FFPE DNA. (A) Macroscopic en microscopische beelden. Representatieve beelden van TIC-Giemsa en FFPE-HE kleuring van het colorectaal carcinoom (site 1 en 2) en metastatische lever carcinoom monsters (site 3 en 4). Schaal bar in macroscopische beelden: 1 cm, schaal bar in de microscopische beelden: 100 µm. (B) hitte kaart waarin de verdeling van somatische mutaties voor elke site tumor (n = 8). Identieke mutaties ontdekt onder gepaarde TIC en FFPE DNA-monsters. Waarden van allèlique breuken zijn aangegeven in afstuderen kleurenschaal van 1% (lichtroze) tot 100% (roze). Grijze kolommen toonde geen geïdentificeerde mutatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| TIC-Giemsa (n = 14) | FFPE-HE (n = 14) | |||||||||
| Totale DNA (ng) | Totale DNA (ng) | |||||||||
| Monster | Site van de tumor | Korte | Lange | RQ | Korte | Lange | RQ | |||
| Site1 | Dikke darm | 1495 | 1247 | 0.83 | 939 | 349 | 0.37 | |||
| Site2 | Dikke darm | 991 | 1057 | 1.07 | 556 | 204 | 0.37 | |||
| Site3 | Lever | 467 | 511 | 1.09 | 130 | 39 | 0.3 | |||
| Site4 | Lever | 2172 | 2115 | 0.97 | 488 | 127 | 0.26 | |||
| Site5 | Dikke darm | 749 | 598 | 0.8 | 529 | 205 | 0.39 | |||
| Site6 | Maag | 330 | 286 | 0.86 | 211 | 98 | 0,46 | |||
| Site7 | Maag | 636 | 499 | 0.78 | 154 | 84 | 0,55 | |||
| Site8 | Maag | 27 | 27 | 1.01 | 135 | 81 | 0.6 | |||
| Site9 | Dikke darm | 1986 | 1611 | 0.81 | 476 | 163 | 0.34 | |||
| Site10 | Dikke darm | 280 | 218 | 0.78 | 209 | 83 | 0.39 | |||
| Site11 | Dikke darm | 1546 | 575 | 0.37 | 366 | 159 | 0,43 | |||
| Site12 | Maag | 1501 | 1200 | 0.8 | 274 | 132 | 0,48 | |||
| Site13 | Dikke darm | 1556 | 1404 | 0.9 | 326 | 179 | 0,55 | |||
| Site14 | Dikke darm | 1565 | 1210 | 0.77 | 680 | 295 | 0,43 | |||
| Mean±SD | 1093±682 | 897±600 | 0.85±0.18 | 391±253 | 157±86 | 0.42±0.10 | ||||
Tabel 1. De gegevens van de kwaliteit van de DNA. TIC gekoppeld (n = 14) en FFPE exemplaren (n = 14) waren bereid uit de dikke darm, lever en maag kanker. TIC monsters werden met Giemsa gekleurd, en FFPE monsters werden gekleurd met haematoxyline en eosine (HE). DNA-monsters werden uitgepakt en gekwantificeerd door kwantitatieve PCR in real time met twee primerparen sturen RNaseP locus (lange amplicon (268 bp) en korte amplicon (87 bp)). RQ waarden werden berekend als volgt: de gemiddelde waarde van lange amplicon gedeeld door de gemiddelde waarde van korte amplicon. SD, standaardafwijking; RQ, relatieve kwantificatie
| Monster naam | Locatie | Voorbereiding | Gene symbool | Mutatie | Positie | Referentie | Variant | Codering | Dekking | Allèlique breuk | |
| Primair colorectaal carcinoom | Site 1 | FFPE | APC | Q1367 * | chr5:112175390 | C | T | c.4099C > T | 1999 | 45% | |
| Primair colorectaal carcinoom | Site 1 | TIC | APC | Q1367 * | chr5:112175390 | C | T | c.4099C > T | 1011 | 72% | |
| Primair colorectaal carcinoom | Plaats 2 | FFPE | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1968 | 77% | |
| Primair colorectaal carcinoom | Plaats 2 | FFPE | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1993 | 52% | |
| Primair colorectaal carcinoom | Plaats 2 | FFPE | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1991 | 73% | |
| Primair colorectaal carcinoom | Plaats 2 | TIC | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1967 | 89% | |
| Primair colorectaal carcinoom | Plaats 2 | TIC | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1994 | 56% | |
| Primair colorectaal carcinoom | Plaats 2 | TIC | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1995 | 86% | |
| Metastatische leverkanker | Plaats 3 | FFPE | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1974 | 92% | |
| Metastatische leverkanker | Plaats 3 | FFPE | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1995 | 62% | |
| Metastatische leverkanker | Plaats 3 | FFPE | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1296 | 91% | |
| Metastatische leverkanker | Plaats 3 | TIC | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1964 | 97% | |
| Metastatische leverkanker | Plaats 3 | TIC | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1993 | 64% | |
| Metastatische leverkanker | Plaats 3 | TIC | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1998 | 95% | |
| Metastatische leverkanker | Site 4 | FFPE | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1965 | 93% | |
| Metastatische leverkanker | Site 4 | FFPE | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1992 | 60% | |
| Metastatische leverkanker | Site 4 | FFPE | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1993 | 92% | |
| Metastatische leverkanker | Site 4 | TIC | APC | S1356 * | chr5:112175358 | C | A | c.4067C > A | 1960 | 94% | |
| Metastatische leverkanker | Site 4 | TIC | KRAS | G12D | chr12:25398284 | C | T | c.35G > A | 1992 | 62% | |
| Metastatische leverkanker | Site 4 | TIC | TP53 | M237I | chr17:7577570 | C | A | c.711G > T | 1995 | 95% | |
Tabel 2. Vergelijking van mutaties in gepaarde FFPE en TIC DNA gedetecteerd door gerichte sequentie-analyse. TIC gekoppeld en FFPE monsters waren bereid uit 2 primaire colorectal kanker (Site 1 en 2) en 2 metastatische lever kanker (Site 3 en 4). Gerichte sequencing werd uitgevoerd met deze DNA-monsters en somatische mutaties werden geïdentificeerd. Mutatie profielen waren identiek tussen gekoppelde TIC en FFPE DNA-monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie presenteerden we een alternatieve methode voor het verkrijgen van tumor DNA uit klinische pathologische monsters met behulp van de TIC. Voorbereiding van het TIC is zeer eenvoudig en minder tijd in vergelijking met FFPE methoden, zonder de behoefte aan speciale instrumenten10nodig heeft. Alle procedures van de TIC-voorbereiding voor DNA-extractie kunnen worden voltooid binnen twee dagen (Figuur 1). Deze methode dus verkort de doorlooptijd voor het uitvoeren van genetische tests. Met name biedt dit een aanzienlijk voordeel in het aantal dagen nodig voor moleculaire analyse te verkorten. Deze korte doorlooptijd laat ons toe om onmiddellijk een passende therapie te bieden voor progressief kankerpatiënten die behoefte hebben aan moleculair gerichte drugs. Deze methode biedt dus voordelen voor analyses van genetische wijzigingen in tumoren en administratie van moleculair gerichte medicijnen voor kankertherapie.
Er zijn enkele belangrijke punten voor het welslagen van het gebruik van TIC DNA voor genetische analyse. Tumor weefsels may necrotische be because of behandeling zoals chemotherapie of andere behandelingen. Dus, is voorzichtigheid geboden bij de voorbereiding van de TIC exemplaren te bemonstering van necrotisch secties in de tumor zo veel mogelijk te vermijden. Verder, eerste microscopische beoordeling is zeer belangrijk voor de latere procedures. Daarnaast is voorkomen dat het drogen van tumor weefsels vereist voor geslaagde bereiding van de monsters van de TIC. Als de tumor weefsels zijn gedroogd, resulteert dit in minder gekoppelde cellen op het glasplaatje. Het zal ook moeilijk zijn om de tumor buiten en morfologie waarnemen omdat drogen leidt tot degeneratie van tumor weefsels.
Er zijn sommige potentiële voordelen voor het gebruik van de TIC DNA. Ten eerste kunnen we controleren de tumor buiten tijdens de eerste beoordeling met microscopie. Als normale cellen, zoals lymfocyten en stromale cellen, overvloedig in de weefselmonsters werden, zou de besmetting van deze normale cellen te voorkomen dat de mogelijkheid om te detecteren van somatische mutaties in de tumorcellen. Snelle microscopische beoordeling van de monsters kan helpen de evaluatie van de tumor buiten en schatting van of voldoende tumor DNA-monsters werden verkregen uit de TIC monsters voor DNA-extractie. Ten tweede, onze resultaten toonde aan dat de TIC DNA zowel hoog in kwaliteit en kwantiteit. FFPE DNA is gebruikt voor de volgende generatie sequentie analyse, met inbegrip van gerichte sequencing, exome sequencing en hele genoom sequencing16,17,18,19,20. Archivering FFPE DNA wordt ook regelmatig gebruikt voor genetische analyse21,22, maar FFPE DNA kan worden gefragmenteerd tijdens formaline fixatie. Dit kan leiden tot problemen in PCR versterking of DNA-extractie, veroorzaakt door een gebrek aan reeks dekking, uniformiteit bij de doelregio's, en verhogen risico van reeks fout23,24. In tegenstelling, is TIC DNA niet gefragmenteerd, die kan worden veroorzaakt door de alcohol fixatie die minder invloed op de nucleïnezuur heeft. Zoals TIC DNA is niet gefragmenteerd zoals het FFPE-DNA, zal deze monsters zijn meer geschikt voor de volgende generatie sequentie analyse, PCR in real time en digitale PCR. Inderdaad, toonden we eerder dat TIC DNA uit een monster van de tumor kan worden gebruikt in de volgende-generatie sequencing analyse is een methode genaamd "TIC-seq", en de resultaten precies de tumor somatische mutaties13kon vangen. Ten derde, deze techniek is die van toepassing zijn voor een breed scala aan materialen. In het huidige verslag gebruikten we chirurgische exemplaren. Naast de chirurgische weefsels, gemetastaseerde lymfeklier, kan bronchiale of Endoscopische biopsie worden gebruikt voor het voorbereiden van de TIC DNA.
Tot slot presenteren we een eenvoudige en snelle methode voor het opstellen van kwalitatief hoogwaardige tumor DNA met TIC monsters. Deze methode zal uitbreiding van nieuwe mogelijkheden op het gebied van genetische analyse en helpen bevorderen van precisie geneeskunde in de klinische setting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken alle medische en ondersteunende medewerkers van het ziekenhuis en de patiënten voor toestemming om deel te nemen. Wij danken Gabrielle White Wolf, PhD, van de Edanz groep (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp van dit verslag. Deze studie werd ondersteund door een Grant-in-Aid voor genoom-onderzoeksproject van de prefectuur Yamanashi (Y.H. en M.O.) en een subsidie van de YASUDA medische Foundation (Y.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
- Vogelstein, B., et al.
- Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
- Garraway, L. A., Lander, E. S.
- Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
- Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
- Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
- Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
- Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
- Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
- Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
- Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
- Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
- Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).
