Summary
פרוטוקולים חדשים מתוארים כאן כדי לבודד ולאפיין microparticles נגזר מן האדם ואת העכבר נויטרופילים. פרוטוקולים אלה לנצל ultracentrifugation, מיכשור וטכניקות immunoblotting לנתח תוכן microparticle, הם יכולים לשמש כדי ללמוד את התפקיד של microparticles נגזר סוגי תאים שונים של תפקוד התאים.
Abstract
אורך חייהם נויטרופילים, נגזר microparticles (נויטרופיל)-MPs) הם ליפידית, כדורית שלפוחיות זעירות בגודל הנע בין 50 – 1,000 nm בקוטר. MPs הם מתפתחים עתה, חלק חשוב של מכונות איתות ותקשורת לתא. בגלל גודלם מהות שחרורם, עד לאחרונה MP קיומו היה להתעלם. עם זאת, עם טכנולוגיה משופרת, שיטות אנליטיות תפקידם על בריאות ומחלה עכשיו מתגלה. הפרוטוקולים המובאת כאן מכוונים בידוד ואפיון נויטרופיל-MPs cytometry זרימה ו immunoblotting. יתר על כן, מקבלים מספר דוגמאות ליישום. פרוטוקולים אלה לבידוד MP הן מהר, בעלות נמוכה, אינם דורשים שימוש ערכות יקר. יתר על כן, הן מאפשרות עבור תיוג של MPs בעקבות בידוד, כמו גם תיוג מראש של תאי המקור לפני שחרור MP, באמצעות הפלורסנט ממברנה ספציפי עבור הדמיה וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטות אלה, אולם, יש מספר מגבלות כולל טוהר PMNs ו MPs והצורך מכשור אנליטי מתוחכם. Cytometer זרימה באיכות גבוהה יש צורך לנתח MPs ולמזער קריאות חיובי כוזב עקב רעש או אוטומטי-זריחה באופן אמין. הפרוטוקולים שתואר יכול לשמש כדי לבודד ולהגדיר להן MP, לאפיין שלהם סמנים, וריאציה בהרכב בתנאים שונים מגרה. גודל הטרוגניות אפשר לנצל את זה כדי לחקור אם התוכן של קרום חלקיקים נגד exosomes הוא שונה, בין אם הם למלא תפקידים שונים בתוך רקמת הומאוסטזיס לבסוף, ניתן לסייר הבאים בידוד ואפיון של חברי פרלמנט, תפקידם בתגובות הסלולר מודלים מחלות שונות (לרבות, נויטרופיל-הקשורים הפרעות דלקתיות, כמו במחלות מעי דלקתיות או פציעה ריאות חריפה).
Introduction
לאחרונה, "microparticles/שלפוחיות זעירות" שמקורם ציטוזול תא או קרום פלזמה הפכו עניין מדעי רב, כפי המתעוררים הנתונים מראים כי מבנים אלה, הנע בין 50-1, 000 nm בקוטר יכול לשאת מידע ביולוגי, לשמש כשיטה קאנונית של התקשורת הסלולארית. החיסון התא-derived MPs ואלה במיוחד המיוצר על ידי נויטרופילים אורך חייהם (PMNs) עניין רב נתן את תפקידה החשוב של PMNs מארח ההגנה1,2, תגובות דלקתיות3ו ריפוי פצע 4. מסקרן, עד כה, דיווחים רבים הראו פונקציות הן הפרו דלקתיים ואנטי דלקתיות של נויטרופיל-MPs5, רומז על הקשר הפוטנציאלי - מחלות-, מינים-, תפקידים ייחודיים של MPs.
פרוטוקולים שתואר בתקשורת זו מספקות שיטה חסכונית, חדשניים וישימה ללמוד את הפונקציה של MPs על בריאות ומחלה. הם חלים רבים דגם אורגניזמים, איברים והתנאים גירוי. הם מאפשרים הזיהוי של מספר סוגים של חברי פרלמנט, יכול לשמש בעתיד לטפל הפונקציות שלהם הפרו דלקתיים ואנטי דלקתיות. לדוגמה, תיאר כך ניתן לחקור את הפונקציה של נויטרופיל-MPs הפצע אפיתל הריפוי במבחנה ו vivo בתוך. פרוטוקול הציג עבור בידוד של העכבר הנגזרות מח עצם PMNs הותאמה עם כמה שיפורים שיטה שתואר לעיל6.
יתר על כן, פרוטוקולים המתוארים במחקר זה מאפשרים זיהוי ואפיון של סמנים ספציפיים ניתן למצוא באתר נויטרופיל-MPs על ידי שתי שיטות משלימות: ווסטרן כתם, לזרום cytometry. אנו מוצאים כי immunoblotting של MPs באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים5 הוא קל ואמין, עם זאת, ההתקדמות רגישות של מכשירים cytometry זרימה, שיפור יחס הרעש-כדי-אות כעת לאפשר לצורך ניתוח נוסף של MPs בשיטה זו. הפרוטוקולים המתוארים במחקר זה לשלב את ההתקדמות והמלצות של מאמרי מחקר מקורי, כולל שינויים מהירות צנטריפוגה וזמן, התוספת של מדגם הקפאה/אחסון וסינון תנאים7 , 8וכיצד להפחית את "רעשי הרקע", לשפר את מגבלת זיהוי של נויטרופיל-MPs, ולהבחין בין גדלים שונים של MPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי IACUC מערבי. כל הניסויים הושלמו ב בהתאם ותאימות עם כל הרלוונטיים ההנחיות הרגולטוריות ומוסדיים. עובד תרומת דם, היה הסכמה מדעת שהוצגו, חתמו; בנוסף, בכל המקצועות האדם במחקר זה טופלו בהתאם להנחיות הפדרלי המוסדיות לרווחת האדם.
הערה: השלבים פרוטוקול מפורטים תחת מקטעי המשנה שלהלן: (i) העכבר מח עצם תא בידוד; (ii) נויטרופיל בידוד מ מאתר מח העצם; (iii) נויטרופיל בידוד של דם אנושי; (iv) MP בידוד של נויטרופיל Supernatants (על-ידי Ultracentrifugation); (v) אפיון MPs מאת המערבי סופג; (vi) אפיון MPs מאת Cytometry זרימה; (viii) יישום של MPs מבודד על המחקר פצע ריפוי
1. עכבר מח עצם תא בידוד
-
דיסקציה של עצם הירך, שוקה של הרגליים האחוריות העכבר
- להכין תיבה המתת חסד (למשל, קופסת עצה ריק 1 מ"ל) שאיפה של הרדמה. הוסף מספר טיפות של 100% איזופלוריין על גבי בד סטרילי מודבק הפנימי של מכסה קופסת פלסטיק. לפי הנחיות חדשות IACUC, בעלי חיים כדאי לא באים במגע ישיר עם איזופלוריין, ולכן מקום בעל קצה העכבר בין פד המכיל את איזופלוריין.
הערה: איזופלוריין הרדמה inhalational רב עוצמה, שצריך לנהוג בזהירות בתוך ברדס fume. - המתת חסד עכברים לפי המלצות IACUC. הנח את העכבר בתוך הקופסה המתת חסד שמתואר בשלב 1.1.1 1 – 5 דקות עד שהיא גוועה נשימה. ודא המוות של בעל החיים על-ידי ביצוע תאמת צוואר הרחם.
- הרם בעור בטן באמצעות פלדת אל-חלד, 12 ס מ מעוקל, פינצטה 0.17 מ"מ X 0.1 מ"מ, לחתוך את העור במחצית הדרך בין הגפיים העליונים והתחתונים. לקלף את העור מכאן בסעיף דיסטלי ביותר בגוף העכבר כולל הגפיים התחתונות. עם 10 ס מ, ישר לנתח מספריים, להסיר את שרירי הרגליים האחוריות, לנקוע את מפרק הירך עוזב את ראש עצם הירך ללא פגע.
- להשתמש במספריים כדי לנתח את השרירים לבין עצם הירך עצם השוקה, להפריד בין עצם הירך לבין עצם השוקה. ודא שקצות העצמות נשארים בעינם כמו שהם מכילים כמויות משמעותיות של מח העצם.
- הסר כל בשר שנותרו על ידי גלגול העצמות בתוך מגבת נייר. מניחים את העצמות נקי בצלחת פטרי המכילות בינוני ללא סרום (SFM, קרי, הבינונית ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM) ללא סרום או אנטיביוטיקה).
- יש לשטוף את העצמות אתנול 70% וב -SFM.
- להכין 50 מ של SFM צינור חרוטי 50 מ. לטעון 10 מ"ל של SFM לתוך מזרק 10 מ"ל ולחבר אותו מחט בקוטר 25 ו- 5/8 אינץ '.
- לקצץ את הסוף של העצמות עם מספריים עד פתח במח העצם (צבע אדמדם) יהיה גלוי.
- לרוקן את התאים במח העצם לתוך צינור 50 מ. השתמש מזרק 10 מ"ל עם מחט מד 26, 5/8 אינץ ' עם 3 מ ל/עצם של SFM. בסיום השטיפה, resuspend את התאים בצינור על-ידי pipetting (שימוש חד פעמי 1 מ"ל פלסטיק טיפים) לשבור אגרגטים התא.
- להכין תיבה המתת חסד (למשל, קופסת עצה ריק 1 מ"ל) שאיפה של הרדמה. הוסף מספר טיפות של 100% איזופלוריין על גבי בד סטרילי מודבק הפנימי של מכסה קופסת פלסטיק. לפי הנחיות חדשות IACUC, בעלי חיים כדאי לא באים במגע ישיר עם איזופלוריין, ולכן מקום בעל קצה העכבר בין פד המכיל את איזופלוריין.
2. נויטרופיל בידוד ממח העצם מאתר
-
פירוק תא אדום
- גלולה מח העצם שנאספו על ידי צריך שתוציאו ב x 350 גרם במשך 8 דקות ב 4 º C.
- Resuspend בגדר תא ב- 20 מ של 0.2% NaCl עבור 20-30 s כדי lyse השבר כדוריות דם אדומות. לא יעלה על 30 s כמו זה יגרום פירוק נויטרופיל. הוסף 20 מ של 1.6% NaCl לשחזור osmolality.
הערה: שלב זה עלול להוביל ההפעלה נויטרופיל מעט מאוד. - לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של PBS, צנטריפוגה כמו שלב 2.1.1 לעיל. הסר את תגובת שיקוע.
- המשך PMNs בידוד על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות.
-
בידוד של נויטרופילים על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות
- חמה polysucrose, סודיום diatrizoate פתרונות, עם צפיפות של 1.119 g/mL ו- 1.077 g/mL (ראה טבלה של חומרים), לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
- להכין polysucrose נתרן diatrizoate מעברי צבע טרי, מייד לפני יישום תא מח עצם על ידי לאט שכבות 3 מ"ל של הפתרון צפיפות 1.077 g/mL מעל 3 מ"ל של הפתרון צפיפות 1.119 g/mL 15 מ"ל צינורות חרוט.
הערה: הכנה של הפתרון הדרגתיות רחוק מדי מראש תגרום ערבוב של שכבות, טוהר נויטרופילים המסכן ושחזור. - Resuspend בגדר תאי מח העצם ב 1 מ"ל של PBS קר כקרח, כיסוי התליה תא הנוצרת על גבי diatrizoate polysucrose ו נתרן הדרגתי (לאט, כדי למנוע ערבוב השכבות).
- צנטריפוגה למשך 30 דקות ב g x 850 25 ° c-RT, ללא בלם. לשמור את ריאגנטים RT להפרדה יעילה של נויטרופילים של תאים אחרים הנמצאים במח העצם. לקבוע לצנטריפוגה ההאטה איטי כדי לאפשר את מעבר הצבע הנוצרת באופן יעיל ותחזוקה לאחר השלב צנטריפוגה.
- חזותית לאתר שכבה תא תאי-הממשק של PBS והפתרון צפיפות 1.077 g/mL (השכבה העליונה). להסיר רובד זה ואת שאר הפתרון צפיפות מבלי להפריע הלהקה נויטרופיל.
- לאסוף על שכבה שלמה של נויטרופיל כמה polysucrose הבסיסית ו נתרן diatrizoate 1.119 g/mL פתרון לתוך צינורות 15 מ"ל באמצעות פיפטה של העברה.
הערה: טוהר PMNs מבודדים תלויות הסרה מלאה של השכבה העליונה. - למעלה הצינורות עם PBS (מסונן דרך מסנן גודל הנקבוביות 0.1 מיקרומטר) מסוננות ולא צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות, ב 4 º C.
- לשטוף את PMNs pelleted עם 2 מ של PBS באמצעות צנטריפוגה תנאים כמו שלב 2.2.7.
- Resuspend ב 1 מ"ל של PBS מסוננים ולספור את PMNs מבודדים על ידי hemocytometer.
הערה: עבור שיטה זו בידוד, טוהר נויטרופיל וכתוצאה מכך מסתכם ~ 85-90%, כפי הוערכה על ידי cytometry זרימה. שאר מזהמות שברים מורכב בעיקר תאי לימפוציטים.
-
נויטרופיל גירוי לזירוז שחרור MP
הערה: יכול להיות מגורה PMNs לשחרר MPs באמצעות הפעלת תנאים שונים, לרבות N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-פעילים-13-אצטט (PMA) או אינטרפרון גמא (IFNγ). חשוב לציין, לפני סימולציה, PMNs יש לשמור על קרח בכל עת.- PMNs צנפה (300 x גרם, 5 דקות, 4 ° C) ו resuspend ב 0.1 מיקרומטר מסונן מאוזנת מלח פתרון של האנק פתרון (HBSS), המכיל את הסוכן מגרה של בחירה. גירוי אופטימלית, להשתמש פתרון גירוי µL 100 לכל 10 מיליון PMNs למשך 20-30 דקות ב 37 ° C 15 מ"ל צינורות.
הערה: ריכוזי activators הבאים שימשו בהצלחה בעבודה הקודמת: fMLF (0.5-1 מיקרומטר עבור האדם ו- 2-5 מיקרומטר עבור העכבר PMNs), ובחום (200 ננומטר), ו- IFNγ (100 ng/mL). אם המהדורה של MPs מראש שכותרתו היא הרצויה, דגירה unstimulated PMNs (1-5 x 106) עם N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (ראה טבלה של חומרים) (1 מיקרומטר ב 100 µL HBSS, 15 דקות, 37 ° C). להמשיך עם שלבים 2.3.1-2.3.3. - ספין למטה ב- g x 850 עבור 5 דקות ב 4 ° C, להסיר PMNs ולהעביר supernatants נטולת תא ל צינורות microcentrifuge 1.5 mL החדש.
- MP בידוד מ ללא תא supernatants, המשך לשלב 4.2.
- PMNs צנפה (300 x גרם, 5 דקות, 4 ° C) ו resuspend ב 0.1 מיקרומטר מסונן מאוזנת מלח פתרון של האנק פתרון (HBSS), המכיל את הסוכן מגרה של בחירה. גירוי אופטימלית, להשתמש פתרון גירוי µL 100 לכל 10 מיליון PMNs למשך 20-30 דקות ב 37 ° C 15 מ"ל צינורות.
3. נויטרופיל בידוד של דם אנושי
-
לגייס מתנדבים בריאים לחילוץ דם לפי הנחיות IRB מוסדיים.
- לאסוף דם מן האמה של מתנדבים בריאים לתוך הצינורות המכילים סודיום ציטרט זמינים מסחרית מ ל (ראה טבלה של חומרים).
- פיפטה 5 מ של פתרון לתוספי diatrizoate נתרן (צפיפות של 1.113 g/mL, ראה טבלה של חומרים) לתוך צינורות סטרילי 15 מ"ל, לאט שכבה 5 מ"ל של דם היקפיים אנושי טרי מבודד על גבי זה.
- Centrifuge צינורות למשך 50 דקות ב 400 x ג'י ב- RT (25 ° C) עם האצת נמוכה, בלי בלמים.
- בסוף צנטריפוגה, להסיר את הפלזמה תאים תאי (השכבה העליונה) באמצעות פיפטה היניקה פלסטיק סטרילית.
- להעביר את השכבה התחתונה (PMNs) לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ.
- הוסף אמצעי שווה של 0.45% NaCl כדי PMNs (מערבבים היטב ובעדינות על-ידי סיבוב הצינור).
- צנטריפוגה 10 דקות ב 400 g x ב- 25 ° C.
-
פירוק תא אדום
- להוסיף 10 מ של מים קפואים, סטרילי לתאים מגורען עבור 45 s ואחריו 10 מ"ל של קרח סטרילי 1.8% NaCl לשחזור osmolality.
הערה: כל הפעולות הבאות לבידוד נויטרופיל צריכה להתבצע על קרח כדי למנוע הפעלת נויטרופיל ושחרור MP מוקדמת. הצעד פירוק עצמה גורמת הפעלה נויטרופיל קטנה, אך לא משמעותיים, עם זאת, חיוני עבור בידוד אוכלוסיה נויטרופיל טהור עבור מבחני פונקציונלי. - Centrifuge התאים 10 דקות ב 250 g x ב 4 ° C עם ההאטה רך.
- חזור על שלבים 3.2.1 ו- 3.2.2.
- Resuspend PMNs ב 5 מ של HBSS קר כקרח ללא סידן או מגנזיום. לספור תאים חיים הכולל (להשתמש א hemocytometer הכדאיות מכתים-1:2 דילול, ראה טבלה של חומרים) לפני גירוי.
הערה: PMNs מבודדים אמור לשמש גירוי או ניסויים אחרים בתוך שעתיים של בידוד כדי למנוע שינויים פונקציונליים, סלולר ומוות של תאים.
- להוסיף 10 מ של מים קפואים, סטרילי לתאים מגורען עבור 45 s ואחריו 10 מ"ל של קרח סטרילי 1.8% NaCl לשחזור osmolality.
4. MP בידוד של נויטרופיל שהופעל Supernatants
הערה: פרוטוקול דומה משמש את ניתוקה של MPs של PMNs מאתר ואנושי.
- PMNs צנפה (300 x גרם, 5 דקות, 4 ° C) ו resuspend ב 0.1 מיקרומטר מסונן פתרון HBSS, המכיל את הסוכן מגרה של בחירה (ראו דוגמה 1 מיקרומטר fMLF, הערה: 2.3.1). לגירוי אופטימלית להשתמש פתרון גירוי µL 100 לכל 10 מיליון PMNs למשך 20-30 דקות ב 37 ° C 15 מ"ל צינורות.
- גירוי הבאים, ספין למטה PMNs מופעל ב- g x 600 עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהעביר ללא תא supernatants צינורות microcentrifuge 1.5-mL החדש.
- Centrifuge את תגובת שיקוע נויטרופיל-והפנים-13,000 x גרם, 10 דקות, 4 ° C כדי להסיר שאריות תאים ולהעביר את תגובת שיקוע שנוקה לתוך צינור ultracentrifuge.
- צנטריפוגה עבור 1 h ב g x 100,000, ב 4 º C. הסר את supernatants לפני האחסון MP. לפי הצורך, חנות מגורען MPs של פרפין אטום צינורות ultracentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש בניסויים.
5. בחינת נויטרופיל-MPs מאת סופג המערבי
- להוסיף 1% מרחביות מאגר (µL 50-200 עם pH טריס 100 מ מ: 7.4) חברי פרלמנט גלולה (מתוך שלב 4.4), העברה אל צינורות microcentrifuge החדש של 1.5 mL. והרתיחו שהמשטרה הצבאית lysed במשך 5 דקות.
הערה: המספר של MPs ונפח מאגר פירוק חייב להיות מותאם והם ממוטבים עבור כל חלבון עניין. -
לטעון כמויות שוות של נויטרופיל-MPs בנתיב בטעינת מאגר המכיל 10% β-mercapto-אתנול.
הערה: עם השיטה שלנו אנו לטעון MPs שהיו שבודד אותו מספר של PMNs מגורה.- להפריד את lysates על ידי עמודים מרחביות על 10% לזיהוי ג'ל (השתמש V 50-100 עבור h 1-1.5) ולהעביר סך החלבונים על גבי ממברנות ניטרוצלולוזה כפי שמתואר9.
- לחסום ממברנות h 1 עם 5% חלב דל שומן בתוך תמיסת מלח באגירה Tween-20 טריס 0.05%, דגירה זה עם ראשי המתאים (בן לילה ב 4 ° C), ואחריו נוגדנים מצומדת HRP משנית.
- דמיינו הלהקות על-ידי הוספת פתרון chemoluminescence קרום וחשיפה סרט צילום רנטגן בתוך קלטת אור-הוכחה (h 1-24).
6. בחינת נויטרופיל-MPs מאת Cytometry זרימה
-
עבור נוגדן מכתים, לדלל נוגדנים כראוי במאגר FACS (PBS עם 0.1 מ"מ EDTA, אזיד הנתרן 0.1%). Resuspend מגורען נויטרופיל-MPs (נגזר 1-3 x 106 PMNs/תנאי) בתמיסה נוגדן 100 µL.
- אם צביעת עבור Annexin V, resuspend מגורען נויטרופיל-MPs במאגר Annexin V המכיל 5 µL של FITC מצומדת Annexin V. אם שותף מכתים עם נוגדנים, להוסיף את הנוגדן הרצוי (עבור ראה דוגמה טבלה של חומרים) ישירות אל הפתרון Annexin V. להוסיף צבע השומנים פלורסנט, N-(2-aminoethyl) maleimide (ראה טבלה של חומרים), ב- 1 ריכוז מיקרומטר 100 µL FACS מאגר תווית ולזהות MPs.
- דגירה למשטרה. הצבאית ב מכתים פתרון לפחות 20 דקות ב 4 º C.
- לשטוף את MPs מאת ultracentrifugation (1 h ב g x 100,000, ב 4 ° C); למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend במאגר FACS ולהפעיל את הדגימות cytometer זרימה המיועדת מצויד יחידה אלקטרונית המשודרגת של רגישות מוגברת (ראה טבלה של חומרים).
7. יישומים עבור מבודד נויטרופיל-MPs ללמוד לתפקד נויטרופיל ריפוי הפצע
-
In vivo הניהול של נויטרופיל-MPs לפצעים חוקן
- עזים ומתנגד עכברים על ידי זריקה בקרום הבטן של תערובת של קטאמין (100 מ ג/ק ג) חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג). לאשר הרדמה על ידי פדלים רפלקס (הבוהן המשרד צביטה) ולהתאים במידת הצורך.
- הנח את העכבר על הבטן שלו, באמצעות מלקחיים 28 ס מ ביופסיה באנדוסקופ מצויד with a מצלמה ברזולוציה גבוהה (כגון אנדוסקופ וטרינרי לשימוש בבעלי חיים קטנים, ראה טבלה של חומרים), ליצור 3-5 פצעים שטחיים לאורך הצד הגבי של המעי הגס. עם סיום ופצעו, עכברים החזרה לכלוב להציב על מזרון מבוקרי טמפרטורה (37 מעלות) עד התאושש.
- עזים ומתנגד עכברים (כמו שלב 7.1.1). אשתמש באנדוסקופ כדי לרכוש תמונות של הפצעים נגרמו ופצעו 24 שעות (יום 1) פוסט. תן עכברים לשחזר כמו שלב 7.1.2.
- באותו זמן (24 שעות שלאחר ופצעו), לנהל מאתר נויטרופיל-MPs נגזר PMNs6 2 x 10 ב 100 µL של HBSS + ישירות לתוך כל אתר הפצע באמצעות המערכת (השתמש מחט ג'י 29) המבוסס על קולונוסקופיה microinjection9. שלושה ימים מאוחר יותר (יום 4 פוסט ופצעו) עזים ומתנגד עכברים (כמו שלב 7.1.1) ולהשתמש באנדוסקופ לחלץ. את תמונות של ריפוי פצעים. תן עכברים לשחזר כמו שלב 7.1.2.
- באמצעות תוכנת ניתוח התמונות המועדף (ראה טבלה של חומרים), אזורים לרמות פצע נראה לעין בתמונות הנרכש, למדוד האזור של אותו פצע ימים 1 ו- 4 פוסט ופצעו, ולחשב את האחוז של סגירת הפצע.
-
האדם אפיתל תאי במבחנה ריפוי הפצע
- ספירת קאקו-2 BBe או T84, האדם בתאי אפיתל המעי מאת hemocytometer, זרע 5 x 105 תאים/טוב ב- 24-ובכן תרבות צלחות. דגירה התאים בחדר דגירה סטנדרטי-CO 37 ° C ו-5%2. קאקו-2 BBe או T84 להגיע confluency בתוך 48 שעות9. התרבות תאים אפיתל, להשתמש DMEM ו- DMEM-F12 (50: 50) עם תוספי כאמור תיאר9.
- צור פצעי גירוד מכאני ב טפט באמצעות פיפטה עצה יניקה נמוכה כפי שתואר לעיל4,9. לרכוש תמונות של הפצע אזורים מיד לאחר גירוד באמצעות מיקרוסקופ התערבות דיפרנציאלית שלב הפוכה-ניגודיות (מטרות השימוש 5 X או 10 X), כדי לשמש זמן = נקודת התייחסות 0.
- הוסף MPs (נגזר 2-4 X 106 PMNs) monolayers תא אפיתל שרוט-פצועים ולאחר תקופת דגירה של h 24 נוספים (48 שעות שלאחר ופצעו, ב 37 ° C עם 5% CO2). בשלב זה מחדש לרכוש תמונות של השריטה-הפצעים.
- השתמש בתוכנת ניתוח התמונות המועדף (ראה טבלה של חומרים) כדי למדוד את הפצע אזורים ב- t = 0 ו- t = 48 ח' חשב אחוז סגירת הפצע על ידי לקבוע את ההבדל באזור הפצע בנקודות זמן נבחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח cytometric תזרים נציג של MPs היו מבודדים מן האדם, עכבר PMNs מוצגים באיור1. גודל הטרוגניות של נויטרופיל-MPs יכול להיות מוערך על ידי השוואה כדי החרוזים בגודל ידוע, כפי שמוצג באיור 1A, B עבור האדם MPs. הערה, אין הבדל משמעותי בין גודל הטרוגניות נצפו בין העכבר MPs אנושי. באופן דומה, באמצעות cytometry זרימה ולקרוא פלורסצנטיות, ביטוי של חלבונים/s של בחירה על ידי MPs מבודד של העכבר או ממקור אנושי יכול להיקבע. לדוגמה, הביטוי של Phosphatidyl סרין (PhS) יכולים להיבדק על ידי צביעת Annexin V. מח עצם מאתר נויטרופיל-MPs מוצגים באיור 1C, D. גם יכול להיות מוערך ביטוי של מספר סמנים של בחירה כפי שמוצג Annexin V ו CD11b מכתים של MPs אנושי, איור 2A, B. שיטה נוספת כדי לזהות נויטרופיל-MPs cytometry זרימה היא כתם טרי בודדים PMNs לפני גירוי כפי שמוצג באיור 2C. לדוגמה, נויטרופיל מכתים עם הסמן השומנים N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC לפני fMLF תוצאות גירוי במהדורה של MPs ירוק, זה יכול בקלות יזוהו על-ידי זרימה. ראוי לציין, בעת צביעת עם N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC בעבר שימש תווית ולגלות MPs המתקבל דם אנושי היקפיים10 או מוזרק לבעלי חיים11, השימוש של סמנים אחרים עבור תיוג המטרות עבור במבחנה או ויוו יישום צריכה להיקבע על ידי כל חוקר. בנוסף cytometry זרימה, ניתן לנתח נויטרופיל-MPs מאת immunoblotting חלבונים עניין. כפי שמוצג באיור 3, MPs נגזר PMNs אנושי זה היו מגורה עם מספר מפעילים ידוע, נבדקו עבור הביטוי של מפתח דלקתיים (metallopeptidase מטריקס 9 (MMP-9), myeloperoxidase (MPO)), מולקולות דלקתיות (Annexin A1). כמו מאליו של נציג immunoblots, גירוי נויטרופיל עם IFNγ (50 ng/mL), ובחום (200 ננומטר), fMLF (1 מיקרומטר) וכתוצאה MPs ביטוי ברמות שונות של MMP-9. עם זאת, היחידה למבוכת שלד התא אקטין מאת Latrunculin B (1 מיקרומטר) לפני גירוי עם fMLF (5 מיקרומטר) הובילה שופע המצאות MPO ב נויטרופיל-MPs. באופן דומה, רמות משתנות של Annexin A1 (גבוה אין זיהוי) אותרו ב- MPs בעקבות הפעלת התנאים המתוארים. תוצאות אלו מראים כי הרכב נויטרופיל-MP הוא גירוי מותנה.
לבסוף, איור 4 מראה כיצד מבודדים נויטרופיל-MPs ניתן ללמוד פצע ריפוי במבחנה , ויוו בפציעה חוקן. ניתן להוסיף נויטרופיל-MPs פצועים שריטה monolayers אפיתל בתרבויות, איפה הריפוי ניתן יהיה פיקוח על ידי הדמיה רכישה בנקודות זמן שנקבע מראש. נוסף יכול להיות microinjected MPs ישירות לתוך הפצעים חוקן, אשר נוצרו על ידי מלקחיים ביופסיה אנדוסקופית הדמיה9, ואת השפעתם על ריפוי יכול להיות מוערך. עבור שניהם בתוך חוץ גופית ויוו וניתוח של ריפוי הפצע, תמונות של הפצעים נגרמו נרכשים מיד פוסט ופצעו (או אחרת כפי שצוין) והן באופן רציף באמצעות תהליך הריפוי בנקודות זמן שנקבע מראש. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה זמינים מסחרית, שינויים באזור הפצע (גודל) שנמדד הינם בשימוש כדי לקבוע את קצב סגירת הפצע. יישום של נויטרופיל-MPs המכילים MPO גם תרבותי monolayers אפיתל או ויוו לפצעים שטיפת המעי הגס יש השפעות מזיקות, המוביל אל הריפוי מתעכב9.
איור 1 . ניתוח של נויטרופיל-MP גודל סמני פני השטח על ידי cytometry זרימה. (א) cytometer זרימה ממוטב חרוזים שליטה (ראה טבלה של חומרים) בגדלים ידוע, פיזור ערכי מוצגים בייצוג אורתוגונלית האס ו- FSC. החרוזים משמשים את גודלו היחסי השוואה עם מדגם נויטרופיל-MP שמוצג ב' (B) אנושי נויטרופיל-MPs היו מבודדים, נותחו על ידי cytometry זרימה באמצעות בתנאים המתוארים על החרוזים. ניתן לראות את הטרוגניות בגדלים MP. (C–D) MPs נגזר מגורה-fMLF מח עצם מאתר PMNs נותחו על ידי cytometry זרימה. דיאגרמות זרימת נציג להראות וללא רבב (C) או Annexin V-FITC צבעונית (D) MPs. מראה אזור מלבני Annexin V-חיוביות MPs (MPs FITC-חיוביים). האס: לצד פיזור; FSC: פיזור קדימה; PhS: Phosphatidyl סרין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . נויטרופיל-MP מכתים וניתוח מאת cytometry זרימה. אזור Unstained (א) ו- (B) Annexin V-FITC ו- hCD11b-APC-מוכתם MPs. כיכר יקיף אוכלוסיה זוגי Annexin V/CD11b חיובי של נויטרופיל-MPs-(C) טרי מבודד PMNs האנושית (1 x 106) היו מוכתמים של הפלורסנט , N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC, גירוי עם fMLF. MPs הם בודדו אותנו מהמתרחש תא supernatants, נותחו על ידי cytometry זרימה. אזור מלבני יקיף N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC חיובי MP אוכלוסיה (M-FITC, תווית ציר-y). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . ההרכב של נויטרופיל-MPs הוא גירוי תלוי. PMNs האנושית (א) היו מגורה עם IFNγ, TNFα, fMLF, ובחום, או שילוב של latranculin B ואחריו fMLF (LtB-fMLF). MPs הם בודדו אותנו מהמתרחש supernatants התא שנוצר על ידי ultracentrifugation, חלבון lysates הוכנו במאגר מרחביות 1%. חלבונים היו מופרדים על-ידי גודל electrophoretically ב- 10% לזיהוי ג'ל, הועבר קרום ניטרוצלולוזה, שנבדק על נוגדן ראשוני MMP-9, MPO, או Annexin A1 ואחריו נוגדנים המתאימים משני מצומדת HRP. מיקרוסקופ אלקטרונים נציג (B) מתארים תמונות של נויטרופיל אנושי-MPs גודל הטרוגניות. Exosome < 100 ננומטר בגודל זה שמציין החץ הלבן. סרגל קנה מידה = 250 ננומטר (לוחות שמאלה וימינה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: השימוש של נויטרופיל-MPs מבודד לומד את התפקיד של PMNs בתוך האפיתל הגלדה. BBe קאקו-2 (א) אדם בתאי אפיתל המעי מצופים confluency, פצע שריטה של כלפיהן MPs נגזר 3 מיליון PMNs, אשר נוספו מיד לאחר פציעתו. להחליפן בתמונות הצג סגירת הפצע (48 שעות שלאחר ופצעו) ובקרה (לוחות שמאלה) נויטרופיל-MP-טיפול בתאי אפיתל (לוחות נכון). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) כדי לבחון את ההשפעה של נויטרופיל-MPs על חוקן פצע ריפוי ויוו, מבודד נויטרופיל-MPs הוזרקו ישירות לתוך אזור הפצע באמצעות מערכת מבוססת-אנדוסקופיה microinjection (24 שעות שלאחר ופצעו, הפצע חוקן הוא המתוארים על ידי קו מקווקו ואת הזריקה באתר מוצג על ידי חץ לבן). סגירת הפצע היה המוערך 3 ימים לאחר מכן (4 ימים שלאחר ופצעו) על ידי הדמיה אנדוסקופי. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. (ג) 4 ימים שלאחר ופצעו עכברים היו מורדמים, פצעים הרירית חוקן היו חילוץ עם מספריים, בתוך המתחם טמפרטורה (O.C.T) חיתוך האופטימלי, קפוא עם חנקן נוזלי. מיקרומטר שמונה קטעים של הפצעים היו מוכתמים E-קדהרין (ירוק), הכתם גרעיני דאפי (כחול) להעריך את רמת epithelialization מחדש (לוחות העליון), או דאפי (כחול), Ki67 (אדום) להמחיש בתאי אפיתל הכולל, מתרבים- הקצה את הפצע (לוחות נמוכה יותר). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקולים עבור בידוד ואפיון של נויטרופיל-derived MPs מתוארים תקשורת זו. מספר נקודות קריטיות מפתח חייב להילקח בחשבון להצלחת ההליך. ראשית, PMNs בטח טרי? כן, להשתמש בניסויים בתוך שעתיים של בידוד כדי למנוע הפעלת ספונטנית ו degranulation. כל הטיפול PMNs במהלך בידוד, עד לנקודה של גירוי חייב להתבצע על קרח כדי למנוע הפעלה ו- MP מוקדמת שחרור12. שנית, ultracentrifugation 1 h או יותר מגדיל את pelleting MPs. שלישית, לניתוח על ידי cytometry זרימה, הכלי חייב מכוילת כראוי עם שילוב של חרוזים פלורסנט מוגדרים על-ידי כלי נגינה (הסוג חרוזים מותאם מסוים כלי) להגדרת כראוי בגדלים MP. לדוגמה, בעוד ליצרן אחד זרימה cytometers ממליצה להשתמש FSC חרוזים כפרמטר הקשורים לגודל, אחרים מוטבו עבור האס חרוזים. בנוסף, cytometer זרימה כדי לשמש לניתוח MP חייב להיות מצויד אלקטרוניקה משודרגת בצורה הטובה ביותר לפתור MPs של רעשי הרקע.
לזהות כראוי של MPs בנוסף הפרמטרים לגודל, השימוש של זריחה מכתים כמתואר לעיל ההליכים היא מומלצת מאוד. יתר על כן, כל הפתרונות במהלך ההכנה, בידוד לסנן דרך מערכת סינון מיקרומטר 0.1 כדי למזער את ההכללה של חלקיקי אבק או אחרים פוחת משקעים שיגבירו את רעשי הרקע במהלך הרכישה על ידי cytometry זרימה. חשוב להתייחס תנאי אחסון של MPs. ראיות קטן8, ותצפיות שלנו שלא פורסמו, מראים כי MP קפוא מוביל ולמסמנים ממברנה שבירה MP. לבסוף, תנאי ההפעלה נויטרופיל ותזמון משתנה עשויה לשנות ולשפר MP התשואה.
ישנן כמה מגבלות לשיטה זו. בידוד של העכבר PMNs של מח העצם הוא בדרך כלל לא טהור (~ 85-90%), מזוהם על ידי תאים חיסוניים אחרים (בעיקר תאי לימפוציטים) כפי נקבע ע י ניתוח תזרים cytometric. לפיכך, מבודד וכתוצאה מכך עשויים לכלול כמויות קטנות של MPs שפורסמו על ידי תאים חיסוניים אחרים. חלופות זמינות כוללות בידוד של PMNs על ידי beads מגנטי זמינים מסחרית, עם זאת, זה יהיה ארוך יותר, הליך משמעותי costlier. לבסוף, ללא קרינה פלואורסצנטית תיוג, בנוסף גודל פרמטרים, הבידול סופית של MPs מפני אבק או חלקיקים אחרים מסיסים או באוויר בגדלים דומים זה יכול לזהם את הדגימה היא מאתגרת ומועדת לשגיאות.
בעתיד, מיון של נויטרופיל-MPs שכותרתו עם סמנים מסוים יעזור להבהיר MP הרכב תחת תנאים מופחתים מסוימים או מודלים של המחלה, ולאפשר בתקווה לשימושם של חברי פרלמנט סמנים אבחון, מטרות טיפוליות אפשריות לטיפול מחלות דלקתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין ניגוד עניינים כלשהם הקשורים תקשורת זו
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של ד ר Suchitra חסוי שמנהל את ליבת נורת'ווסטרן פיינברג הספר של רפואה Flow Cytometry מימון סופק על ידי DK101675 (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
