Summary
Novos protocolos são descritos aqui para isolar e caracterizar micropartículas derivadas de humanos e neutrófilos de rato. Estes protocolos utilizam ultracentrifugação, citometria de fluxo e immunoblotting técnicas para analisar o conteúdo de micropartículas, e eles podem ser usados para estudar o papel das micropartículas derivados de vários tipos de células na função celular.
Abstract
Micropartículas de derivado de neutrófilos polimorfonucleares (PMN)-MPs) são bicapa lipídica, aumentada esféricas com tamanhos que variam de 50 – 1.000 nm de diâmetro. MPs são uma recém evoluindo, parte importante de máquinas de sinalização e comunicação célula a célula. Por causa de seu tamanho e a natureza de sua libertação, até recentemente, existência de MP foi negligenciada. No entanto, com tecnologia melhorada e métodos analíticos a sua função na saúde e na doença está a emergir. Os protocolos aqui apresentados destinam-se a isolar e caracterizar PMN-MPs pelo immunoblotting e citometria de fluxo. Além disso, vários exemplos de implementação são dadas. Esses protocolos para isolamento de MP são rápidos e de baixo custo e não exigem o uso de kits caros. Além disso, eles permitem a rotulagem do MPs após isolamento, bem como pré-marcação de células de origem antes da liberação do MP, usando um corante fluorescente de membrana específicos para visualização e análise por citometria de fluxo. Esses métodos, no entanto, tem várias limitações, incluindo a pureza do PMN e MPs e a necessidade de instrumentação analítica sofisticada. Um citômetro de fluxo high-end é necessário confiável analisar MPs e minimizar falsas positivas leituras devido ao ruído ou autofluorescência. Os protocolos descritos podem ser usados para isolar e definir a biogênese de MP e caracterizam seus marcadores e variação na composição sob diferentes condições de estimulantes. Heterogeneidade de tamanho pode ser explorada para investigar se o conteúdo de partículas de membrana contra exosomes é diferente, e se cumprem papéis diferentes na homeostase do tecido. Finalmente, seguir isolamento e caracterização de MPs, sua função na resposta celular e vários modelos de doença (incluindo, desordens inflamatórias associadas PMN, tais como doenças inflamatórias intestinais ou lesão pulmonar aguda) podem ser explorados.
Introduction
Recentemente, "micropartículas/aumentada" provenientes do citosol celular ou membrana plasmática tornaram-se de grande interesse científico, como dados emergentes sugerem que estas estruturas, que variam de 50-1.000 nm de diâmetro, podem carregar informações biológicas e Servi como um método não-canônicos de comunicação celular. Imunológico derivado de células MPs e particularmente aqueles produzidos por neutrófilos polimorfonucleares (PMN) são de grande interesse, dado o papel importante de PMN no anfitrião defesa1,2, respostas inflamatórias3e cicatrização de feridas 4. é intrigante, até agora, inúmeros relatos mostraram funções pró-inflamatórias e anti-inflamatórias do PMN-MPs5, sugerindo um potencial contexto-, doença, espécie- e papel de órgão específico de MPs.
Protocolos descritos na presente comunicação fornecem um método econômico, inovadora e adaptável para estudar a função do MPs na saúde e na doença. São aplicáveis a muitos organismos modelo, órgãos e as condições de estimulação. Eles permitem a identificação de vários tipos de MPs e podem ser usados no futuro para abordar suas funções pro-inflamatórias e antiinflamatórias. Como exemplo, descrito aqui é como estudar a função de PMN-MPs em epiteliais ferida cura in vitro e em vivo. O protocolo apresentado para isolamento de rato PMN derivadas da medula óssea foi adaptado com algumas modificações de um método descrito anteriormente6.
Além disso, os protocolos descritos neste estudo permitem para a detecção e caracterização de marcadores específicos que podem ser encontrados na PMN-MPs por dois métodos complementares: Western blot e citometria de fluxo. Encontramos que immunoblotting de MPs usando protocolos padrão5 é fácil e confiável, no entanto, os avanços recentes na sensibilidade dos instrumentos de citometria de fluxo e relação de sinal-para-ruído melhorada agora permitam para posterior análise de MPs usando esse método. Os protocolos descritos neste estudo incorporam avanços recentes e recomendações de artigos originais de pesquisa, incluindo modificações de velocidade de centrifugação e tempo, a adição da amostra de filtragem e congelamento/armazenamento condições7 , 8e como reduzir o "ruído de fundo", aumentar o limite de detecção do PMN-MPs e discriminar entre diferentes tamanhos de MPs.
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Protocol
Todo o trabalho animal foi aprovado pelo IACUC a noroeste. Todos os experimentos foram concluídos em conformidade e em conformidade com todas as orientações institucionais e regulamentares pertinentes. Para doar sangue de seres humanos, um consentimento informado foi apresentado e assinado; Além disso, todos os seres humanos neste estudo foram tratados em conformidade com as orientações institucionais e federais para o bem-estar humano.
Nota: Os passos de protocolo são listados sob as subseções a seguir: (i) Mouse isolamento de célula da medula óssea; (ii) PMN isolamento de murino medula óssea; (iii) PMN isolamento de sangue humano; (iv) MP isolamento de PMN sobrenadantes (por ultracentrifugação); (v) a caracterização de MPs por mancha ocidental; (vi) caracterização de MPs por citometria de fluxo; (viii) a aplicação do MPs isolados para estudo ferida cura
1. Mouse isolamento de célula da medula óssea
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Dissecação do fêmur e tíbia das patas do rato
- Prepare uma caixa de eutanásia (por exemplo, uma caixa de dica vazio 1ml) para inalação de anestesia. Adicione algumas gotas de 100% de isoflurano em um pano estéril gravado no interior de uma tampa de caixa plástica. Conforme novas diretrizes IACUC, animais não deve entrar em contato direto com isoflurano, assim, coloque um suporte de ponta entre o rato e a gaze contendo o isoflurano.
Nota: Isoflurano é um poderoso anestésico inalatório e deve ser manuseado com extremo cuidado dentro de uma coifa. - Eutanásia em ratos conforme recomendação IACUC. Coloca um rato dentro da caixa de eutanásia descrita na etapa 1.1.1 para 1-5 min até que tenha cessado de respirar. Assegurar a morte do animal, realizando um deslocamento cervical.
- Levante a pele abdominal usando o aço inoxidável, 12 cm curvada, pinça de 0,17 X 0,1 mm e cortar a pele, a meio caminho entre as extremidades superiores e inferiores. Tirar a pele daqui a secção mais distal do corpo do mouse, incluindo nas extremidades inferiores. Com 10 cm de comprimento, em linha reta dissecando a tesoura, remover os músculos das pernas traseiras e deslocar a articulação do quadril, deixando a cabeça do fémur intacto.
- Use a tesoura para dissecar os músculos do fêmur e da tíbia e separar o fêmur a tíbia. Certifique-se de que as extremidades dos ossos permanecem intactas, pois eles contêm quantidades significativas de medula óssea.
- Retire toda a carne restante rolando os ossos dentro de uma toalha de papel. Coloque os ossos limpos em uma placa de Petri contendo meio livre de soro (SFM, i.e., médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) sem soro ou antibióticos).
- Lave os ossos em etanol a 70% e depois em SFM.
- Prepare 50 mL de SFM em um tubo cónico de 50 mL. Carregar 10 mL de SFM em uma seringa de 10 mL e anexá-lo a uma agulha de calibre 25 e 5/8 de polegada.
- Apare a extremidade dos ossos com uma tesoura até uma abertura para a medula óssea (cor avermelhada) é visível.
- Lave as células da medula óssea para um novo tubo de 50 mL. Utilize uma seringa de 10 mL com uma agulha de calibre 26 e 5/8 de polegada com cerca de 3 mL/osso de SFM. Quando terminar a lavagem, Ressuspender as células no tubo pipetando (pontas aplicadoras descartáveis 1ml plástico) para quebrar os agregados de células.
- Prepare uma caixa de eutanásia (por exemplo, uma caixa de dica vazio 1ml) para inalação de anestesia. Adicione algumas gotas de 100% de isoflurano em um pano estéril gravado no interior de uma tampa de caixa plástica. Conforme novas diretrizes IACUC, animais não deve entrar em contato direto com isoflurano, assim, coloque um suporte de ponta entre o rato e a gaze contendo o isoflurano.
2. o PMN isolamento de murino de medula óssea
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Lise de eritrócitos
- Pelota de medula óssea coletada por centrifugação a 350 x g por 8 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em 20 mL de 0,2% NaCl para aproximadamente 20-30 s para lisar a fração de eritrócitos. Não exceda 30 s como isto irá resultar em lise PMN. Adicionar 20 mL de 1,6% NaCl para restaurar a pressão osmótica.
Nota: Este passo pode levar à ativação de PMN muito pouco. - Lave as células com 2 mL de PBS e centrífuga como na etapa 2.1.1 acima. Remova o sobrenadante.
- Prossiga para isolar PMN por centrifugação gradiente de densidade.
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Isolamento de neutrófilos por centrifugação gradiente de densidade
- Polysucrose e sódio diatrizoate soluções warm, com densidades de 1,119 g/mL e 1,077 g/mL (ver Tabela de materiais), à temperatura ambiente (RT) antes do uso.
- Prepare polysucrose e sódio gradientes diatrizoate frescos, imediatamente antes da aplicação de célula da medula óssea por camadas lentamente 3 mL da solução de densidade acima de 3 mL da solução de densidade de 1,119 g/mL em tubos cônico de 15 mL de 1,077 g/mL.
Nota: A preparação da solução de gradiente demasiada antecedência irá resultar em mistura das camadas e pobre pureza dos neutrófilos e recuperação. - Resuspenda o pellet de células de medula óssea em 1 mL de PBS gelado e sobrepor a suspensão resultante da célula no topo do diatrizoate polysucrose e sódio gradiente (lentamente, para evitar a mistura das camadas).
- Centrífuga para 30 min a 850 x g a 25 ° C, a RT, sem freio. Manter os reagentes à RT para a separação eficaz dos neutrófilos de outras células presentes na medula óssea. Defina o centrifugador a desaceleração lenta para permitir o gradiente eficientemente ser formado e mantido após a etapa de centrifugação.
- Localize visualmente uma camada de células mononucleares na interface de PBS e 1,077 g/mL de solução de densidade (camada superior). Remova esta camada e o resto da solução de densidade sem perturbar a banda PMN.
- Colete uma camada inteira de PMN e alguns dos polysucrose subjacente e sódio diatrizoate 1,119 g/mL de solução em tubos de 15 mL com uma pipeta de transferência.
Nota: A pureza do PMN isolado vai depender de uma completa remoção de camada superior. - Cubra os tubos com filtrado PBS (filtrada através de um filtro de tamanho de poro de 0,1 µm) e centrifugar 300 x g por 5 min, a 4 ° C.
- Lave o PMN peletizadas com 2 mL de PBS usando condições de centrifugação, como na etapa 2.2.7.
- Resuspenda em 1 mL de PBS filtrada e contar o PMN isolado por hemocytometer.
Nota: Para este método de isolamento, a pureza PMN resultante equivale a ~ 85-90%, como foi avaliada por citometria de fluxo. O restante fracções a contaminar constituída principalmente por linfócitos mononucleares.
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Estimulação do PMN para induzir liberação de MP
Nota: PMN pode ser estimulada para libertar MPs usando várias condições de activação, incluindo N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-miristato-13-acetato (PMA) ou interferão gama (relato). Importante, antes da simulação, PMN deve ser mantidos no gelo em todos os momentos.- Pelota PMN (300 x g, 5 min, 4 ° C) e ressuspender em 0.1 µm filtrada Balanced Salt (HBSS) solução do Hank, contendo o agente estimulante de escolha. Para a estimulação ideal, use solução de estimulação de 100 µ l por PMN 10 milhões para 20-30 min a 37 ° C em tubos de 15 mL.
Nota: As seguintes concentrações de ativadores foram usadas com sucesso em nosso trabalho anterior: fMLF (0,5-1 µM para humanos e 2-5 µM para rato PMN), PMA (200 nM) e relato (100 ng/mL). Se o lançamento do pre-etiquetados MPs é desejado, incubar unstimulated PMN (1-5 x 106) com N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (ver Tabela de materiais) (1 µM em 100 µ l HBSS, 15 min, a 37 ° C). Prossiga com as etapas 2.3.1-2.3.3. - Spin para baixo a 850 x g por 5 min a 4 ° C, para remover o PMN e sobrenadantes sem célula de transferência para novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL.
- Para isolamento de MP de sobrenadantes sem célula, continue a etapa 4.2.
- Pelota PMN (300 x g, 5 min, 4 ° C) e ressuspender em 0.1 µm filtrada Balanced Salt (HBSS) solução do Hank, contendo o agente estimulante de escolha. Para a estimulação ideal, use solução de estimulação de 100 µ l por PMN 10 milhões para 20-30 min a 37 ° C em tubos de 15 mL.
3. o PMN isolamento do sangue humano
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Recrute voluntários saudáveis para a extração de sangue de acordo com as orientações institucionais IRB.
- Colete o sangue do antebraço de um voluntário saudável em tubos de citrato de sódio, contendo 5ml comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).
- Pipetar 5 mL de solução de diatrizoate de dextrano e sódio (densidade de 1,113 g/mL, consulte Tabela de materiais) em tubos de 15ml estéril e, lentamente, camada 5 mL de recém isoladas do sangue periférico humano em cima dela.
- Centrifuga os tubos para 50 min em 400 x g em RT (25 ° C) com baixa aceleração e sem freio.
- No final da centrifugação, remova o plasma e células mononucleares (camada superior) utilizando uma pipeta de sucção plástica estéril.
- Transferi a camada inferior (PMN) para um novo tubo cônico estéril 50 mL.
- Adicionar um volume igual de 0,45% NaCl para PMN (misture bem e delicadamente girando o tubo).
- Centrifugação por 10min a 400 x g a 25 ° C.
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Lise de eritrócitos
- Adicionar 10 mL de água gelada e estéril para células peletizadas para 45 s seguido de 10 mL de estéril gelada 1,8% NaCl para restaurar a pressão osmótica.
Nota: Todos os passos seguintes para isolamento de PMN devem ser realizados no gelo para evitar a ativação de PMN e lançamento prematuro do MP. A etapa de Lise em si resulta em ativação de PMN menor mas não significativa, no entanto, é essencial para isolar uma população PMN pura para ensaios funcionais. - Centrifugar as células por 10 min a 250 x g a 4 ° C, com desaceleração suave.
- Repita as etapas 3.2.1 e 3.2.2.
- Resuspenda PMN em 5 mL de HBSS gelada sem cálcio ou magnésio. Contar as células ao vivo totais (usar um hemocytometer e viabilidade de coloração na diluição de 1:2, consulte a Tabela de materiais) antes de estimulação.
Nota: PMN isolado deve ser usado para estimulação ou outras experiências até 2 horas de isolamento, para evitar alterações funcionais e celulares e morte celular.
- Adicionar 10 mL de água gelada e estéril para células peletizadas para 45 s seguido de 10 mL de estéril gelada 1,8% NaCl para restaurar a pressão osmótica.
4. MP isolamento de PMN ativados sobrenadantes
Nota: Um protocolo similar é usado para a isolação de MPs de PMN murino e humano.
- Pelota PMN (300 x g, 5 min, 4 ° C) e ressuspender em 0.1 µm filtrado solução HBSS, contendo o agente estimulante de escolha (por exemplo 1 µM fMLF, ver Nota: 2.3.1). Para a estimulação ideal use solução de estimulação de 100 µ l por PMN 10 milhões para 20-30 min a 37 ° C em tubos de 15 mL.
- Estimulação seguir, spin para baixo PMN ativados a 600 x g por 5 min a 4 ° C e transferir sem célula sobrenadantes para novos tubos de 1,5 mL microcentrifuge.
- Centrifugue o sobrenadante PMN-limpou a 13.000 x g, 10 min, 4 ° C para remover detritos celulares e transferir o sobrenadante apurado para um novo tubo de se.
- Centrífuga para 1h a 100.000 x g, a 4 ° C. Remova os sobrenadantes antes do armazenamento do MP. Conforme necessário, loja peletizado MPs em parafina selado tubos se a-80 ° C até o uso em experimentos.
5. exame do PMN-MPs pela mancha ocidental
- Adicionar o buffer de SDS 1% (50-200 µ l com pH de 100 mM Tris: 7,4) ao MPs de Pelotas (da etapa 4.4), transferência para novos tubos de 1,5 mL microcentrifuga e ferver o MPs lisado por 5 min.
Nota: O número de deputados e o volume de tampão de Lise deve ser ajustado e otimizado para cada proteína de interesse. -
Carrega quantidades iguais de PMN-MPs por lane em carregar o buffer que contém 10% de β-mercapto-etanol.
Nota: Com o nosso método carregamos MPs que foram isoladas com o mesmo número de PMN estimulada.- Separar os lysates por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 10% (use V 50-100 para 1-1.5 h) e transferência de proteínas totais para membranas de nitrocelulose como descrito9.
- Bloco de membranas para 1 h com leite desnatado de 5% em 0.05% Tween-20 Tris salino e incube-lo com um primário apropriado (durante a noite a 4 ° C), seguido por anticorpos secundarios conjugados a HRP.
- Visualize as bandas adicionando solução de quimiluminescência para a membrana e exposição de um filme de raio-x dentro de um estojo à prova de luz (1-24 h).
6. exame do PMN-MPs por citometria de fluxo
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Para coloração de anticorpo, dilua a anticorpos apropriadamente no buffer de FACS (PBS com 0,1 mM EDTA, 0,1% de azida de sódio). Ressuspender peletizado PMN-MPs (derivado de 1-3 x 106 condição/PMN) em solução de anticorpo 100 µ l.
- Se a mancha para anexina V, resuspenda peletizado PMN-MPs em buffer anexina V contendo 5 µ l de conjugado FITC anexina V. Se co coloração com anticorpos, adicione os anticorpos desejados (para uma Tabela de materiais, consulte exemplo) diretamente para a solução de anexina V. Adicionar corante fluorescente lipídico, N-(2-aminoethyl) maleimide (ver Tabela de materiais), em 1 concentração de µM em 100 µ l de tampão de FACS para rotular e identificar o MPs.
- Incubar o MPs na coloração de solução pelo menos 20 min a 4 ° C.
- Lave o MPs por ultracentrifugação (1 h a 100.000 x g, a 4 ° C); desprezar o sobrenadante.
- Resuspenda em buffer de FACS e executar os exemplos de um citômetro de fluxo designado equipado com uma unidade eletrônica melhorada para aumento da sensibilidade (ver Tabela de materiais).
7. os pedidos de PMN-MPs isolados estudar a função PMN na cicatrização de feridas
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Administração in vivo de PMN-MPs para feridas do cólon
- ANESTHETIZE ratos por uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Confirmar a anestesia por pedal reflex (pitada de dedo firme) e ajustar conforme necessário.
- Coloque o mouse sobre seu estômago e usando a pinça de biopsia de 28 cm e um endoscópio equipado com uma câmera de alta resolução (tais como um endoscópio veterinário para uso de animais pequeno, consulte Tabela de materiais), gerar 3-5 feridas superficiais ao longo da face dorsal da dois pontos. Após a conclusão do ferimento, ratos de retorno para uma gaiola colocado sobre uma esteira de temperatura controlada (37 ° C) até que se recuperou.
- Anestesia os ratos (como na etapa 7.1.1). Use um endoscópio para obter imagens dos ferimentos infligidos 24 h (dia 1) pós-ferindo. Deixe os ratos recuperar como na etapa 7.1.2.
- Ao mesmo tempo (24h pós-ferimento), administre murino PMN-MPs derivados de 2 x 106 PMN em 100 µ l de HBSS + diretamente em cada local de ferida usando uma microinjeção de colonoscopia-baseado sistema (uso uma agulha 29g)9. Três dias mais tarde (4º dia pós-ferindo) anestesia os ratos (como na etapa 7.1.1) e usa um endoscópio para readquirir imagens de cura feridas. Deixe os ratos recuperar como na etapa 7.1.2.
- Usando o software de análise de imagem preferida (ver Tabela de materiais), regiões de contorno visível ferimento em imagens adquiridas, medida da área do mesmo ferida nos dias 1 e 4 pós-ferindo e calcular a porcentagem de fechamento da ferida.
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Humanos epiteliais células em vitro cicatrização de feridas
- Contagem de Caco-2 BBe ou T84, humanas células epiteliais intestinais por hemocytometer e semente de 5 x 105 células/poço em placas de cultura de 24-bem. Incube as células em uma câmara de padrão de incubação a 37 ° C e 5% de CO2. Caco-2 BBe ou T84 alcançar confluência dentro de 48 h9. Para cultura de células epiteliais, use DMEM e DMEM-F12 (50: 50) com suplementos como anteriormente descrito9.
- Gerar feridas zero mecânicas na monocamada usando uma ponta de pipeta e baixa sucção conforme descrito anteriormente,4,9. Adquirir imagens de áreas ferida imediatamente após riscar usando um microscópio de interferência diferencial de contraste de fase invertida (objectivos de utilização 5x ou 10x), para ser usado como um tempo = ponto de referência 0.
- Adicionar MPs (derivados de 2-4 X 106 PMN) de monocamadas de células epiteliais feridos de riscado e incubar por 24 h adicional (48 h pós-ferimento, a 37 ° C com 5% CO2). Neste momento re-adquira imagens das feridas-zero.
- Use o software de análise de imagem preferida (consulte Tabela de materiais) para medir áreas de ferimento em t = 0 e t = 48 h. calcular a porcentagem de fechamento da ferida, determinando a diferença na área ferida nos pontos de tempo selecionado.
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Representative Results
Análise de fluxo representativo cytometric do MPs que foram isoladas de humanos e mouse PMN são mostrados na Figura 1. A heterogeneidade de tamanho do PMN-MPs pode ser avaliada por comparação com grânulos de tamanhos conhecidos como mostrado na Figura 1A, B para humanos MPs. nota, sem diferenças significativas na heterogeneidade de tamanho foram observadas entre o rato e MPs humanas. Da mesma forma, usando citometria de fluxo e rotulação de fluorescência, expressão de proteínas/s de escolha por MPs isolados de rato ou de origem humana pode ser determinado. Por exemplo, a expressão de fosfatidil serina (PhS) pode ser examinado pela coloração de anexina V. Murino medula óssea PMN-MPs são mostrados na Figura 1C, D. Expressão de vários marcadores de escolha também pode ser avaliada como mostrado para anexina V e CD11b coloração de MPs humanos, Figura 2A, B. Um outro método para detectar PMN-MPs por citometria de fluxo é a mancha recentemente isolada PMN antes da estimulação, como mostrado na Figura 2C. Por exemplo, PMN manchando com o marcador de lipídios N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC antes da fMLF resultados de estimulação na liberação de MPs verdes, que pode ser facilmente detectada pelo fluxo. Da nota, enquanto a coloração com N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC tem sido anteriormente usado para rotular e detectar MPs que foram obtidos a partir de sangue periférico humano10 ou injetados em animais11, o uso de outros marcadores para rotular os fins para aplicação em vitro ou na vivo deve ser determinada por cada investigador. Além de citometria de fluxo, PMN-MPs podem ser analisados pelo immunoblotting para proteínas de interesse. Como mostrado na Figura 3, MPs derivados PMN humana que foram estimulados com vários ativadores conhecidos, foram examinados para a expressão de chave inflamatória (matriz metallopeptidase 9 (MMP-9) e mieloperoxidase (MPO)) e anti-inflamatórios (anexina A1) moléculas. Como é evidente do representante immunoblots, estimulação do PMN com relato (50 ng/mL), PMA (200 nM), e fMLF (1 µM) resultou em MPs expressando níveis variados de MMP-9. Porém, a única perturbação o citoesqueleto de actina pelo prior de Latrunculin B (1 µM) para estimulação com fMLF (5 µM) levou a abundante presença de MPO em PMN-MPs. Da mesma forma, níveis variados de anexina A1 (alto a nenhuma detecção) foram detectados na MPs, as condições de activação descritas a seguir. Estes resultados sugerem que a composição de PMN-MP é dependente de estímulo.
Finalmente, a Figura 4 mostra como PMN-MPs isolados podem ser usados para estudar ferida cura in vitro e in vivo em lesões do cólon. PMN-MPs podem ser adicionados a zero feridos monocamadas epiteliais nas culturas, onde a cura pode ser monitorado por imagem aquisição em pontos de tempo pré-determinado. Polícia militar mais pode ser injetadas diretamente em feridas do cólon, que foram geradas pela pinça de biopsia e imagem endoscópica9, e seu efeito sobre a cura pode ser avaliado. Para a análise in vitro e em vivo de cicatrização de feridas, imagens dos ferimentos infligidos são adquiridas imediatamente post ferindo (ou não conforme especificado) e continuamente através do processo de cicatrização nos pontos de tempo pré-determinado. Usando o software de análise de imagem disponíveis comercialmente, mudanças na área da ferida (tamanho) são medidas e usadas para determinar a taxa de encerramento da ferida. Aplicação do PMN-MPs que contêm MPO para qualquer culto epiteliais monocamadas ou na vivo para feridas do cólon tem efeitos nocivos, levando a cura retardada9.
Figura 1 . Análise de tamanho de PMN-MP e marcadores de superfície por citometria de fluxo. (A) citômetro de fluxo otimizado de grânulos de controle (veja a Tabela de materiais) de tamanhos conhecidos e valores de dispersão são mostrados na representação ortogonal SSC e FSC. Os grânulos são usados para obter uma comparação do tamanho relativo com uma amostra de PMN-MP mostrada em B. (B) humanos PMN-MPs foram isoladas e analisadas por citometria de fluxo utilizando condições descritas para os grânulos. A heterogeneidade em tamanhos de MP pode ser vista. (C–D) Polícia militar derivado fMLF-estimulada medula óssea murino que PMN foram analisados por citometria de fluxo. Diagramas de fluxo de representante mostrar imaculado (C) ou anexina V-FITC manchado (D) MPs. área retangular mostra MPs Annexin V-positivo (MPs FITC-positivo). SSC: Side Scatter; FSC: Forward Scatter; PhS: Serina de fosfatidil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Análise por citometria de fluxo e coloração PMN-MP. Unstained (A) e (B) Annexin V-FITC e hCD11b-APC-manchadas de MPs. quadrado de área abrange uma população de positivo duplo anexina V/CD11b de PMN-MPs. (C) recentemente isolados humanos PMN (1 x 106) foram corados com um corante fluorescente , N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC e estimulada com fMLF. Deputados foram isolados de sobrenadantes de células e analisaram por citometria de fluxo. Área retangular inclui uma N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC positivo MP população (M-FITC, rótulo do eixo y). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Composição do PMN-MPs é dependente do estímulo. (A) PMN humana foram estimulados com relato, TNFa, fMLF, PMA ou uma combinação de latranculin B, seguido por fMLF (LtB-fMLF). Deputados foram isolados a partir os sobrenadantes de células resultante por ultracentrifugação e proteína lisados foram preparados em tampão de SDS 1%. As proteínas foram separadas por tamanho electrophoretically em gel de poliacrilamida 10%, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e vasculhados a procura de um MMP-9, MPO ou anexina A1 anticorpo primário seguido os anticorpos secundarios conjugados a HRP apropriados. (B) microscopia de elétron representante retratam imagens de PMN-MPs humanos tamanho heterogeneidade. Um exossomo < 100 nm de tamanho é indicado pela seta branca. Barra de escala = 250 nm (painéis esquerdos e direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: o uso do PMN-MPs isolados em estudar o papel do PMN em epiteliais cicatrização. (A) Caco-2 BBe células epiteliais intestinais humanas foram banhadas a confluencia zero feridos e submetidas a MPs derivados PMN 3 milhões, que foram adicionados imediatamente pós-ferindo. Imagens representativas mostram fechar ferimentos (48 h pós-ferindo) no controle (painéis à esquerda) e células epiteliais PMN-MP-tratada (painéis de direito). Barra de escala = 100 µm. (B) examinar o efeito de PMN-MPs na Colônica ferida cura na vivo, PMN-MPs isolados foram injetadas diretamente a área ferida, usando um sistema baseado em endoscopia microinjeção (em 24 h pós-ferimento, ferida do cólon é descrito por uma linha tracejada e a injeção local de agulha é indicado por uma seta branca). Encerramento da ferida foi avaliados 3 dias mais tarde (4 dias pós-ferindo) por imagem endoscópica. Barra de escala = 300 µm. (C) 4 dias pós-ferindo os ratos foram sacrificados e feridas na mucosa do cólon foram extraídas com tesouras, incorporadas no composto de temperatura (O.C.T) de corte ideal e congeladas com nitrogênio líquido. Seções de 8 micrômetros das feridas foram coradas por E-caderina (verde) e a mancha nuclear DAPI (azul) avaliar o nível de re-epitelização (painéis superiores), ou para DAPI (azul) e Ki67 (vermelho) Visualizar as células epiteliais totais e proliferando no a borda da ferida (painéis inferiores). Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Protocolos para o isolamento e caracterização de MPs PMN-derivados são descritos na presente comunicação. Vários pontos chaves de críticos devem ser tomados em consideração para o sucesso do procedimento. Primeiro, o PMN deve ser isolada fresco e deve ser usado em experimentos com até 2 horas de isolamento para impedir a desgranulação e activação espontânea. Toda manipulação de PMN durante o isolamento e até ao ponto de estimulação deve ser executada no gelo para evitar a activação e prematuro MP versão12. Em segundo lugar, ultracentrifugação para 1h ou mais maximiza a granulação de MPs. terceiro, para análise por citometria de fluxo, o instrumento deve ser devidamente calibrado com uma mistura de grânulos fluorescentes instrumento especificado (o tipo de grânulos é ajustado para uma determinada instrumento) definir corretamente os tamanhos de MP. Por exemplo, enquanto que um fabricante de citômetros recomenda o uso de grânulos do FSC como um parâmetro relacionado a tamanho, outros foram otimizados para grânulos SSC. Além disso, o citômetro de fluxo a ser utilizado para análise de MP deve estar equipado com eletrônica atualizada para melhor resolver MPs do ruído de fundo.
Para identificar corretamente o MPs além de parâmetros de tamanho, o uso da fluorescência de coloração conforme descrito nos procedimentos acima é altamente recomendado. Além disso, todas as soluções durante a preparação e o isolamento devem ser filtradas através de um sistema de filtro 0.1 µm para minimizar a inclusão de partículas de poeira ou outros precipitados que irão aumentar o ruído de fundo durante a aquisição por citometria de fluxo. Importante, devem ser consideradas as condições de armazenamento do MPs. Pouca evidência8e nossas próprias observações inéditas, sugerem que o MP congelamento leva a ruptura de membrana e ruptura de MP. Finalmente, variando as condições de ativação do PMN e sincronismo podem mudar e melhorar o rendimento de MP.
Existem algumas limitações para este método. Isolamento de mouse PMN da medula óssea geralmente não é puro (~ 85-90%) e é contaminado por outras células do sistema imunológico (principalmente linfócitos mononucleares), conforme foi determinado pela análise de fluxo cytometric. Assim, os isolados resultantes podem incluir pequenas quantidades de MPs liberados por outras células do sistema imunológico. Alternativas dispõem e incluem isolamento do PMN por grânulos magnéticos comercialmente disponíveis, no entanto, este seria mais um tempo e um procedimento significativamente mais caro. Finalmente, sem fluorescência rotulagem, além de parâmetros de tamanho, diferenciação definitiva de MPs de poeira ou outras partículas no ar ou solúveis de tamanhos semelhantes que podem contaminar a amostra é desafiador e propenso a erros.
No futuro, classificação de PMN-MPs rotulados com marcadores específicos ajudará a elucidar a composição do MP sob condições específicas estimulatórios ou modelos da doença e esperemos que permitem o uso de MPs como marcadores de diagnósticos e alvos terapêuticos para tratar doenças inflamatórias.
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Disclosures
Os autores não têm nenhum conflito de interesses, de qualquer tipo relacionado com a presente comunicação
Acknowledgments
Estamos gratos pela assistência técnica do Dr. Suchitra Swaminathan que dirige o núcleo de Northwestern Feinberg escola de medicina Flow Cytometry. Financiamento foi fornecido pela DK101675 (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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