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Immunology and Infection

अलगाव और न्युट्रोफिल के लक्षण वर्णन-कार्यात्मक अध्ययन के लिए व्युत्पंन Microparticles

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56949
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Summary

नए प्रोटोकॉल यहां वर्णित अलग और microparticles मानव और माउस न्यूट्रोफिल से व्युत्पंन की विशेषताएं हैं । इन प्रोटोकॉल ultracentrifugation, प्रवाह cytometry, और immunoblotting तकनीकों का उपयोग microparticle सामग्री का विश्लेषण करने के लिए, और वे सेलुलर समारोह में विभिंन प्रकार के सेल से व्युत्पंन microparticles की भूमिका का अध्ययन किया जा सकता है ।

Abstract

Polymorphonuclear न्युट्रोफिल-व्युत्पन्न microparticles (PMN)-एमपीएस) लिपिड bilayer, गोलाकार microvesicles से लेकर आकार 50 – 1000 एनएम व्यास में हैं । सांसद सेल-टू-सेल कम्युनिकेशन और सिग्नलिंग मशीनरी का एक नया विकसित, महत्वपूर्ण हिस्सा हैं । क्योंकि उनके आकार और उनकी रिहाई की प्रकृति, हाल ही में जब तक सांसद अस्तित्व की अनदेखी की गई थी । हालांकि, बेहतर प्रौद्योगिकी और विश्लेषणात्मक तरीकों के साथ स्वास्थ्य और रोग में उनके समारोह अब उभर रहा है । यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉलों को अलग-थलग और निस्र्पक PMN-सांसदों द्वारा फ्लो cytometry और immunoblotting के उद्देश्य से किया जाता है. इसके अलावा, कई कार्यांवयन उदाहरण दिए गए हैं । सांसद अलगाव के लिए इन प्रोटोकॉल तेजी से कर रहे हैं, कम लागत, और महंगी किट के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, वे अलगाव के बाद सांसदों के लेबल के लिए अनुमति देते हैं, साथ ही पूर्व स्रोत कोशिकाओं के लेबल के लिए सांसद रिहाई से पहले, एक झिल्ली के प्रवाह cytometry द्वारा दृश्य और विश्लेषण के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग कर । इन तरीकों, तथापि, PMNs और सांसदों की शुद्धता और परिष्कृत विश्लेषणात्मक इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए की आवश्यकता सहित कई सीमाएं हैं । एक उच्च अंत प्रवाह cytometer के लिए मज़बूती से सांसदों का विश्लेषण और गलत सकारात्मक शोर या ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण पढ़ता को कम करने की जरूरत है । वर्णित प्रोटोकॉल अलग और सांसद उत्पत्ति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और विभिन्न उत्तेजक स्थितियों के तहत संरचना में उनके मार्करों और भिन्नता की विशेषता. आकार विविधता की जांच करने के लिए शोषण किया जा सकता है कि झिल्ली कणों बनाम exosomes की सामग्री अलग है, और क्या वे ऊतक homeostasis में विभिंन भूमिकाओं को पूरा । अंत में, अलगाव और सांसदों के लक्षण वर्णन, सेलुलर प्रतिक्रियाओं और विभिंन रोग मॉडल (सहित, PMN-जुड़े भड़काऊ विकारों, जैसे भड़काऊ आंत्र रोग या तीव्र फेफड़ों की चोट) में उनके समारोह का पता लगाया जा सकता है ।

Introduction

हाल ही में, "microparticles/microvesicles" कोशिका cytosol या प्लाज्मा झिल्ली से उत्पंन महान वैज्ञानिक हित के बन गए हैं, के रूप में उभरते आंकड़ों का सुझाव है कि इन संरचनाओं, 50 से लेकर-व्यास में 1000 एनएम, जैविक जानकारी ले जा सकते है और सेलुलर संचार की एक गैर विहित विधि के रूप में सेवा करते हैं । प्रतिरक्षा सेल-प्राप्त सांसदों और विशेष रूप से polymorphonuclear न्यूट्रोफिल (PMNs) द्वारा उत्पादित उन महान मेजबान रक्षा में PMNs की महत्वपूर्ण भूमिका दी रुचि के है1,2, भड़काऊ प्रतिक्रियाएं3, और घाव-हीलिंग 4. साज़िश, इस प्रकार अब तक, कई रिपोर्टों के दोनों समर्थक भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ कार्य दिखाया है PMN-सांसदों5, एक संभावित संदर्भ का सुझाव है-, रोग, प्रजातियों, और अंग सांसदों की विशेष भूमिका ।

इस संचार में वर्णित प्रोटोकॉल एक लागत प्रभावी, अभिनव प्रदान करते हैं, और अनुकूलनीय विधि स्वास्थ्य और रोग में सांसदों के समारोह का अध्ययन करने के लिए । वे कई मॉडल जीवों के लिए लागू कर रहे हैं, अंगों, और उत्तेजना की स्थिति । वे सांसदों के कई प्रकार की पहचान के लिए अनुमति देते है और उनके समर्थक भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ कार्यों को संबोधित करने के लिए भविष्य में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, यहां वर्णित है कैसे PMN के समारोह का अध्ययन करने के लिए- इन विट्रो में उपकला घाव हीलिंग में और vivo में। माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पंन PMNs के अलगाव के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक पहले वर्णित विधि6से कुछ संशोधनों के साथ अनुकूलित किया गया था ।

इसके अलावा, इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल का पता लगाने और विशिष्ट मार्करों कि PMN पर पाया जा सकता है के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दो पूरक तरीकों से सांसदों: पश्चिमी दाग और प्रवाह cytometry । हम पाते है कि सांसदों के immunoblotting मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर5 आसान और विश्वसनीय है, तथापि, प्रवाह cytometry उपकरणों की संवेदनशीलता में हाल ही में अग्रिमों, और बेहतर शोर से संकेत अनुपात अब इस पद्धति का उपयोग कर सांसदों के आगे विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं । इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल हाल के अग्रिम और सिफारिशों को शामिल मूल अनुसंधान लेख से, केंद्रापसारक गति और समय को संशोधनों सहित, नमूना फ़िल्टरिंग और ठंड के अलावा/ , 8, और कैसे "पृष्ठभूमि शोर" को कम करने के लिए, PMN-सांसदों की पता लगाने की सीमा में सुधार, और सांसदों के विभिंन आकारों के बीच भेदभाव ।

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Protocol

सभी पशु काम उत्तर पश्चिमी IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया । सभी प्रयोगों को सभी प्रासंगिक विनियामक और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुरूप और अनुपालन में पूरा किया गया. रक्त दान मानव विषयों के लिए, एक सूचित सहमति प्रस्तुत किया गया था और हस्ताक्षर किए; इसके अतिरिक्त, मानव कल्याण के लिए संस्थागत और संघीय दिशानिर्देशों के अनुसार इस अध्ययन में सभी मानव विषयों का उपचार किया गया ।

नोट: प्रोटोकॉल चरण निंन उपअनुभागों के अंतर्गत सूचीबद्ध होते हैं: (i) माउस अस्थि मज्जा कोशिका अलगाव; (२) Murine अस्थि मज्जा से PMN अलगाव; (iii) मानव रक्त से PMN अलगाव; (iv) PMN Supernatants से सांसद अलगाव (Ultracentrifugation द्वारा); (v) पश्चिमी सोख्ता द्वारा सांसदों का लक्षण वर्णन; (vi) प्रवाह Cytometry द्वारा सांसदों का लक्षण वर्णन; (viii) घाव भरने के अध्ययन के लिए पृथक सांसदों के आवेदन

1. माउस अस्थि मज्जा सेल अलगाव

  1. फीमर और टिबिया के विच्छेदन से माउस हिंद पैर
    1. एक इच्छामृत्यु बॉक्स (उदा, एक खाली 1 मिलीलीटर टिप बॉक्स) संज्ञाहरण की साँस लेना के लिए तैयार करें । एक बाँझ कपड़े एक प्लास्टिक बॉक्स ढक्कन के अंदर करने के लिए टेप पर १००% isoflurane की कुछ बूंदें जोड़ें । नए IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार, पशुओं isoflurane के साथ सीधे संपर्क में नहीं आना चाहिए, इस प्रकार माउस और isoflurane युक्त धुंध के बीच एक टिप धारक जगह है ।
      नोट: Isoflurane एक शक्तिशाली साँस संवेदनाहारी है और एक धुएं हुड के अंदर अत्यधिक सावधानी के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    2. IACUC सिफारिश के अनुसार चूहों को Euthanize । इच्छामृत्यु के लिए 1 कदम में वर्णित बॉक्स के अंदर एक माउस प्लेस-5 मिनट जब तक यह श्वास रह गया है । एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन से पशुओं की मौत सुनिश्चित करें ।
    3. स्टेनलेस स्टील, 12 सेमी घुमावदार, ०.१७ मिमी X ०.१ मिमी चिमटी का उपयोग कर उदर त्वचा लिफ्ट और ऊपरी और निचले अंगों के बीच त्वचा आधा रास्ता काट दिया । यहां से त्वचा छील निचले अंगों सहित माउस शरीर के सबसे बाहर के अनुभाग के लिए । 10 सेमी लंबे, सीधे विदारक कैंची के साथ, हिंद पैर से मांसपेशियों को हटाने और कूल्हे फीमर सिर बरकरार छोड़ संयुक्त पता लगाएँ ।
    4. फीमर और टिबिया से मांसपेशियों को काटना और फीमर को टिबिया से अलग करने के लिए कैंची का प्रयोग करें । सुनिश्चित करें कि हड्डियों के सिरों बरकरार रहने के रूप में वे अस्थि मज्जा की महत्वपूर्ण मात्रा में होते हैं ।
    5. एक कागज तौलिया के अंदर हड्डियों रोलिंग द्वारा सभी शेष मांस निकालें । सीरम मुक्त माध्यम (SFM, यानी, Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) सीरम या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) युक्त एक पेट्री डिश में साफ हड्डियों प्लेस ।
    6. ७०% इथेनॉल में हड्डियों कुल्ला और फिर SFM में ।
    7. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में SFM के ५० मिलीलीटर तैयार करें । एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में SFM के 10 मिलीलीटर लोड और यह एक 25 और 5/8 इंच गेज सुई करने के लिए देते हैं ।
    8. अस्थि मज्जा (लाल रंग) के लिए एक खोलने तक कैंची के साथ हड्डियों के अंत ट्रिम कर दीजिए दिखाई दे रहा है ।
    9. एक नया ५० मिलीलीटर ट्यूब में अस्थि मज्जा कोशिकाओं फ्लश । एक के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें एक 26 और 5/8 इंच गेज सुई के साथ लगभग 3 मिलीलीटर/ फ्लशिंग समाप्त करने के बाद, सेल एग्रीगेट को तोड़ने के लिए pipetting द्वारा ट्यूब में कोशिकाओं (उपयोग डिस्पोजेबल 1 मिलीलीटर प्लास्टिक युक्तियाँ) reसस्पेंड ।

2. Murine अस्थि मज्जा से PMN अलगाव

  1. लाल सेल lysis
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए ३५० x g पर केंद्रापसारक द्वारा एकत्र अस्थि मज्जा गोली ।
    2. एरिथ्रोसाइट अंश लाइसे करने के लिए लगभग 20-30 एस के लिए ०.२% NaCl के 20 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड । 30 एस से अधिक मत के रूप में यह PMN lysis में परिणाम होगा । परासरणीयता बहाल करने के लिए १.६% NaCl के 20 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: यह चरण बहुत कम PMN सक्रियण करने के लिए लीड हो सकता है ।
    3. पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो और ऊपर कदम 2.1.1 में के रूप में केंद्रापसारक । supernatant निकालें ।
    4. घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा PMNs अलग करने के लिए आगे बढ़ें ।
  2. घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा न्यूट्रोफिल के अलगाव
    1. गर्म polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान, १.११९ g/ml और १.०७७ g/ml के घनत्व के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें), उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान (RT) पर जाएं ।
    2. polysucrose और सोडियम diatrizoate ढाल ताजा तैयार करते हैं, तुरंत से पहले अस्थि मज्जा सेल आवेदन करने के लिए धीरे से 3 मिलीलीटर १.०७७ g/एमएल घनत्व समाधान के 3 मिलीलीटर पर 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में १.११९ ग्राम/
      नोट: ढाल समाधान की तैयारी बहुत दूर अग्रिम में परतों और गरीब न्युट्रोफिल शुद्धता और वसूली के मिश्रण में परिणाम होगा ।
    3. बर्फ ठंडा पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में अस्थि मज्जा सेल गोली reसस्पेंड और polysucrose और सोडियम diatrizoate ढाल के शीर्ष पर परिणामी कोशिका निलंबन ओवरले (धीरे, परतों के मिश्रण से बचने के लिए) ।
    4. ८५० पर 30 मिनट के लिए आर टी 25 डिग्री सेल्सियस पर आरटी, ब्रेक के बिना। अंय अस्थि मज्जा में मौजूद कोशिकाओं से न्यूट्रोफिल के प्रभावी जुदाई के लिए RT पर रिएजेंट रखें । सेट धीमी मंदी पर केंद्रापसारक के लिए ढाल के लिए अनुमति देने के लिए कुशलता से गठन और केंद्रापसारक कदम के बाद बनाए रखा है ।
    5. नेत्रहीन पंजाबियों और १.०७७ g/एमएल घनत्व समाधान (ऊपरी परत) के इंटरफेस में एक mononuclear सेल परत का पता लगाएं । इस परत और PMN बैंड परेशान बिना घनत्व समाधान के बाकी निकालें ।
    6. एक संपूर्ण PMN परत लीजिए और कुछ अंतर्निहित polysucrose और सोडियम diatrizoate १.११९ g/एमएल समाधान में 15 मिलीलीटर ट्यूबों एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर ।
      नोट: पृथक PMNs की शुद्धता ऊपरी परत के एक पूर्ण हटाने पर निर्भर करेगा ।
    7. ऊपर फ़िल्टर्ड पंजाबियों के साथ ट्यूबों (एक ०.१ µm ताकना आकार फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर) और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
    8. धोया पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ छर्रों PMNs चरण 2.2.7 में के रूप में केंद्रापसारक शर्तों का उपयोग कर ।
    9. फ़िल्टर किए गए पंजाबियों की 1 मिलीलीटर में reसस्पेंड और hemocytometer द्वारा अलग PMNs गिनती ।
      नोट: इस आइसोलेशन विधि के लिए, परिणामी PMN शुद्धता मात्रा करने के लिए ~ 85-90%, के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था । शेष प्रदूषित अंश मुख्यतः mononuclear लिम्फोसाइटों के होते हैं.
  3. PMN उत्तेजना के लिए प्रेरित सांसद रिलीज
    नोट: PMNs एन-formyl-l-methionyl-leucyl-l-फेनिलएलनिन (fMLF), phorbol-12-myristate-13-एसीटेट (पमा), या इंटरफेरॉन गामा (IFNγ) सहित विभिन्न सक्रिय स्थितियों का उपयोग कर सांसदों को रिहा करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, अनुकरण करने से पहले, PMNs बर्फ पर हर समय रखा जाना चाहिए ।
    1. गोली PMNs (३०० एक्स जी, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और ०.१ में reसस्पेंड µm फ़िल्टर्ड है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) समाधान, पसंद के उत्तेजक एजेंट युक्त । इष्टतम उत्तेजना के लिए, का उपयोग करें १०० µ एल उत्तेजना १०,०००,००० प्रति PMNs 20-30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस में 15 मिलीलीटर ट्यूबों ।
      नोट: उत्प्रेरकों की निंनलिखित सांद्रता सफलतापूर्वक हमारे पिछले काम में इस्तेमाल किया गया: fMLF (0.5-1 मानव के लिए µ एम और 2-5 µ मीटर माउस PMNs के लिए), पमा (२०० एनएम), और IFNγ (१०० एनजी/ यदि पूर्व-लेबल वाले सांसदों की रिहाई वांछित है, तो गर्मी उत्तेजित PMNs (1-5 x 106) के साथ N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC ( सामग्री की तालिकादेखें) (1 µ m में १०० µ l HBSS, 15 मिनट, ३७ ° c) । कदम 2.3.1-2.3.3 के साथ आगे बढ़ें ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए ८५० x g पर नीचे स्पिन, PMNs और स्थानांतरण सेल मुक्त supernatants नई १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों को हटाने के लिए ।
    3. MP आइसोलेशन सेल से मुक्त supernatants के लिए, चरण ४.२ के लिए जारी रखें ।

3. मानव रक्त से अलगाव PMN

  1. संस्थागत आईआरबी दिशानिर्देशों के अनुसार रक्त निष्कर्षण के लिए स्वस्थ स्वयंसेवकों की भर्ती करें ।
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 5 मिलीलीटर सोडियम साइट्रेट-ट्यूबों ( सामग्री की तालिकादेखें) में एक स्वस्थ स्वयंसेवक की बांह की प्रकोष्ठ से रक्त एकत्र करें ।
    2. पिपेट dextran और सोडियम diatrizoate समाधान के 5 मिलीलीटर (१.११३ g/एमएल का घनत्व, सामग्री की तालिकादेखें) में बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूबों और धीरे से यह के शीर्ष पर हौसले से अलग मानव परिधीय रक्त की परत 5 मिलीलीटर.
    3. कम त्वरण और कोई ब्रेक के साथ आरटी (25 डिग्री सेल्सियस) में ४०० x जी में ५० मिनट के लिए ट्यूबों केंद्रापसारक ।
    4. केंद्रापसारक के अंत में, प्लाज्मा और mononuclear कोशिकाओं (ऊपरी परत) एक बाँझ प्लास्टिक चूषण पिपेट का उपयोग कर हटा दें ।
    5. एक नए बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में नीचे परत (PMNs) स्थानांतरण ।
    6. PMNs करने के लिए ०.४५% NaCl की एक बराबर मात्रा जोड़ें (अच्छी तरह से और धीरे ट्यूब घूर्णन द्वारा मिश्रण) ।
    7. 25 डिग्री सेल्सियस पर ४०० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  2. लाल सेल lysis
    1. 10 मिलीलीटर बर्फ की जोड़ें-ठंड, बाँझ पानी ४५ एस के लिए छर्रों कोशिकाओं को 10 मिलीलीटर बर्फ ठंड बाँझ १.८% NaCl के बाद परासरणीयता पुनर्स्थापित करने के लिए ।
      नोट: PMN अलगाव के लिए सभी निंनलिखित कदम PMN सक्रियण और समय से पहले सांसद रिहाई से बचने के लिए बर्फ पर किया जाना चाहिए । lysis कदम ही मामूली लेकिन नहीं महत्वपूर्ण PMN सक्रियण में परिणाम है, तथापि, यह कार्यात्मक परख के लिए एक शुद्ध PMN आबादी को अलग करने के लिए आवश्यक है ।
    2. नरम मंदी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर २५० x g पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को केंद्रापसारक ।
    3. चरण 3.2.1 और 3.2.2 दोहराएं ।
    4. कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना बर्फ ठंडा HBSS के 5 मिलीलीटर में PMNs reसस्पेंड । कुल लाइव कोशिकाओं की गणना (एक hemocytometer और व्यवहार्यता 1:2 कमजोर पड़ने पर धुंधला का उपयोग करें, सामग्री की तालिकादेखें) उत्तेजना से पहले.
      नोट: पृथक PMNs उत्तेजना या अलगाव के 2 ज के भीतर अंय प्रयोगों के लिए कार्यात्मक और सेलुलर परिवर्तन और कोशिका मृत्यु से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

4. आपन PMN Supernatants से सांसद अलगाव

नोट: एक समान प्रोटोकॉल murine और मानव PMNs से सांसदों के अलगाव के लिए प्रयोग किया जाता है ।

  1. गोली PMNs (३०० एक्स जी, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और ०.१ में reसस्पैंड µm फ़िल्टर्ड HBSS समाधान, पसंद के उत्तेजक एजेंट युक्त (उदाहरण के लिए 1 µ एम fMLF, देखें नोट: 2.3.1) । के लिए इष्टतम उत्तेजना का उपयोग करें १०० µ एल उत्तेजना १०,०००,००० प्रति PMNs 20-30 मिनट के लिए ३७ ° c में 15 मिलीलीटर ट्यूबों ।
  2. उत्तेजना के बाद, स्पिन नीचे सक्रिय PMNs पर 5 मिनट के लिए ६०० x जी में 4 ° c और हस्तांतरण सेल मुक्त supernatants नई १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूबों के लिए ।
  3. केंद्रापसारक PMN-१३,००० x जी, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर supernatant को मंजूरी दे दी सेल मलबे को हटाने और एक नया ultracentrifuge ट्यूब में supernatant हाे हस्तांतरण ।
  4. १००,००० x पर 1 ज के लिए केंद्रापसारक, 4 डिग्री सेल्सियस पर जी । सांसद भण्डारण से पहले supernatants निकालें । के रूप में की जरूरत है, भंडार में तेल सील ultracentrifuge ट्यूबों में सांसदों-८० ° c प्रयोग में जब तक गोली लगी ।

5. पश्चिमी सोख्ता द्वारा PMN-सांसदों की परीक्षा

  1. जोड़ें 1% एसडीएस बफर (१०० mM Tris पीएच के साथ 50-200 µ l: ७.४) के लिए सांसदों गोली (से कदम ४.४), नई १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए लीजड ड सांसदों को फोड़ा ।
    नोट: सांसदों की संख्या और lysis बफर मात्रा समायोजित और ब्याज की प्रत्येक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  2. 10% β-mercapto-इथेनॉल युक्त बफ़र लोडिंग में PMN-सांसदों प्रति लेन के बराबर मात्रा लोड ।
    नोट: हमारे विधि के साथ हम सांसदों कि उत्तेजित PMNs की एक ही संख्या से अलग थे लोड ।
    1. lysates को एसडीएस-PAGE द्वारा 10% polyacrylamide जेल (उपयोग 50-100 V 1-1.5 h के लिए) और nitrocellulose झिल्ली पर कुल प्रोटीन हस्तांतरण के रूप में वर्णित9को अलग करें ।
  3. 1 के लिए ब्लॉक झिल्ली 5% गैर वसा दूध के साथ ०.०५% के बीच में-20 Tris-खारा बफर, और यह एक उपयुक्त प्राथमिक के साथ मशीन (रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर), माध्यमिक एचआरपी-संयुग्मित एंटीबॉडी के बाद ।
  4. झिल्ली और एक प्रकाश प्रूफ कैसेट (1-24 एच) के अंदर एक एक्स-रे फिल्म के लिए जोखिम को chemoluminescence समाधान जोड़कर बैंड कल्पना ।

6. PMN की परीक्षा-सांसदों द्वारा फ्लो Cytometry

  1. एंटीबॉडी धुंधला के लिए, FACS बफर में उचित एंटीबॉडी पतला (०.१ mM EDTA, ०.१% सोडियम azide के साथ पंजाब) । reसस्पेंड PMN-सांसदों (1-3 से व्युत्पंन x 106 PMNs/१०० µ l एंटीबॉडी समाधान ।
    1. यदि Annexin वी के लिए धुंधला, reसस्पेंड PMN-सांसदों Annexin v बफर युक्त 5 µ एल के FITC-संयुग्मित Annexin वी । यदि एंटीबॉडी के साथ सह-धुंधला, वांछित एंटीबॉडी जोड़ें (एक उदाहरण के लिए सामग्री की तालिकादेखें) Annexin वी समाधान के लिए सीधे । जोड़ें फ्लोरोसेंट लिपिड डाई, एन-(2-aminoethyl) maleimide ( सामग्री की तालिकादेखें), 1 µ m एकाग्रता में १०० µ एल में FACS बफर लेबल और सांसदों की पहचान करने के लिए.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 20 मिनट के लिए समाधान धुंधला में सांसदों की मशीन ।
  3. ultracentrifugation द्वारा सांसदों को धो लें (१००,००० x g पर 1 ज, 4 डिग्री सेल्सियस पर); supernatant को त्यागें ।
  4. FACS बफर में reसस्पेंड और वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए एक उन्नत इलेक्ट्रॉनिक इकाई के साथ सुसज्जित एक निर्दिष्ट प्रवाह cytometer पर नमूने चलाने ( सामग्री की तालिकादेखें).

7. पृथक PMN-सांसदों के लिए आवेदन घाव भरने में PMN समारोह का अध्ययन करने के लिए

  1. vivo में प्रशासन ने PMN-एमपीएस की कालोनी को लगी घाव
    1. Anesthetize चूहों ketamine के एक मिश्रण का एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा (१०० मिलीग्राम/kg) और xylazine (5 मिलीग्राम/ पेडल पलटा (फर्म पैर की अंगुली चुटकी) द्वारा संज्ञाहरण की पुष्टि करें और आवश्यक के रूप में समायोजित ।
    2. अपने पेट पर माउस प्लेस और 28 सेमी बायोप्सी संदंश और एक उच्च संकल्प कैमरा (जैसे छोटे जानवर का उपयोग करने के लिए एक पशु चिकित्सा एंडोस्कोप के रूप में) से सुसज्जित एक एंडोस्कोप का उपयोग कर, सामग्री की तालिकादेखें), पृष्ठीय पक्ष के साथ 3-5 सतही घावों उत्पन्न बृहदांत्र. घाव के पूरा होने पर, एक तापमान नियंत्रित (३७ डिग्री सेल्सियस) बरामद जब तक चटाई पर रखा पिंजरे में चूहों वापस ।
    3. Anesthetize चूहों (चरण 7.1.1 में के रूप में) । एक एंडोस्कोप का उपयोग करने के लिए दण्डित घावों की छवियां प्राप्त करने के लिए 24 घंटे (1 दिन) के बाद घायल । चूहों चरण 7.1.2 में के रूप में पुनर्प्राप्त करते हैं ।
    4. एक ही समय (24 घंटे के बाद जख्म), प्रशासन murine PMN-सांसदों से व्युत्पंन 2 एक्स 106 PMNs में १०० µ एल HBSS + सीधे प्रत्येक घाव एक colonoscopy आधारित microinjection प्रणाली का उपयोग कर साइट में (एक 29 जी सुई का उपयोग करें)9। तीन दिन बाद (4 दिन के बाद घाव) anesthetize चूहों (के रूप में कदम 7.1.1 में) और उपचार घावों की छवियों को पुनः प्राप्त करने के लिए एक एंडोस्कोप का उपयोग करें । चूहों चरण 7.1.2 में के रूप में पुनर्प्राप्त करते हैं ।
    5. पसंदीदा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना ( सामग्री की तालिकादेखें), अधिग्रहीत छवियों में दिखाई घाव क्षेत्रों रूपरेखा, दिन में 1 और 4 के बाद एक ही घाव के क्षेत्र को मापने-घायल, और घाव बंद होने के प्रतिशत की गणना.
  2. इन विट्रो में मानव उपकला कोशिकाओं घाव हीलिंग
    1. गिनती कएको छैन-2 BBe या T84, मानव आंत्र उपकला कोशिकाओं द्वारा hemocytometer और बीज 5 x 10 5 कोशिकाओं में 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों/ ३७ ° c और 5% CO2पर एक मानक मशीन कक्ष में कक्षों की मशीन । ४८ h9के भीतर कएको छैन-2 BBe या T84 पहुंचता है । संस्कृति उपकला कोशिकाओं के लिए, DMEM और DMEM-F12 (50:50) की खुराक के साथ प्रयोग के रूप में पहले वर्णित9।
    2. पहले वर्णित के रूप में एक पिपेट टिप और कम चूषण का उपयोग कर monolayer में यांत्रिक खरोंच घाव उत्पंन4,9। एक उल्टे चरण-कंट्रास्ट विभेदक हस्तक्षेप माइक्रोस्कोप (5x या 10x उद्देश्यों का उपयोग करें), एक बार के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए खरोंच के बाद तुरंत घाव क्षेत्रों की छवियों को प्राप्त = 0 संदर्भ बिंदु ।
    3. सांसदों को जोड़ें (2-4 X 106 PMNs से व्युत्पंन) खरोंच-घायल उपकला कोशिका monolayers के लिए, और एक अतिरिक्त 24 एच के लिए मशीन (४८ एच पोस्ट-घायल, ३७ ° c के साथ 5% CO2) । इस समय पुनः खरोंच-घावों की छवियां प्राप्त ।
    4. पसंदीदा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) टी = 0 और टी = ४८ एच में घाव क्षेत्रों को मापने के लिए) चयनित समय बिंदुओं पर घाव क्षेत्र में अंतर का निर्धारण करके घाव बंद होने के प्रतिशत की गणना.

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Representative Results

सांसदों का प्रतिनिधि प्रवाह cytometric विश्लेषण जो मानव और माउस PMNs से पृथक किए गए हैं चित्रा 1में दिखाए गए हैं । PMN के आकार विविधता-सांसदों चित्रा 1ए, मानव सांसदों के लिए बी में दिखाया गया के रूप में ज्ञात आकार मोतियों की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । नोट, आकार विविधता में कोई महत्वपूर्ण अंतर माउस और मानव सांसदों के बीच मनाया गया । इसी प्रकार, या तो माउस या मानव मूल के पृथक सांसदों द्वारा पसंद के प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति लेबलिंग, प्रोटीन की अभिव्यक्ति का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, Phosphatidyl serine (पीएचएस) की अभिव्यक्ति Annexin वी धुंधला द्वारा जांच की जा सकती है । Murine अस्थि मज्जा PMN-सांसदों चित्रा 1सी, डीमें दिखाया गया है । पसंद के कई मार्करों की अभिव्यक्ति भी Annexin वी और मानव सांसदों के CD11b धुंधला, चित्रा 2ए, बीके लिए दिखाए गए के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है । प्रवाह cytometry द्वारा PMN-सांसदों का पता लगाने के लिए एक अंय विधि के रूप में चित्रा 2सीमें दिखाया उत्तेजना से पहले हौसले से अलग PMNs दाग है । उदाहरण के लिए, PMN लिपिड मार्कर एन के साथ धुंधला-(2-aminoethyl) maleimide-FITC से पहले हरी सांसदों की रिहाई में fMLF उत्तेजना परिणाम, कि आसानी से प्रवाह द्वारा पता लगाया जा सकता है । नोट की, जबकि एन के साथ धुंधला-(2-aminoethyl) maleimide-FITC पहले लेबल के लिए इस्तेमाल किया गया है और सांसदों कि परिधीय मानव रक्त10 से प्राप्त या पशुओं में इंजेक्शन11, के लिए लेबलिंग प्रयोजनों के लिए अंय मार्करों के उपयोग का पता लगाने के लिए इन विट्रो में या vivo में आवेदन प्रत्येक जांचकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए । प्रवाह cytometry के अलावा, PMN-सांसदों के हित के प्रोटीन के लिए immunoblotting द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । के रूप में चित्रा 3, मानव PMNs है कि कई ज्ञात उत्प्रेरकों के साथ उत्तेजित थे से व्युत्पंन सांसद, कुंजी भड़काऊ की अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई (मैट्रिक्स metallopeptidase 9 (एमएमपी-9) और myeloperoxidase (MPO)) और विरोधी भड़काऊ (Annexin A1) अणुओं । प्रतिनिधि immunoblots से स्पष्ट रूप में, IFNγ के साथ PMN उत्तेजना (५० एनजी/एमएल), पमा (२०० एनएम), और fMLF (1 µ m) सांसदों के परिणामस्वरूप एमएमपी-9 के स्तर पर अलग व्यक्त । हालांकि, केवल Latrunculin बी द्वारा actin cytoskeleton के गड़बड़ी (1 µ m) fMLF के साथ उत्तेजना से पहले (5 µ m) MPO में PMN की प्रचुर उपस्थिति के लिए नेतृत्व-सांसद । इसी प्रकार, Annexin A1 के भिंन स्तर (कोई पता लगाने के लिए उच्च) वर्णित सक्रिय शर्तों का पालन सांसदों पर पाए गए । इन परिणामों का सुझाव है कि PMN-सांसद रचना उत्तेजना-आश्रित है.

अंत में, चित्रा 4 से पता चलता है कैसे पृथक PMN-सांसदों विट्रो में घाव भरने और बृहदांत्र चोट में vivo में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । PMN-सांसदों खरोंच के लिए जोड़ा जा सकता है संस्कृतियों में घायल उपकला monolayers, जहां हीलिंग पूर्व में इमेजिंग अधिग्रहण द्वारा निगरानी की जा सकती समय अंक निर्धारित किया है । सांसदों को आगे सीधे बृहदांत्र घावों में microinjected जा सकता है, कि बायोप्सी संदंश और इंडोस्कोपिक इमेजिंग द्वारा उत्पंन किए गए थे9, और उपचार पर उनके प्रभाव का आकलन किया जा सकता है । दोनों में इन विट्रो और vivo में घाव भरने के विश्लेषण के लिए, दण्डित घावों की छवियों को तुरंत घाव भरने के बाद (या अंयथा के रूप में निर्दिष्ट) और पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर उपचार प्रक्रिया के माध्यम से लगातार प्राप्त कर रहे हैं । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, घाव क्षेत्र में परिवर्तन (आकार) मापा जाता है और घाव बंद करने की दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया । PMN के आवेदन-सांसद है कि MPO में या तो कल्चरल उपकला monolayers या vivo में करने के लिए बृहदांत्र घावों हानिकारक प्रभाव है,9विलंबित हीलिंग करने के लिए अग्रणी ।

Figure 1
चित्र 1 . PMN का विश्लेषण-सांसद का आकार और सतह मार्करों द्वारा प्रवाह cytometry. (A) प्रवाह cytometer अनुकूलित नियंत्रण मोती (देखें सामग्री की तालिका) ज्ञात आकारों और तितर बितर मूल्यों के एसएससी और FSC ओर्थोगोनल प्रतिनिधित्व में दिखाया गया है । मोती एक PMN के साथ एक रिश्तेदार के आकार की तुलना प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है-सांसद बी में दिखाया नमूना (ख) मानव PMN-सांसद अलग और मोती के लिए वर्णित शर्तों का उपयोग कर cytometry प्रवाह द्वारा विश्लेषण किया गया । मप्र के आकारों में विविधता को देखा जा सकता है । (ग-घ) fMLF से व्युत्पंन सांसद-उत्तेजित murine अस्थि मज्जा PMNs प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । प्रतिनिधि प्रवाह आरेखों को अनदाग (C) या Annexin v-FITC सना हुआ (D) सांसद दिखाएं । आयताकार क्षेत्र Annexin वी-पॉजीटिव सांसदों (FITC-पॉजिटिव सांसदों) से पता चलता है । SSC: साइड कैटरिंग; FSC: आगे तितर बितर; पीएचएस: Phosphatidyl serine. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . PMN-सांसद धुंधला और विश्लेषण द्वारा प्रवाह cytometry । (क) दाग़ी और (ख) Annexin वी-FITC-और hCD11b-सुरक्ष-सना सांसद. वर्ग क्षेत्र पडते एक Annexin वी/CD11b डबल PMN-सांसदों की आबादी । (ग) हौसले से अलग मानव PMNs (1 x 106) एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग थे , N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC और fMLF के साथ उत्तेजित । सांसद सेल supernatants से अलग-थलग थे और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । आयताकार क्षेत्र में एक N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC सकारात्मक सांसद जनसंख्या (एम-FITC, वाई-अक्ष लेबल) पडते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . PMN की रचना-सांसदों उत्तेजना निर्भर है । (क) मानव PMNs को या तो IFNγ, TNFα, fMLF, पमा, या latranculin (fMLF-LtB) के पश्चात् fMLF बी के संयोजन से उत्तेजित किया गया. सांसद ultracentrifugation द्वारा परिणामी कोशिका supernatants से पृथक किए गए और प्रोटीन lysates 1% एसडीएस बफर में तैयार किए गए । प्रोटीन आकार electrophoretically द्वारा एक 10% polyacrylamide जेल में अलग किया, एक nitrocellulose झिल्ली में स्थानांतरित कर रहे थे, और या तो एक एमएमपी-9, MPO, या Annexin A1 प्राथमिक एंटीबॉडी उचित एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद के लिए जांच की । (ख) मानव PMN के प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियां-सांसदों का चित्रण आकार विविधता । आकार में एक exosome < 100 एनएम सफ़ेद तीर द्वारा दर्शाया गया है । स्केल बार = २५० एनएम (बाएं और दाएं पैनलों) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: अलग PMN का उपयोग-सांसद उपकला घाव भरने में PMNs की भूमिका का अध्ययन करने में । (क) कएको छैन-2 BBe मानव आंत्र उपकला कोशिकाओं को प्रभावित करने के लिए चढ़ाया गया, खरोंच-घायल हो गया, और ३,०००,००० PMNs, जो तुरंत बाद घायल जोड़ रहे थे से व्युत्पंन सांसदों के अधीन । प्रतिनिधि छवियाँ नियंत्रण में घाव बंद (४८ एच पोस्ट-घायल) दिखाने के लिए (बाएँ पैनलों) और PMN-सांसद-इलाज उपकला कोशिकाओं (सही पैनलों). स्केल बार = १०० µm । (ख) PMN के प्रभाव की जांच करने के लिए- vivo मेंबृहदांत्र घाव भरने पर सांसदों, पृथक PMN-सांसदों सीधे घाव एक एंडोस्कोपी आधारित microinjection प्रणाली का उपयोग कर क्षेत्र में इंजेक्ट किया गया (24 एच के बाद घायल, बृहदांत्र घाव है एक डैश्ड रेखा द्वारा रेखांकित और इंजेक्शन सुई साइट एक सफेद तीर द्वारा दिखाया गया है) । घाव बंद 3 दिन बाद आकलन किया गया था (4 दिन के बाद घायल) इंडोस्कोपिक इमेजिंग द्वारा । स्केल बार = ३०० µm. (c) 4 दिनों के बाद घायल चूहों euthanized थे और बृहदांत्र श्लैष्मिक घावों कैंची के साथ निकाले गए थे, इष्टतम काटने के तापमान में एंबेडेड (ओ. सी. टी) यौगिक और तरल नाइट्रोजन के साथ जमे हुए । घावों के आठ माइक्रोमीटर वर्गों ई के लिए दाग थे-cadherin (हरा) और परमाणु दाग DAPI (नीले) के स्तर का आकलन करने के लिए पुनः epithelialization (ऊपरी पैनलों), या DAPI (नीला) और Ki67 (लाल) के लिए कुल और proliferating उपकला कोशिकाओं पर कल्पना घाव बढ़त (कम पैनलों) । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

PMN-व्युत्पंन सांसदों के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल इस संचार में वर्णित हैं । कई महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण बिंदुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए प्रक्रिया की सफलता के लिए । सबसे पहले, PMNs ताजा अलग किया जाना चाहिए और अलगाव के 2 ज के भीतर प्रयोगों में इस्तेमाल किया सहज सक्रियण और दानेदार को रोकने के लिए । अलगाव के दौरान PMNs के सभी हैंडलिंग और उत्तेजना की बात करने के लिए बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए सक्रियकरण को रोकने के लिए और समय से पहले सांसद12जारी । दूसरा, ultracentrifugation 1 ज या अधिक के लिए सांसदों की गोली को अधिकतम । तीसरे, प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए, साधन ठीक से साधन का एक मिश्रण के साथ तुले होना चाहिए-निर्दिष्ट फ्लोरोसेंट मोती (मोतियों के प्रकार एक विशेष करने के लिए समायोजित किया जाता है साधन) को सही ढंग से सांसद आकार को परिभाषित । उदाहरण के लिए, जबकि प्रवाह cytometers के एक निर्माता एक आकार से संबंधित पैरामीटर के रूप में FSC मोतियों का उपयोग करने की सिफारिश की, दूसरों एसएससी मोतियों के लिए अनुकूलित किया गया है । इसके अलावा, सांसद विश्लेषण के लिए इस्तेमाल की जाने वाली फ्लो cytometer को अपग्रेड इलेक्ट्रॉनिक्स से लैस किया जाना चाहिए ताकि पृष्ठभूमि शोर से सांसद सबसे बेहतर हल कर सके ।

सही आकार मानकों के अलावा सांसदों की पहचान करने के लिए, ऊपर प्रक्रियाओं में वर्णित के रूप में प्रतिदीप्ति धुंधला का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है । इसके अलावा, तैयारी और अलगाव के दौरान सभी समाधान एक ०.१ µm फ़िल्टर प्रणाली के माध्यम से फ़िल्टर किया जाना चाहिए धूल कणों या अंय हाला कि प्रवाह cytometry द्वारा अधिग्रहण के दौरान पृष्ठभूमि शोर में वृद्धि होगी के शामिल किए जाने को कम करने के लिए । महत्वपूर्ण बात, सांसदों के भंडारण की स्थिति पर विचार किया जाना चाहिए । थोड़ा सबूत8, और हमारे अपने अप्रकाशित टिप्पणियों, सुझाव है कि सांसद ठंड झिल्ली टूटना और सांसद टूटना की ओर जाता है । अंत में, बदलती PMN सक्रियकरण शर्तों और समय बदल सकते है और सांसद उपज में सुधार होगा ।

इस विधि के लिए कुछ सीमाएं हैं । अस्थि मज्जा से माउस PMNs का अलगाव आम तौर पर शुद्ध नहीं है (~ 85 – 90%) और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा प्रदूषित है (मुख्य रूप से mononuclear लिम्फोसाइटों) के रूप में प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था. इस प्रकार, परिणामस्वरूप अलग अंय प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा जारी सांसदों की छोटी मात्रा में शामिल हो सकते हैं । विकल्प उपलब्ध है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चुंबकीय मोतियों से PMNs के अलगाव शामिल हैं, तथापि, यह एक लंबा और एक काफी महंगा प्रक्रिया होगी । अंत में, प्रतिदीप्ति लेबलिंग के बिना, आकार मानकों के अलावा, धूल या अंय घुलनशील या ऐसे ही आकार है कि नमूना दूषित कर सकते है के हवाई कणों से सांसदों के निश्चित भेदभाव चुनौतीपूर्ण और त्रुटि प्रवण है ।

भविष्य में, PMN की छंटाई-विशिष्ट मार्करों के साथ लेबल सांसदों विशिष्ट stimulatory शर्तों या रोग के मॉडल के तहत स्पष्ट सांसद संरचना में मदद मिलेगी, और उंमीद है कि नैदानिक मार्करों और संभावित उपचारात्मक लक्ष्यों के इलाज के रूप में सांसदों के उपयोग के लिए अनुमति भड़काऊ रोगों ।

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Disclosures

लेखकों का इस संचार से संबंधित किसी प्रकार के हित का कोई टकराव नहीं है

Acknowledgments

हम डॉ सुचित्रा स्वामीनाथन की तकनीकी सहायता के लिए आभारी है जो उत्तर पश्चिमी Feinberg स्कूल ऑफ मेडिसिन फ्लो Cytometry कोर चलाता है । फंडिंग (NIH) DK101675 द्वारा प्रदान की गई ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) Atlanta Biologics S11150
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140
0.5 M EDTA Fisher BP2482
Sodium chloride Sigma S9888 Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit
Sterile filtered Histopaque 1077 Sigma 10771
Sterile filtered Histopaque 1119 Sigma 11191 Density 1.119 g/ml.  Solution of polysucrose and  sodium diatrizoate. Bring to room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium Cellgro 210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof) Decon labs 2701
HBBS Corning 21-022-CV
Trypan Blue Solution, 0.4% Sigma T8154 SIGMA Diluted 1:2 for cell viability counting
Isoflurane Abbot 50033
Anti-human CD11b-APC conjugated Biolegend 301350 Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL)
BODIPY FL Invitrogen B10250 N-(2-aminoethyl) maleimide 
Annexin V Binding Buffer Biolegend 422201
Calibration Beads for Flow Cytometry BioCytex 7803
FITC Annexin V Biolegend 640906
Polymorphprep Axis-Shield PoC AS Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml
C57BL/6 mice Jackson Labs
15 ml centrifuge tubes Corning 430053
50 ml centrifuge tubes BD Falcon 352070
25 ml serological pipettes Celltreat 229225B
10 ml serological pipettes Celltreat 229210B
5 ml serological pipettes Celltreat 229205B
Pasteur pipettes  BD Falcon 357575
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) BD 305122
100 µm cell strainers Celltreat 229485
Vacutainer tubes BD 367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) BD (SORP)
Swinging bucket centrifuge ThermoFisher Scientific 75007210
Ultracentrifuge Beckman (L8-80 M)
Micro-centrifuge ThermoFisher Scientific  VV-17703-15 (Fresco 17)
Swinging bucket centrifuge ThermoFisher Scientific  75004503 (Megafuge 40R)
Biopsy forceps, 28 cm Storz 27071zj
Software
Image J National Institute of Health Open source 

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References

  1. Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
  2. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
  3. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  4. Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
  5. Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
  6. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
  7. Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
  8. Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
  9. Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
  10. Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
  11. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
  12. Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).

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इम्यूनोलॉजी अंक १३३ न्यूट्रोफिल microparticles microvesicles घाव भरने प्रवाह cytometry ultracentrifugation
अलगाव और न्युट्रोफिल के लक्षण वर्णन-कार्यात्मक अध्ययन के लिए व्युत्पंन Microparticles
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Finkielsztein, A., Mascarenhas, L.,… More

Finkielsztein, A., Mascarenhas, L., Butin-Israeli, V., Sumagin, R. Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e56949, doi:10.3791/56949 (2018).

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