Summary
Здесь описываются новые протоколы изолировать и характеризуют микрочастицы, производные от человека и мыши нейтрофилов. Эти протоколы используют ultracentrifugation, проточной цитометрии и immunoblotting методы для анализа содержания микрочастица, и они могут быть использованы для изучения роли микрочастицы, полученных из различных типов клеток в клеточную функцию.
Abstract
Полиморфноядерных нейтрофилов производные микрочастиц (ПМН)-м/с), липидный бислой, сферические микровезикулы с размерами от 50 до 1000 Нм в диаметре. М/с являются недавно развивается, важной частью ячеек для связи и сигнализации машин. Из-за их размера и характера их выпуска до недавнего времени было игнорировать существование MP. Однако с усовершенствованной технологии и аналитические методы теперь становится их функции в здоровье и болезни. Здесь представлены протоколы направленные на изоляцию и характеризующие ПМН-МПС проточной цитометрии и immunoblotting. Кроме того приводятся некоторые примеры реализации. Эти протоколы для изоляции MP быстрый, недорогой и не требует использования дорогих комплектов. Кроме того они позволяют для маркировки депутатов после изоляции, а также предварительно маркировки источник клеток до выпуска MP, используя проточной цитометрии мембраны конкретных Люминесцентную краску для визуализации и анализа. Эти методы, однако, имеют некоторые ограничения, включая чистоты ПНЛ и депутатов и потребность в сложных аналитических приборов. High-end проточный цитометр необходима для надежного анализа м/с и свести к минимуму ложные положительные читает из-за шума или auto флуоресценции. Описанные протоколы могут использоваться для изоляции и определить биогенеза MP и охарактеризовать их маркеры и изменения в составе различных стимулирующих условиях. Размер неоднородность может быть использована расследовать ли содержание частиц мембраны против exosomes отличается, и ли они выполняют различные роли в ткани гомеостаза. Наконец можно изучить следующие изоляции и характеристика депутатов, их функции в клеточных реакций и различных моделей болезни (в том числе, ПМН ассоциированных воспалительных расстройств, таких как воспалительные заболевания кишечника или острого повреждения лёгких).
Introduction
Недавно, «микрочастицы/микровезикулы» возникая от в цитозоле клеток или плазматической мембраны стали большой научный интерес, как новые данные показывают, что эти структуры, начиная от 50-1000 Нм в диаметре, может нести биологической информации и служить неканонических метод сотовой связи. Иммунной клетки производные м/с, и особенно производимые полиморфноядерных нейтрофилов (ПНЛ) представляют большой интерес, учитывая важную роль ПНЛ в принимающей обороны1,2, воспалительные реакции3и заживление ран 4. до настоящего времени, интригующе, многочисленные доклады показали, про воспалительных и противовоспалительным функции ПМН-МПС5, предлагая потенциальным контекст-, болезни-, видов-и органоспецифическая роль депутатов.
Описанные протоколы в этой связи обеспечивают экономически эффективные, инновационные и адаптируемой метод для изучения функции депутатов в здоровье и болезни. Они применимы для многих модельных организмов, органов и стимуляции условий. Они позволяют для идентификации нескольких типов депутатов и может использоваться в будущем для решения их про воспалительных и противовоспалительными функций. В качестве примера, описанные здесь, как для изучения функции ПМН-депутатов в эпителиальных рану исцеления, в пробирке и в естественных условиях. Представленные протокол для изоляции мыши, костного мозга, полученных ПНЛ был адаптирован с некоторыми изменениями из ранее описанных метод6.
Кроме того, протоколы, описанные в данном исследовании позволяют для обнаружения и определения характеристик определенных маркеров, которые могут быть найдены на ПМН-МПС двумя взаимодополняющими методами: западной помарки и проточная цитометрия. Мы находим, что immunoblotting депутатов, используя стандартные протоколы5 легко и надежно, однако, последние достижения в чувствительность потока цитометрии инструментов и улучшение коэффициента шума на сигнал теперь позволяют для дальнейшего анализа депутатов с помощью этого метода. Описанные протоколы в этом исследовании включать последние достижения и рекомендации от оригинальных научных статей, включая изменения в центрифугирования скорости и времени, помимо условий фильтрации и замораживания/хранения образца7 , 8и как уменьшить «шумы», повысить предел обнаружения ПМН-депутатов и дискриминацию между различными размерами депутатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные работы был одобрен северо-IACUC. Все эксперименты были завершены в соответствии и соблюдение всех соответствующих нормативных и институциональных руководящих принципов. Для сдачи донорской крови человека предметов осознанного согласия был представлен и подписано; Кроме того все человеке в этом исследовании рассматривались в соответствии с институциональной и федеральные руководящие принципы для благополучия человека.
Примечание: Протокол шаги, перечисленные в следующих подразделах: (i) изоляция клетки костного мозга мыши; (ii) ПМН изоляции из мышиных костного мозга; (iii) ПМН изоляции от человеческой крови; (iv) MP изоляции от ПМН Supernatants (по Ultracentrifugation); (v) Характеристика депутатов, западный Blotting; (vi) Характеристика депутатов подачей Cytometry; (viii) применение изолированных депутатов для исследования рану исцеление
1. мышь изоляция клетки костного мозга
-
Рассечение бедренной и большеберцовой кости от мыши задних лапах
- Подготовьте эвтаназии поле (например, поле Подсказка пустым 1 мл) для ингаляционной анестезии. Добавьте несколько капель 100% изофлюрановая на стерильной тканью, приклеенный к внутренней крышкой пластиковая коробка. Согласно новой IACUC руководящие принципы животные не приходят в прямой контакт с изофлюрановая, таким образом место Наконечник держателя между мышью и марля, содержащие изофлюрановая.
Примечание: Изофлюрановая является мощным ингаляционных анестетика и следует подходить с крайней осторожностью внутри зонта. - Усыпить мышей согласно рекомендации IACUC. Поместите мышь внутри окна эвтаназии, описанный в шаге 1.1.1 для 1 – 5 мин, до тех пор, пока он перестал дышать. Обеспечения смерти животного, выполняя шейки матки дислокации.
- Поднимите брюшной кожи с использованием нержавеющей стали, 12 см изогнутая, 0.17 мм X 0,1 мм пинцет и вырезать кожу на полпути между верхних и нижних конечностей. Очистите кожу от здесь в разделе наиболее дистальных мыши тела, включая нижних конечностей. С 10 см длиной прямо рассекает ножницы, удалите мышцы из задних ног и вывихнуть тазобедренного сустава, оставляя нетронутыми головку бедренной кости.
- Используйте ножницы, чтобы рассечь мышцы бедра и голени и бедра от голени. Убедитесь, что концы кости остаются нетронутыми, поскольку они содержат значительное количество костного мозга.
- Удалите все оставшиеся плоти прокаткой кости внутри бумажным полотенцем. Место чистой кости в чашку Петри, содержащие Serum-Free среднего (УЛП, т.е., средний (DMEM) Дульбекко изменение орла без сыворотки или антибиотики).
- Промывайте кости в 70% этанола и затем УЛП.
- Подготовка 50 мл УЛП в 50 мл Конические трубки. Загрузить в 10 мл шприц 10 мл УЛП и прикрепить его к иглы 25 и 5/8 дюйма.
- Обрежьте конец кости с ножницами до тех пор, пока отверстие на костный мозг (красного цвета) является видимым.
- Промойте клеток костного мозга в новый Тюбик 50 мл. Используйте шприц 10 мл с иглой колеи 26 и 5/8 дюйма с приблизительно 3 мл/кость УЛП. По окончании промывки Ресуспензируйте клетки в трубе, дозирование (использование Наконечники одноразовые 1 мл) сломать агрегаты клеток.
- Подготовьте эвтаназии поле (например, поле Подсказка пустым 1 мл) для ингаляционной анестезии. Добавьте несколько капель 100% изофлюрановая на стерильной тканью, приклеенный к внутренней крышкой пластиковая коробка. Согласно новой IACUC руководящие принципы животные не приходят в прямой контакт с изофлюрановая, таким образом место Наконечник держателя между мышью и марля, содержащие изофлюрановая.
2. ПМН изоляции из мышиных костного мозга
-
Лизис эритроцитов
- Пелле собранных костного центрифугированием при 350 x g 8 мин при 4 ° C.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 20 мл 0,2% NaCl для примерно 20-30 s чтобы лизировать часть эритроцитов. Не превышать 30 s как это приведет к ПМН lysis. Добавить 20 мл 1,6% NaCl для восстановления осмотического давления.
Примечание: Этот шаг может привести к очень мало ПМН активации. - Вымойте клетки с 2 мл PBS и центрифуги как шаг 2.1.1 выше. Удалите супернатант.
- Перейти к изоляции ПНЛ, плотность градиентного центрифугирования.
-
Изоляция нейтрофилов по плотности градиентного центрифугирования
- Polysucrose и натрия diatrizoate теплого, с плотностью 1.119 г/мл и 1,077 г/мл (см. Таблицу материалы), до комнатной температуры (RT) перед использованием.
- Подготовка polysucrose и натрия diatrizoate градиенты свежие, сразу перед нанесением клеток костного мозга, медленно расслоение 3 мл 1,077 г/мл раствора плотностью свыше 3 мл раствора плотностью 1.119 г/мл в 15 мл конические трубы.
Примечание: Подготовка градиентного раствора слишком далеко заранее приведет к смешивания слоев и бедных нейтрофилов чистоты и восстановления. - Ресуспензируйте Пелле клеток костного мозга в 1 мл ледяной PBS и наложение результирующий суспензию клеток на вершине polysucrose и натрия diatrizoate градиента (медленно, чтобы избежать смешивания слоев).
- Центрифуги для 30 мин при 850 x g при 25 ° C на RT, без тормозов. Держите реагентов на RT для эффективного разделения нейтрофилы от других клеток в костном мозге. Установите центрифуги на медленных замедления для градиента эффективно сформирована и сохранены после центрифугирования шага.
- Визуально обнаружить слоя мононуклеарных клеток на стыке PBS и 1,077 г/мл плотность раствора (верхний слой). Удалите этот слой и на остальной части плотность раствора не нарушая полосе ПМН.
- Соберите весь слой ПМН и некоторые из основных polysucrose и натрия diatrizoate 1.119 г/мл раствора в 15 мл пробирок с помощью пипетки передачи.
Примечание: Чистоту изолированных ПНЛ будет зависеть от полного удаления верхнего слоя. - Топ трубы с отфильтрованной PBS (фильтруется через фильтр размер поры 0,1 мкм) и центрифуги на 300 x g 5 мин, при 4 ° C.
- Вымойте гранулированных ПНЛ с 2 мл PBS с помощью центрифугирования условий как в шаге 2.2.7.
- Ресуспензируйте в 1 мл отфильтрованных PBS и рассчитывать изолированных ПНЛ, Горяева.
Примечание: Для этого метода изоляции, результирующий чистоты PMN составляет ~ 85-90%, как оценивалась путем проточной цитометрии. Оставшиеся загрязнения фракции состоит главным образом из мононуклеарных лимфоцитов.
-
ПМН стимуляции заставить MP-релиз
Примечание: ПНЛ может стимулироваться выпустить м/с, с использованием различных условий активации, включая N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-миристат-13-ацетат (PMA) или гамма-интерферона (IFNγ). Важно отметить, что до моделирования, ПНЛ должны храниться на льду во все времена.- Пелле ПНЛ (300 x g, 5 мин, 4 ° C) и Ресуспензируйте в 0,1 мкм фильтруют Хэнка сбалансированного солевого раствора раствор (HBSS), содержащий агент стимулирования выбора. Для оптимальной стимуляции используйте 100 мкл раствора стимуляции на 10 миллионов ПНЛ для 20-30 минут при 37 ° C в 15 мл пробирок.
Примечание: Следующие активаторы успешно использовались концентрации в нашей предыдущей работы: fMLF (0.5-1 мкм для человека и 2-5 микрон для мыши ПНЛ), PMA (200 Нм), а IFNγ (100 нг/мл). Если выпуск предварительно помечены депутатов, инкубировать кератоз ПНЛ (1-5 х 106) с N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (см. Таблицу материалы) (1 мкм в 100 мкл HBSS, 15 мин., 37 ° C). Приступайте шаги 2.3.1-2.3.3. - Спин вниз на 850 x g 5 минут при температуре 4 ° C, чтобы удалить ПНЛ и передать новый 1,5 мл пробирок microcentrifuge supernatants клетки бесплатно.
- Для MP изоляции от supernatants клетки бесплатно перейдите к шагу 4.2.
- Пелле ПНЛ (300 x g, 5 мин, 4 ° C) и Ресуспензируйте в 0,1 мкм фильтруют Хэнка сбалансированного солевого раствора раствор (HBSS), содержащий агент стимулирования выбора. Для оптимальной стимуляции используйте 100 мкл раствора стимуляции на 10 миллионов ПНЛ для 20-30 минут при 37 ° C в 15 мл пробирок.
3. ПМН изоляции от человеческой крови
-
Набираем здоровых добровольцев для извлечения крови согласно рекомендациям институциональных IRB.
- Сбор крови от предплечья здоровых добровольцев в коммерчески доступных 5 мл натрия цитрат содержащие трубы (см. Таблицу материалы).
- Пипетка 5 мл раствора diatrizoate декстран и натрия (плотность 1,113 г/мл, смотрите Таблицу материалы) в стерильных 15 мл пробирок и медленно слой 5 мл свежевыделенных периферической крови человека поверх него.
- Центрифуга трубы 50 мин на 400 x g на RT (25 ° C) с низкой ускорение и без тормозов.
- В конце центрифугирования удалите плазмы и мононуклеарных клеток (верхний слой) с помощью стерильных пластиковых всасывания пипетки.
- Нижний слой (ПНЛ) перевести в новый стерильный 50 мл Конические трубки.
- Добавьте равным объемом 0,45% NaCl ПНЛ (смесь хорошо и аккуратно, повернув трубу).
- Центрифуги для 10 мин на 400 x g при 25 ° C.
-
Лизис эритроцитов
- Добавить 10 мл ледяной, стерильной воды для гранулированных клетки для 45 s следуют 10 мл ледяной стерильные 1,8% NaCl для восстановления осмотического давления.
Примечание: Все следующие шаги для изоляции ПМН должно производиться на льду, чтобы избежать активации ПМН и досрочного освобождения MP. Лизис шаг, сам приводит к активации ПМН незначительные, но не значительные, однако, важно для изоляции чисто ПМН населения для функциональных анализов. - Центрифуга клетки для 10 мин на 250 x g при 4 ° C с мягкой замедление.
- Повторите шаги 3.2.1 и 3.2.2.
- Ресуспензируйте ПНЛ в 5 мл ледяной HBSS без кальция или магния. Граф всего живых клеток (используйте Горяева и жизнеспособности, пятнать в разведении 1:2, смотрите Таблицу материалы) до стимуляции.
Примечание: Изолированные ПНЛ должны использоваться для стимуляции или иных экспериментов в течение 2 ч изоляции чтобы избежать изменения функциональных и клеточных и смерть клетки.
- Добавить 10 мл ледяной, стерильной воды для гранулированных клетки для 45 s следуют 10 мл ледяной стерильные 1,8% NaCl для восстановления осмотического давления.
4. депутат изоляции от активированные ПМН Supernatants
Примечание: Аналогичный протокол используется для изоляции депутатов от ПНЛ мышиных и человека.
- Пелле ПНЛ (300 x g, 5 мин, 4 ° C) и Ресуспензируйте в 0,1 мкм фильтруют HBSS раствор, содержащий агент стимулирования выбора (например 1 мкм fMLF, см. Примечание: 2.3.1). Для оптимальной стимуляции используйте 100 мкл раствора стимуляции на 10 миллионов ПНЛ для 20-30 минут при 37 ° C в 15 мл пробирок.
- Следующие стимуляции, спин вниз активированные ПНЛ на 600 g x 5 минут при температуре 4 ° C и передавать новые 1,5 мл microcentrifuge трубы supernatants клетки бесплатно.
- Центрифуга ПМН очищены супернатант в 13000 x g, 10 мин, 4 ° C до удаления мусора клеток и передачи разминированных супернатант в новой ультрацентрифуга трубку.
- Центрифуги для 1 h на 100,000 x g, при 4 ° C. Удаление supernatants до хранения MP. При необходимости, магазин гранулированных м/с в ампулах ультрацентрифуга трубок-80 ° C до использования в экспериментах парафин.
5. изучение ПМН-депутатов, западный Blotting
- Добавить 1% SDS буфера (50-200 мкл рабочего раствора с pH трис 100 мм: 7,4) депутатам Пелле (из шага 4.4), передачи в новые трубы microcentrifuge 1,5 мл и варить лизированных депутатов за 5 мин.
Примечание: Количество депутатов и объем буфера lysis необходимо скорректировать и оптимизированы для каждого протеина интереса. -
Загрузите равных количествах ПМН-депутатов за Лейн в загрузке буфер, содержащий 10% β-меркапто этанола.
Примечание: С нашим методом мы загрузим м/с, которые были изолированы от такое же количество стимулировали ПНЛ.- Отделить лизатов на SDS-PAGE на 10% полиакриламидном геле (использовать 50-100 V на 1-1,5 ч) и передачи всего белков на нитроцеллюлозную мембраны как описано9.
- Блокировать мембраны за 1 час с 5% обезжиренное молоко в солевой раствор 0,05% Tween-20 трис-буфер и проинкубируйте его с соответствующей первичной (на ночь при 4 ° C), следуют вторичных HRP-конъюгированных антител.
- Визуализируйте полос путем добавления chemoluminescence решение мембраны и подверженности рентгеновской пленки внутри свет доказательство кассету (1-24 ч).
6. изучение ПМН-депутатов по проточной цитометрии
-
Для пятнать антитела, разбавьте антитела надлежащим образом в буфере СУИМ (PBS с 0,1 мм ЭДТА, азид натрия 0,1%). Ресуспензируйте гранулированных ПМН-МПС (производный от 1-3 х 106 ПНЛ/состояние) в раствор антител 100 мкл.
- Если окрашивание для Annexin V, Ресуспензируйте гранулированных ПМН-МПС в Annexin V буфер, содержащий 5 мкл FITC-конъюгированных Annexin V. Если совместно окрашивание с антителами, добавьте желаемый антитела (для примера см. Таблицу материалы) непосредственно Annexin V решение. Добавляют флуоресцентный липидов краситель, N-(2-aminoethyl) maleimide (см. Таблицу материалы), на 1 мкм концентрации в 100 мкл буфера СУИМ по маркировке и идентификации м/с.
- Инкубировать депутатов в окрашивание раствора для по крайней мере 20 мин при 4 ° C.
- Стирать депутаты ultracentrifugation (1 час на 100,000 x g, при температуре 4 ° C); Выбросите супернатант.
- Ресуспензируйте в буфере СУИМ и запуск образцов на назначенный проточный цитометр оснащены обновленный электронный блок для увеличения чувствительности (см. Таблицу материалы).
7. приложения для изолированных ПМН депутатов для изучения функции ПМН в заживлении ран
-
В естественных условиях администрация ПМН-депутатов толстой раны
- Анестезировать мышей, внутрибрюшинного введения смеси кетамин (100 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг). Подтвердите анестезии, педаль рефлекс (фирмы мыс пинча) и корректировать по мере необходимости.
- Поместите курсор мыши на ее живот и с помощью биопсии 28-см щипцы и эндоскопа, оборудован с камерой с высоким разрешением (например ветеринарных эндоскоп для использования малых животных, см. Таблицу материалы), генерировать неглубокие раны 3-5 вдоль спинной стороне Колон. После завершения ранения возвращение мышей к клетке помещен на коврике контролируемой температурой (37 ° C) пока не оправился.
- Анестезировать мышей (как в шаге 7.1.1). Используйте эндоскопа для получения изображения, нанесенные раны 24 часа (1 день) после ранения. Пусть мышей восстановить как шаг 7.1.2.
- В то же время (24 ч после ранения) администрирование мышиных ПМН-МПС, производный от ПНЛ6 2 x 10 в 100 мкл HBSS + непосредственно в каждом рану сайт с помощью системы (используйте иголку 29 G) на основе колоноскопия микроинъекции9. Три дня позже (4-й день после ранения) анестезировать мышей (как в шаге 7.1.1) и использования эндоскопа для повторного получения изображения заживления ран. Пусть мышей восстановить как шаг 7.1.2.
- С помощью предпочтительный образ программного обеспечения для анализа (см. Таблицу материалы), набросков видны раны регионов в полученных изображений, мера области же раны на дней 1 и 4 после ранения и вычислить процент закрытия раны.
-
Человека эпителиальных клеток в vitro заживление ран
- BBe Како-2 фото или T84, человека кишечные эпителиальных клеток, 5 x 105 клеток/хорошо Горяева и семян в 24-ну культуры пластин. Инкубируйте клетки в камере стандартного инкубации при 37 ° C и 5% CO2. Како-2 BBe или T84 достичь confluency в течение 48 ч9. Культура клетки эпителия, использовать DMEM и DMEM-F12 (50: 50) с добавками как ранее описанные9.
- Генерировать механические царапин ран в монослое с помощью кончика пипетки и низкой всасывания как описано4,9. Получать изображения участков раны сразу же после царапин с помощью микроскопа Перевернутый фазово контрастной дифференциальной помехи (5 X или 10 X цели), чтобы использоваться как время = 0 контрольной точки.
- Добавьте м/с (производный от 2-4 X 10 ПНЛ6 ) монослои царапается ранен эпителиальных клеток и инкубировать на дополнительные 24 часа (48 ч после ранения, при 37 ° C с 5% CO2). В настоящее время повторно получить изображения скретч-ран.
- Использовать программное обеспечение для анализа предпочтительный образ (см. Таблицу материалы) для измерения области раны на t = 0, t = 48 ч. вычислить процент закрытия РАН, определяя разницу в области раны в точках выбранного времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ представительных потока гранулярных депутатов, которые были изолированы от человека и мыши ПНЛ показаны на рисунке 1. Размер неоднородность ПМН-депутатов могут быть оценены путем сравнения для известных размера бусин, как показано на рисунке 1A, B для человека м/с. Примечание, никаких существенных различий в размер неоднородность наблюдались между мыши и человека MPs. Аналогичным образом с помощью проточной цитометрии и Маркировка флуоресцирования, выражение протеина/s выбора отдельных депутатов мыши или человеческого происхождения может быть определена. Например, можно проанализировать выражение фосфатидилхолин Серина (PhS) путем пятнать Annexin V. Костного мозга мышиных ПМН-МПС показаны на рисунке 1C, D. Выражение несколько маркеров выбора также может быть оценена, как показано для Annexin V и CD11b пятнать человека депутатов, Рисунок 2A, B. Другой способ обнаружить ПМН-МПС проточной цитометрии является пятно свежей изолированные ПНЛ до стимуляции, как показано на рис. 2C. Например ПМН окрашивание с маркером липидов N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC до fMLF стимуляции результаты в выпуске Зеленый депутатов, которые могут быть легко обнаружены потоком. Следует отметить во время окрашивания с N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC ранее не использовался для обозначения и обнаруживать м/с, которые были получены из периферической крови человека10 или вводят в животных11, использование других маркеров для маркировки целей для в vitro или в естественных условиях приложение должно определяться каждый следователь. В дополнение к проточной цитометрии ПМН-МПС могут быть проанализированы по immunoblotting для протеинов интереса. Как показано на рисунке 3, MPs, производный от человека ПНЛ, которые были стимулировали с нескольких известных активаторов, были изучены для выражения ключа воспалительных (матрица metallopeptidase 9 (ММП-9) и миелопероксидаза (МПО)) и противовоспалительный (Annexin А1) молекул. Как видно из представителя иммуноблотов, ПМН стимуляции с IFNγ (50 нг/мл), PMA (200 Нм), и fMLF (1 мкм) привели к выражая различные уровни MMP-9 м/с. Однако только возмущений Цитоскелет актина Латрункулин B (1 мкм) перед стимуляции с fMLF (5 мкм) привело к обильным присутствие МПО в ПМН-MPs. Аналогичным образом на м/с после описанных условий активации были обнаружены различные уровни Annexin A1 (высокий без обнаружения). Эти результаты позволяют предположить, что состав ПМН-MP стимул зависимых.
Наконец Рисунок 4 показывает как изолированные ПМН-МПС могут быть использованы для изучения раневой исцеления in vitro и in vivo в толстой травмы. ПМН-МПС могут быть добавлены к скретч ранен эпителиальных монослои в культурах, где исцеление может контролироваться изображений приобретение в предопределенное время точках. М/с далее могут быть microinjected непосредственно в толстой раны, создаваемых по биопсии щипцы и эндоскопической изображений9, и можно оценить их влияние на исцеление. В пробирке и в естественных условиях анализа заживления ран, изображения, нанесенные раны приобретаются сразу после ранения (или иным образом оговоренных) и непрерывно через процесс заживления ран в предопределенное время точках. Использование коммерчески доступных изображений программное обеспечение для анализа, изменения в области раны (размер) измеряются и используются для определения скорости закрытия раны. Приложение ПМН-депутатов, которые содержат MPO либо культивированный эпителиальных монослои или в естественных условиях толстой раны имеет пагубные последствия, ведущие к замедленного заживления9.
Рисунок 1 . Анализ размера ПМН-MP и поверхностных маркеров подачей cytometry. (A) проточный цитометр оптимизированный управления бусины (см. Таблицу материалы) известных размеров и разброс значений приводятся в ортогональных представлением ККК и FSC. Бисер используются для получения относительного размера сравнение с образцом ПМН-MP, показано в б. (B) человека ПМН-депутаты были изолированы и анализируемой проточной цитометрии, с помощью условий, описанных для бисера. Неоднородность в MP размеров можно увидеть. (DC–) М/с, производные от fMLF стимулирует мышиных костного ПНЛ были проанализированы проточной цитометрии. Представитель схемы показывают, безупречная (C) или Annexin V-FITC Витражи (D) м/с. Прямоугольная область показывает Annexin V-позитивных м/с (FITC-позитивных депутатов). SSC: Стороны точечной; FSC: Вперед разброс; PhS: Фосфатидилхолин серина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . ПМН-MP окрашивание и анализ подачей cytometry. Unstained (A) и (B) Annexin V FITC - и hCD11b-APC-окрашенных м/с. Площадь Площадь замыкает Annexin V/CD11b двойной положительный населения ПМН-м/с. (C) свеже изолированные человека ПНЛ (1 x 10-6) окрашивали Люминесцентная краска , N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC и стимулировали с fMLF. Депутаты были изолированы от supernatants клетки и проанализированы проточной цитометрии. Прямоугольная область прилагает позитивные maleimide-FITC N-(2-aminoethyl) MP населения (M-FITC, метки оси y). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Состав ПМН-депутатов зависит от стимул. (A) человека ПНЛ были стимулируется с IFNγ, TNFα, fMLF, PMA или сочетание latranculin B, а затем fMLF (LtB-fMLF). Депутаты были изолированы от результате supernatants клетки, ultracentrifugation и белка лизатов были подготовлены в 1% SDS буфера. Белки были разделены по размеру электрофорезно в геле полиакриламида 10%, передан нитроцеллюлозную мембрану и исследован для MMP-9, МПО или Annexin A1 основное антитело, следуют соответствующие HRP-конъюгированных вторичные антитела. (B) представитель электронной микроскопии изображают образы человека ПМН-депутатов размер неоднородности. Exosome < 100 Нм в размер обозначается белой стрелкой. Шкалы бар = 250 Нм (левой и правой панели). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Использование изолированных ПМН-МТ в изучении роли ПНЛ в эпителиальных ранозаживляющие. (A) ЦАС-2 BBe, что кишечные эпителиальных клеток человека были покрытием confluency, скретч ранен, и подвергаются депутатам, производный от 3 миллионов ПНЛ, которые были добавлены сразу после ранения. Представитель изображения показывают закрытия РАН (48 ч после ранения) управления (левой панели) и ПМН-MP-лечение эпителиальных клеток (правой панели). Шкалы бар = 100 µm. (B) для изучения влияния ПМН-депутатов на толстой раны исцеления в естественных условиях, изолированные ПМН-МПС были вводится непосредственно в область раны с помощью системы на основе эндоскопии микроинъекции (на 24 ч после ранения, кишечное раны является изложил пунктирной линией и инъекции место введения иглы отображается белая стрелка). Закрытия РАН был начисленных 3 дня спустя (4 дней после ранения), эндоскопическая изображений. Шкалы бар = 300 µm. (C) 4 дня после ранения мышей были умерщвлены и толстой кишки слизистых оболочек раны были извлечены с ножницами, встроенные в оптимальной резки температуры (O.C.T) соединение и заморожены жидким азотом. Восемь микрометра разделы раны были витражи для E-Кадгерины (зеленый) и ядерных пятно DAPI (синий) для оценки уровня эпителизация (верхняя панели), или DAPI (синий) и Ki67 (красный) для визуализации всего и пролиферирующих эпителиальных клеток в края раны (нижняя панели). Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом сообщении описываются протоколы изоляции и характеристика ПМН производные депутатов. Для успешного проведения процедуры необходимо учитывать несколько ключевых критических точек. Во-первых ПНЛ должен быть изолирован свежие и используется в экспериментах в течение 2 ч изоляции для предотвращения спонтанного активации и дегрануляции. Все обработки ПНЛ во время изоляции и вплоть до стимуляции должны выполняться на льду для предотвращения активации и преждевременной MP версии12. Во-вторых ultracentrifugation на 1 час или более максимизирует грануляции м/с. в-третьих, для анализа проточной цитометрии, инструмент должен правильно откалиброван с сочетанием указанный инструмент флуоресцентные бусины (тип бусины корректируется для конкретного инструмент) правильно определить размеры MP. Например в то время как один производитель потока цитофлуориметрами рекомендует использование FSC бусины в качестве параметра, связанные с размером, другие были оптимизированы для SSC бусины. Кроме того проточный цитометр использоваться для MP анализа должны быть оборудованы модернизированный электроники лучше всего решить м/с от фонового шума.
Чтобы правильно определить м/с, в дополнение к параметры размера, настоятельно рекомендуется использовать флуоресценции, окрашивание, как описано в процедурах выше. Кроме того все решения в процессе подготовки и изоляции должны быть отфильтрованы через систему фильтрации 0,1 мкм для сведения к минимуму включение частицы пыли или других осадков, которые увеличат фоновый шум во время приобретения проточной цитометрии. Важно отметить, что следует рассмотреть условия хранения депутатов. Мало доказательств8и наши собственные неопубликованные наблюдения, предполагают, что депутат замораживание приводит к плодного и поломки MP. Наконец различной ПМН активации условий и сроков может изменить и улучшить урожайность MP.
Существуют некоторые ограничения в этот метод. Изоляция мыши ПНЛ из костного мозга обычно не чисто (~ 85 – 90%) и загрязнена другие иммунные клетки (главным образом мононуклеарных лимфоцитов), как было определено гранулярных анализа потока. Таким образом результирующая изолятов может включать небольших количествах депутатов, выпущенное другие иммунные клетки. Альтернативы доступны и включают изоляцию ПНЛ коммерчески доступных магнитных бисером, однако, это будет дольше и процедура значительно дороже. Наконец без маркировки флуоресценции, помимо параметров размера, окончательное дифференциации депутатов от пыли или других растворимых или воздухе частиц аналогичных размеров, которые могут загрязнять образца является сложным и подверженным ошибкам.
В будущем сортировка ПМН-депутатов с конкретными маркеры поможет прояснить MP композиция под конкретные условия стимулирующей или модели болезни и мы надеемся разрешить использование депутатов диагностических маркеров и потенциальных терапевтических целей для лечения воспалительные заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никакого конфликта интересов любого рода, связанных с этой связи
Acknowledgments
Мы благодарны за технической помощи Сваминатана Сучитра доктора, который проходит северо-Фейнберг Школа из медицины потока цитометрии ядро. Финансирование было предоставлено DK101675 (НИЗ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
