Her viser vi hvor enkelt molekyle foto-aktiveret lokalisering mikroskopi kan udføres på den motoriske nerve terminal af en levende Drosophila melanogaster tredje instar larve.
Et stigende antal super-resolution mikroskopi-teknikker er med til at afdække de mekanismer, der styrer nanoskala cellular verden. Enkelt-molekyle imaging er vinder momentum, da det giver enestående adgang til visualisering af individuelle molekyler i levende celler. Her, beskriver vi en teknik, som vi udviklede for at udføre enkelt-partikel tracking foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (sptPALM) i Drosophila larver. Synaptic kommunikation bygger på centrale præsynaptiske proteiner, der fungerer ved docking, grunding og fremme fusion af neurotransmitter-holdige vesikler med plasmamembran. En vifte af protein-protein og protein-lipid interaktioner regulerer stramt disse processer og de præsynaptiske proteiner derfor udviser ændringer i mobilitet forbundet med hver af disse vigtige begivenheder. Undersøge, hvordan mobilitet af disse proteiner korrelerer med deres fysiologiske funktion i en intakt levende dyr er nødvendigt for at forstå deres præcise virkningsmekanisme. Udvinde protein mobilitet med høj opløsning i vivo kræver at overvinde begrænsninger såsom optiske gennemsigtighed, tilgængelighed og indtrængningsdybde. Vi beskriver, hvordan photoconvertible fluorescerende proteiner markeret til den præsynaptiske protein Syntaxin-1A kan visualiseres via lille skrå belysning og spores på den motoriske nerve terminal eller langs motorneuron axon af tredje instar Drosophila larve.
Neuronal kommunikation bygger på neurotransmitter frigivelse, som opstår gennem de regulerede fusion af neurotransmitter-holdige synaptiske vesikler med plasma membran1. Denne proces kaldes exocytose2,3,4,5,6 er meget dynamisk og kan blive op – eller nedreguleret ifølge udsving i antallet af stimulation7. Proteiner involveret i disse processer er underlagt Brownske bevægelser, og derfor vise nanostørrelse organisation i stand til at opretholde en række bindende foranstaltninger, der underbygger disse fysiologiske funktioner. Plasma Membranproteiner er meget dynamisk, giver mulighed for lateral diffusering af molekyler i nanoclusters på plasma membran7,8,9,10,11, 12. Som sådan, undersøger mobilitet af disse proteiner hjælper med at belyse deres tilstand af aktion8. Synaptic proteiner som de opløselige N-ethylmaleimide følsomme faktor vedhæftet fil protein receptorer (snarer), for eksempel Syntaxin-1A, vides nu at udstille laterale hurtig mobilitet samt lateral fældefangst inden for nanoclusters, der kan tjene som Molekylær depoter og websteder for vesikel fusion9,13,14,15.
Den seneste udvikling af photoconvertible fluorescerende proteiner, såsom monomere (m) Eos16,17 og Kaede18, har tilladt nanostørrelse opløsning af neuronal plasma Membranproteiner ved hjælp af tilgange sådanne som foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)14,15,19. Disse udviklinger har aktiveret undersøgelser af mobilitet og nanoclustering af biologiske proteiner i kulturperler levende celler og neuroner. På det seneste har er undersøgelser blevet udført for at belyse (på lignende høje opløsninger) dynamics og organisation af disse Membranproteiner i neuroner i live intakt organismer sådan Mus musculus, Caenorhabditis elegans, og Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Undersøger dynamics og organisation af et protein i vivo kræver ikke kun brugen af nyligt udviklede super-resolution billedbehandling værktøjer (såsom PALM, STORM og photoconvertible fluorophores), men også evnen til at overvinde hindringer sådanne som tilgængelighed af protein og indtrængningsdybde af imaging laser. Imaging intracellulære proteiner i en intakt dyr er i sagens natur udfordrende som imaging proteiner på strukturer indlejret dybt i levende væv i det intakte dyr, som hippocampus en intakt mus. Dermed er proteiner på eller tæt på overfladen af vævet mere let afbildet. En anden vanskelighed med imaging i vivo er at sikre reproducerbarheden på tværs af dyr. Som anatomi kan afvige fra én prøve til den anden, kunne at vælge en struktur med lethed af replikering i forskellige intakte dyr prøver også være udfordrende. Brugen af stereotype strukturer, såsom synapser, hjælpe med at overvinde nogle af disse vanskeligheder.
Nylige undersøgelser har afbildet protein mobilitet i dyr med en optisk gennemsigtig epidermis såsom Caenorhabditis elegans22, mens andre undersøgelser har afbildet protein organisation på overfladen af en væv/organ, for eksempel aktin imaging i kortikale neuroner gennem kraniet af en levende mus21. I nogle tilfælde, er anæstetika blevet brugt til at holde dyret immobile; imidlertid privatpersons specifikke anæstetika protein af interesse. Alternative midler til at holde dyr immobile under i vivo billeddannelse bør derfor undersøges for at minimere fejl.
En anden advarsel til Super-resolution billedbehandling i vivo er at lasere anvendes til at belyse proteiner af interesse kunne påvirke det omgivende væv, og dermed holde excitation intensiteten så lav som muligt anbefales. Belysning af det omgivende væv af laser også en tendens til at øge baggrunden signal. Brug af lav excitation intensitet hjælper med at reducere baggrunden, det forbehold, at det kunne også føre til et fald i fluorescerende proteiner photon udbytte. Baggrund subtraktion under analysen kan anvendes som alternativt middel til at reducere baggrund signal før billedanalyse.
Drosophila præsenterer en ideel organisme for i vivo billeddannelse som indeholder det veletablerede genetiske værktøjer for undersøgelse af specifikke protein funktion. Den upstream aktiverende sekvens (UAS)-Gal4 system giver tidsmæssige og rumlige udtryk af proteiner og kan derfor bruges til at manipulere neurotransmission23, sådan at thermo-genetiske stimulation ved hjælp af Drosophila forbigående receptor potentielle undergruppen A1 (dTRPA1)24 eller opto-genetiske stimulation ved hjælp af far-rød-forskudt CsChrimson25 kan kombineres med billedbehandling14. Vi har overvundet mange af komplikationer af udfører i vivo enkelt-molekyle imaging i dette system og nu beskrive hvordan enkelt-partikel tracking kan udføres i Drosophila melanogaster tredje instar larver.
Denne protokol beskriver enkelt-molekyle sporing af mEos2-mærkede proteiner på den neuromuskulære junction i Drosophila tredje instar larve. For at undgå overdrevne udtryk af transgene protein, var Syntaxin-1A-mEos2 udtryk drevet af endogent Syntaxin-1A promotor. Undersøgelser af synaptic protein mobilitet er for det meste blevet begrænset til in vitro- undersøgelser af dyrkede celler og kortikale neuroner9,11,12,13. Om disse proteiner udviser lignende mobilitet signaturer i et levende dyr er stort set ukendt. For at visualisere single-protein mobilitet i vivo, har begrænsninger såsom optiske gennemsigtighed, tilgængelighed og penetration dybde skal overvindes. Ved at dissekere den larve forberedelse og visualisere neuromuskulære udfletningerne indlejret på overfladen af musklen, undgå vi spørgsmålet om optisk gennemsigtighed og tilgængelighed. Forsøg at billedet enkelt-molekyle mobilitet i normale JOHANNAS konfiguration viste sig forgæves. Men brug lidt skrå belysning giver mulighed for øget excitation laser gennemtrængende dybde. Derudover minutien nåle bruges til at immobilisere larve bidraget til at undgå enhver mulig negativ virkning af bedøvelse brug på protein mobilitet. Det er muligt at bruge højere forstørrelse mål, såsom 100 x olie fordybelse mål, til at visualisere enkelt molekyler in vivo. Men øget forstørrelse kan øge forekomsten af driver ude af fokus. Derudover har vi brugt en lavere intensitet (~ 30%) 561 nm laser med held at billedet enkelt molekyler på motoriske nerve terminaler. Yderligere undersøgelser kan være nødvendigt at bruge lavere laser power.
Denne protokol er velegnet til at visualisere mobilitet af synaptic proteiner i nærhed af neuronal plasmamembran. Brug denne fremgangsmåde, mobilitet af SNARE protein – Syntaxin-1A og autophagosome bundet protein Atg18a – har været succesfuldt afbildet in vivo14,26. Mobilitet af proteiner på motor neuron axons kan også blive undersøgt27. Men undersøgelsen af mobilitet af proteiner i hjernen eller ventrale nerve ledningen kan vise sig vanskeligt at vurdere på grund af den høje baggrund signal produceret af det underliggende væv; Derudover visualisere protein mobilitet på samme hjerne struktur vil kræve fluorescently tagging hjerne struktur (for at sikre replikerbarhed), og brugen af dobbelt-kamera billedbehandling ville være nødvendig.
Nuværende metoder til Super-resolution mikroskopi i Drosophila er for det meste begrænset til billedbehandling embryoner, snarere end mere udviklede tredje instar larve38,39. Det største problem med disse protokoller er at give et lavt antal baner i området afbildet, og dermed forhindre dybdegående analyse af mobilitet stater22,40. Vores i vivo enkelt molekyle tracking protokollen har kapacitet til at generere et stort antal baner, og kan derfor anvendes i andre dyremodeller såsom Caenorhabiditis elegans og zebrafisk. Faktisk genereret hver NMJ kæde ~ 2.400 baner gør det egnet til at analysere forskellige mobile tilstande og overgange mellem disse stater14,27. Derudover mange i vivo enkelt molekyle imaging strategier er afhængige af brugen af anæstetika til at immobilisere den dyr20,22, som kan ændre den fysiologiske funktion, hvorunder billeddannelse sker. Her optimeret vi en ‘anæstesi-fri’ protokol for at immobilisere larverne ved hjælp af minutien pins.
En potentiel anvendelse af denne protokol kan være til at visualisere mobilitet af proteiner i tre dimensioner. De seneste fremskridt i Super-resolution mikroskopi tillade protein mobilitet skal være visualiseret i vitro i ‘x’, ‘y’, og ‘z’ dimensioner41,42. Vores nuværende metode tager ikke højde for mobilitet af proteiner i “z-akse. Endnu Drosophila motoriske nerve terminal er en kugleformet struktur og en værdifuld fremtidige tilgang vil være at kvantificere protein mobilitet i en tre-dimensionel volumen43. Billedbehandling i z-dimension er muligt ved hjælp af en Astigmatisk linse. Alternativt, JOHANNAS tilstand44,45, z-opløsning er også steget. Men i vores forsøg, har vi brugt lidt skrå belysning for at visualisere enkelt molekyler af syntaxin1A-mEos2 uden Astigmatisk linse.
Afslutningsvis, tilgængeligheden af både en transgene Drosophila flyve bestand udtrykte proteiner markeret med et photoconvertible protein, et PDMS base at dissekere de transgene larve, samt en JOHANNAS mikroskop udstyret med mulighed for at ændre den vinkel belysning er de vigtigste nødvendige værktøjer til at visualisere enkelt proteiner som beskrevet i denne protokol.
The authors have nothing to disclose.
Vi takke Jean-Baptiste Sibarita og Daniel Choquet (IINS, CNRS/University of Bordeaux) for deres venlige støtte med enkelt-molekyle analyse. Vi takker især Nick Valmas og Jessica Mcgaw (QBI, University of Queensland) for deres hjælp med video optagelse, voice-over samt finde grafisk design. Dette arbejde blev støttet af projektets australsk forskning Rådet (AR) opdagelse (DP170100125 til F.A.M.), det australske Forskningsråd (LIEF Grant LE0882864 til F.A.M.), fremtiden Fellowship (FT100100725 til B.V.S.), australske Forskningsråd (LIEF Grant LE130100078 til F.A.M.) og NHMRC projekt (APP1103923 til B.V.S.). F.A.M. er en NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).
PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |