Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.
Eine wachsende Zahl von Höchstauflösung Mikroskopiertechniken tragen dazu bei, die Mechanismen aufzudecken, die die nanoskaligen zellulären Welt regieren. Einzelmolekül-Bildgebung gewinnt an Dynamik bietet außergewöhnlichen Zugang zur Visualisierung einzelner Moleküle in lebenden Zellen. Hier beschreiben wir eine Technik, die wir entwickelt, um Single-Particle Tracking Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie (SptPALM) in Drosophila Larven führen. Synaptische Kommunikation stützt sich auf wichtige präsynaptischen Proteine, die Handeln durch Andocken, Grundieren und fördern die Verschmelzung von Neurotransmitter-haltige Vesikel mit der Plasmamembran. Eine Reihe von Protein-Protein und Protein-Lipid-Interaktionen fest regelt diese Prozesse und die präsynaptischen Proteine weisen daher Änderungen in Mobilität mit jedem von diesen wichtigen Ereignissen verbunden. Untersuchen, wie die Mobilität dieser Proteine mit ihre physiologische Funktion in einer intakten lebendes Tier korreliert ist für das Verständnis ihrer genauen Wirkmechanismus. Extrahieren von Protein Mobilität mit hoher Auflösung in Vivo erfordert die Überwindung der Einschränkungen z. B. optische Transparenz, Zugänglichkeit und Eindringtiefe. Wir beschreiben, wie Photoconvertible fluoreszierende Proteine markiert mit dem präsynaptischen Protein, das Syntaxin-1A kann über leichte Schrägbeleuchtung visualisiert und verfolgt auf dem motorischen Nerv-Terminal oder entlang der Motoneuron Axon des dritten, Drosophila instar Larve.
Neuronale Kommunikation beruht auf Neurotransmitter-Freisetzung, die durch die regulierte Fusion von Neurotransmitter-haltigen synaptischen Vesikel mit der Plasmamembran1auftritt. Dieser Prozess namens Exozytose2,3,4,5,6 kann ist sehr dynamisch und Up – oder Down-reguliert nach Schwankungen in der Rate der Stimulation7. Die Proteine, die in diesen Prozessen Brownsche Bewegung unterliegen und daher anzeigen nanoskopische Organisation in der Lage eine Reihe von verbindlichen Maßnahmen, die diese physiologischen Funktionen zu untermauern. Plasmamembran Proteine sind sehr dynamisch, so dass seitliche Trapping von Molekülen in Nanocluster auf der Plasmamembran7,8,9,10,11, 12. So hilft untersucht die Mobilität dieser Proteine, ihre Art der Maßnahme8aufzuklären. Synaptischen Proteine wie die löslichen N-Ethylmaleimide sensiblen Faktor Anhang Protein Rezeptoren (SNAREs), z. B. Syntaxin-1A, sind nun bekannt, seitliche schnelle Mobilität aufweisen, sowie seitliche Trapping innerhalb Nanocluster, die als molekulare dienen können Depots und Websites für Vesicle Fusion9,13,14,15.
Die jüngste Entwicklung der Photoconvertible fluoreszierende Proteine, wie z.B. Monomere (m) Eos16,17 und Kaede18, ermöglichte nanoskopischen Auflösung der neuronalen Plasmamembran Proteine durch den Einsatz von Ansätze solcher als Foto-aktivierte Lokalisierung Mikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)14,15,19. Diese Entwicklungen haben Untersuchungen bezüglich der Mobilität und Nanoclustering der biologischen Proteine in lebenden Zellen kultiviert und Neuronen aktiviert. Vor kurzem wurden Studien durchgeführt, (mit ähnlich hohen Auflösungen) die Dynamik und Organisation dieser Membran Proteine in den Neuronen intakt Lebewesen so Mus Musculus, Caenorhabditis Elegans und aufzuklären Drosophila Melanogaster14,20,21,22.
Die Dynamik und Organisation eines Proteins in Vivo zu untersuchen erfordert nicht nur Einsatz von neu entwickelten Super-Resolution imaging-Tools (z. B. PALM, Sturm und Photoconvertible Fluorophore), sondern auch die Fähigkeit, solche Hindernisse zu überwinden als Zugänglichkeit des Proteins und die Eindringtiefe des Lasers imaging. Imaging intrazelluläre Proteine in einem intakten Tier ist von Natur aus herausfordernd wie Proteine auf Strukturen eingebettet tief in lebendes Gewebe des intakten Tieres, z. B. im Hippocampus, einer intakten Maus imaging ist. Daher werden Proteine auf oder nah an der Oberfläche des Gewebes leichter abgebildet. Eine weitere Schwierigkeit mit in-Vivo imaging ist bei der Sicherstellung der Reproduzierbarkeit über Tiere. Da die Anatomie von einer Probe zur anderen unterscheiden könnte, könnte Auswahl einer strukturiertes mit Leichtigkeit der Replikation in verschiedenen intakten Tier Proben auch anspruchsvolle. Die Verwendung von Stereotypen Strukturen, wie z. B. Synapsen, helfen einige dieser Schwierigkeiten zu überwinden.
Jüngste Studien haben Protein Mobilität bei Tieren mit einer optisch transparente Epidermis wie Caenorhabditis Elegans22, abgebildet, während andere Untersuchungen Organisation Protein auf der Oberfläche eines Gewebes/Organs, zum Beispiel abgebildet haben Aktin Bildgebung in kortikalen Neuronen durch den Schädel einer live Maus21. In einigen Fällen haben Anästhetika eingesetzt, um das Tier unbeweglich zu halten; jedoch können bestimmte Anästhetika Proteins des Interesses beeinträchtigen. Alternative Mittel, Tiere während der in-Vivo Bildgebung unbeweglich zu halten sollte daher geprüft werden, um Fehler zu minimieren.
Ein weiterer Vorbehalt zu super-Resolution imaging in Vivo ist, dass die Laser verwendet, um die Proteine des Interesses zu beleuchten das umliegende Gewebe negativ beeinflussen könnten, und sich daher die Anregung Intensität möglichst gering zu halten empfiehlt. Beleuchtung des umliegenden Gewebes durch den Laser neigt auch dazu, das Hintergrundsignal zu erhöhen. Die Verwendung von niedrigen Anregung Intensität verringert den Hintergrund, der Nachteil, es könnte auch zu einem Rückgang der fluoreszierenden Proteins Photon Ertrag führen. Hintergrundabzug während der Analyse könnte verwendet werden, als Alternative Mittel um das Hintergrundsignal vor Bildanalyse zu reduzieren.
Drosophila präsentiert Organismus idealen für in-Vivo imaging, da es etablierte genetische Werkzeuge für die Untersuchung der spezifischen Proteinfunktion bietet. Die vorgelagerten aktivierende Sequenz (FH)-Gal4-System ermöglicht die zeitliche und räumliche Expression von Proteinen und können daher verwendet werden, um Neurotransmission23, verändern so dass Thermo-genetische Stimulation mit Drosophila transiente potenzielle Unterfamilie Rezeptor A1 (dTRPA1)24 oder Opto-genetische Stimulation mit weite rote verschoben CsChrimson25 kombinierbar mit imaging-14. Wir haben viele der Komplikationen des Durchführens in Vivo Einzelmolekül-Bildgebung in dieses System überwunden und nun beschreiben, wie Single-Particle tracking in Drosophila Melanogaster dritte Instar Larven durchgeführt werden kann.
Dieses Protokoll beschreibt Einzelmolekül-Tracking der mEos2-markierten Proteine an der neuromuskulären Synapse von Drosophila dritte Instar Larve. Zur Vermeidung von Überexpression von transgenen Proteinen trieb Syntaxin-1A-mEos2 Ausdruck von endogenen Syntaxin-1A-Promoter. Studien der synaptischen Protein Mobilität wurden meist beschränkt auf in-vitro- Untersuchungen der kultivierten Zellen und kortikalen Neuronen9,11,12,13. Ob diese Proteine ähnliche Mobilität Signaturen in ein lebendes Tier weisen ist weitgehend unbekannt. Um Single-Protein Mobilität in Vivozu visualisieren, Einschränkungen z. B. optische Transparenz, Zugänglichkeit und Durchdringung Tiefe müssen überwunden werden. Sezieren die Larven Vorbereitung und Visualisierung der neuromuskulären Kreuzungen auf der Oberfläche des Muskels eingebettet, vermeiden wir die Frage der optischen Transparenz und Zugänglichkeit. Versuche, Bild Einzelmolekül-Mobilität in normalen TIRF Konfiguration als erfolglos erwiesen. Jedoch ermöglicht die Verwendung von leicht schräg Beleuchtung für erhöhte Erregung Laser tiefe Eindringen. Darüber hinaus half die Minutien Pins verwendet, um die Larven zu immobilisieren, um mögliche nachteilige Auswirkungen der Narkose Nutzung auf Protein Mobilität zu vermeiden. Es ist möglich, höhere Vergrößerung Ziele, wie die 100 x Öl Immersion Ziele zu verwenden, um einzelne Moleküle in Vivozu visualisieren. Höhere Vergrößerung erhöht jedoch das Auftreten der Abbaustrecken unscharf. Darüber hinaus haben wir eine geringere Intensität (~ 30 %) verwendet. 561 nm Laser erfolgreich Bild einzelne Moleküle bei motorischen Nervenenden. Zusätzliche Tests muss gegebenenfalls geringere Laserleistung zu verwenden.
Dieses Protokoll eignet sich für die Mobilität der synaptischen Proteine in der Nähe der neuronalen Plasmamembran zu visualisieren. Mit diesem Ansatz, die Mobilität des SNARE – Syntaxin-1A und das Autophagosome Protein Atg18a gebunden – Proteins wurden erfolgreich abgebildeten in Vivo14,26. Die Mobilität der Proteine auf Motoneuron können Axone auch sein untersucht27. Untersuchung der Mobilität der Proteine im Gehirn oder ventralen Nervenstrang erweisen sich jedoch schwierig, aufgrund der hohen Hintergrundsignal produziert durch das darunter liegende Gewebe zu beurteilen; Darüber hinaus visualisieren Protein Mobilität auf die gleichen Gehirnstruktur benötigen Eindringmittel tagging die Gehirnstruktur (um die Nachvollziehbarkeit zu gewährleisten), und Verwendung von Dual-Kamera-Bildgebung erforderlich sein würde.
Aktuelle Methoden zur Verfügung, für die Super-Auflösung Mikroskopie in Drosophila beschränken sich meist auf bildgebende Embryonen, anstatt mehr dritte Instar Larve38,39entwickelt. Das Hauptproblem mit diesen Protokollen ist, dass sie eine geringe Anzahl von Trajektorien im Bereich abgebildet ergeben, und daher eingehende Analyse der Mobilität Staaten22,40 verhindern. Unsere in Vivo Einzelmolekül tracking-Protokoll hat die Fähigkeit, eine hohe Anzahl von Trajektorien zu generieren, und daher in anderen Tiermodellen wie Caenorhabiditis Elegans und Zebrafisch verwendet werden konnten. In der Tat, erzeugt jede NMJ-Kette ~ 2.400 Trajektorien eignet sich somit für die Analyse der verschiedenen mobilen Zustände und Übergänge zwischen diesen Staaten14,27. Darüber hinaus setzen viele in Vivo Einzelmolekül bildgebende Strategien auf die Verwendung von Anästhetika, die Tiere20,22, die physiologische Funktion verändern könnten, unter der die Bildgebung erfolgt, zu immobilisieren. Hier haben wir ein Protokoll “Anästhesie-frei”, um die Larven, die mit Hilfe der Minutien Pins zu immobilisieren optimiert.
Eine mögliche Verwendung dieses Protokolls möglicherweise für die Mobilität von Proteinen in drei Dimensionen zu visualisieren. Jüngste Fortschritte in der Super-Auflösung Mikroskopie ermöglichen Protein Mobilität visualisiert in Vitro in ‘X’, ‘y’ und ‘Z’ Abmessungen41,42. Unsere aktuelle Methode berücksichtigt nicht die Mobilität der Proteine in der ‘Z’-Achse. Noch der motorischen Nervenendigung Drosophila ist eine kugelförmige Struktur und eine wertvolle Zukunft werden Protein Mobilität in ein dreidimensionales Volumen43zu quantifizieren. Bildgebung in der Z-Dimension ist machbar mit einem astigmatischen Objektiv. Alternativ ist die Z-Auflösung in TIRF Modus44,45, auch erhöht. In unseren Experimenten haben wir jedoch leicht schräg Beleuchtung verwendet, um einzelne Moleküle des syntaxin1A-mEos2 ohne die astigmatische Linse zu visualisieren.
Abschließend Verfügbarkeit sowohl einer transgenen Drosophila fliegen Aktie mit dem Ausdruck Proteine markiert mit einem Photoconvertible Protein, ein PDMS Basis zu sezieren die transgenen Larve sowie einem TIRF-Mikroskop verfügt über die Möglichkeit einer Änderung der Winkel der Beleuchtung sind die wichtigsten Werkzeuge, um einzelne Proteine zu visualisieren, wie in diesem Protokoll beschrieben.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Jean-Baptiste Sibarita und Daniel Choquet (IINS, CNRS/Universität von Bordeaux) für die freundliche Unterstützung mit der Einzelmolekül-Analyse. Wir bedanken uns besonders bei Nick Valmas und Jessica Mcgaw (QBI, University of Queensland) für ihre Hilfe mit dem Video Aufnahme, Voice-over sowie Grafikdesign herauszufinden. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Australian Research Council (AR) Discovery Project (DP170100125, F.A.M.), Australian Research Council (LIEF Grant LE0882864, F.A.M.), Zukunft Fellowship (FT100100725, B.V.S.), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078, F.A.M.) und NHMRC Projekt gewähren (APP1103923, B.V.S.). F.A.M. ist NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).
PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |