Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

القياس الآلي كبسولة السكاريد الأنواع الفطري وجسم الخلية

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

ويصف هذا الأسلوب معالج صورة دفعي الآلي المصممة لقياس إنصاف أقطار الجسم وكبسولة السكاريد. بينما في البداية مصممة لقياسات المرسلة بين كبسولة يمكن أيضا تطبيق معالج الصور الآلي الأخرى الكشف عن التباين على أساس من الكائنات دائرية.

Abstract

والغرض من هذا الأسلوب لتوفير عملية متسقة ودقيقة، ويمكن التحكم فيها لعدد كبير من القياسات كبسولة السكاريد.

أولاً، يتم إنشاء صورة عتبة استناداً إلى قيم الكثافة حساب فريد لكل صورة. ثم، يتم الكشف عن الدوائر استناداً إلى التباين بين الكائن والخلفية باستخدام خوارزمية التحويل هوغ دائرة (CHT) الراسخة. وأخيراً، تتم مطابقة كبسولات الخلية المكتشفة والهيئات وفقا لإحداثيات مركز وحجم دائرة نصف قطرها، ويتم تصدير البيانات إلى المستخدم في جدول بيانات يمكن التحكم فيها.

مزايا هذه التقنية بسيطة ولكنها هامة. أولاً، لأنه يتم تنفيذ هذه العمليات الحسابية خوارزمية بدلاً من إنسان زيادة الدقة والموثوقية. لم يكن هناك أي انخفاض في دقة أو موثوقية بغض النظر عن كم عدد العينات ويتم تحليل. ثانيا، هذا النهج يضع إجراءات تشغيل موحدة محتملة للحقل بين بدلاً من الوضع الراهن حيث يختلف القياس كبسولة من مختبر. ثالثا، نظراً لأن قياسات كبسولة اليدوية بطيئة ورتيبة، يسمح أتمتة القياسات السريعة على عدد كبير من خلايا الخميرة الذي بدوره يسهل تحليل البيانات عالية الإنتاجية وإحصاءات قوية على نحو متزايد.

تأتي القيود الرئيسية لهذا الأسلوب من كيفية وظائف الخوارزمية. أولاً، سوف تولد الخوارزمية الدوائر. بينما بين الخلايا وعلى كبسولات تأخذ على مورفولوجيا دائرية، سيكون من صعوبة في تطبيق هذا الأسلوب للكشف عن كائن غير دائرية. ثانيا، بسبب كيفية الكشف عن الدوائر يمكن الكشف عن الخوارزمية سلاسل تلال تشيتاجونج هائلة الدوائر الزائفة استناداً إلى الحواف الخارجية لعدة دوائر متفاوت المسافات. ومع ذلك، أي الهيئات الخلية محرفة اشتعلت داخل دائرة الزائفة يمكن بسهولة الكشف عن وإزالتها من مجموعات البيانات الناتجة.

المقصود من هذا الأسلوب لقياس كبسولات السكاريد دائرية بين الأنواع استناداً إلى الحبر الهند ميدان مشرق المجهري؛ على الرغم من أنه يمكن أن تطبق على أساس التباين الأخرى قياسات كائن دائري.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هو المرسلة بين خميرة المسببة للأمراض العثور على أوبيكويتوسلي من جميع أنحاء العالم التي ترتبط مع الأمراض البشرية أساسا في إيمونوسوبريسيد السكان. وتستأثر المرسلة جيم- أبرزها سببا هاما من مجموع الوفيات السنوية في أفريقيا جنوب الصحراء بسبب الأمراض المعدية1. المظاهر السريرية الرئيسية الإصابة الفطري هو التهاب السحايا والدماغ، الذي يتبع غزو للجهاز العصبي المركزي بالنقل في الضامة المصابة (طريقة حصان طروادة) أو مباشرة من عبور حاجز الدم في الدماغ. جيم-المرسلة وتعرب عن عدة عوامل الفوعة بما في ذلك القدرة على إجراء نسخ متماثل في درجة حرارة جسم الإنسان والنشاط آريس، شكل الميلانين وتشكيل السكاريد كبسولة2. كبسولة السكاريد يتكون من تكرار جلوكورونوكسيلومانان والبوليمرات جلوكورونوكسيلومانانجالاكتان والمهام كحاجز وقائي ضد عوامل الإجهاد البيئي و الاستجابات المناعية المضيف2.

على الرغم من أن حجم الحجم الكبسولة السكاريد الفطري لم يكن دائماً مقترنة بضراوة، هناك أدلة على أنها عامل في نشوء المرض2،3،،من45، 6،7. الحجم الكبسولة يرتبط ب أمراض التهاب السحايا6ويمكن أن تؤثر على بلعم القدرة على التحكم في العدوى بين 5، ويمكن أن يؤدي فقدان الفوعة إذا تغيب8. ومن ثم، قياسات الحجم الكبسولة المشتركة في البحوث الفطري، لكن هناك لا فيلدويدي القياسية لطريقة قياس الكبسولة.

في الوقت الراهن، المرسلة C. السكاريد كبسولة قياس يستند إلى دليل قياسات الصور مجهرية، وتختلف أساليب الشراء الصورة والقياس الدقيق عبر المختبرات9،10، 11. مصدر قلق فوري لهذا الأسلوب هو أن بعض الدراسات تتطلب الحصول على آلاف قياسات الفردية، مما يجعل من الصعب الحفاظ على الدقة والموثوقية. وعلاوة على ذلك، حتى عندما يتم نشر النتائج، هناك غالباً عدم كفاية وصف طريقة القياس. العديد من المنشورات لا تفسر كيف تم الحصول على هذه القياسات، واستخدمت ما هو المستوى البؤري، وكيفية تحديد الحد الأدنى لتحديد الكبسولة، سواء كانوا نصف القطر أو القطر، وما إذا كانت تستخدم في قياس واحد أو بلغ عدة، أو غيرها التفاصيل. بعض المنشورات الدولة الوحيدة على الأسلوب كالبرنامج الذي المستخدم، مثلاً، "أدوبي فوتوشوب CS3 استخدمت لقياس الخلايا"11. وهذا الافتقار إلى التوحيد القياسي، والإبلاغ عن تفاصيل يمكن جعل إمكانية تكرار نتائج صعبة إذا لم يكن من المستحيل. شريحة الاختلافات في البصر البشري، وسطوع الكمبيوتر، إعدادات المجهر، الإضاءة، وعوامل أخرى يمكن أن تختلف ليس فقط بين الأفراد ولكن بين العينات، بينما العمليات الحسابية المستندة إلى نسب لقيم الكثافة بكسل سوف تظل ثابتة و المعمول بها بين العينات. تم إنشاء هذا الأسلوب في سياق توفير تقنية موحدة ودقيقة وسريعة وبسيطة لقياس الأحجام كبسولات لحقل الذي كان هناك لا شيء قبل.

كما ذكر آنفا، الخوارزمية سلاسل تلال تشيتاجونج منذ أمد طويل، وقد كتب بالكشف تلقائياً عن دوائر البرامج النصية قبل. ويحسن هذا الأسلوب في هذين المجالين حيث سيقع مخطوطات أخرى قصيرة. أولاً، مجرد الكشف عن الدوائر لا يكفي، لأنه يجب الكشف عن دائرتين متميزة مع خلايا الفطري بالنسبة لبعضها البعض. هذا الأسلوب يكتشف الهيئات الخلية داخل كبسولات على وجه التحديد، يميز بين الاثنين، ويتولى إجراء العمليات الحسابية فقط على أزواج كبسولة الهيئة ذات الصلة. ثانيا، حتى عند اتباع نفس البروتوكول، والمحققين مختلفة سوف ينتهي مع مختلف الحصول على الصور. السماح بمراقبة كل معلمة خوارزمية المحقق، يمكن تعديل هذه الأداة لتتناسب مع مجموعة واسعة من طرق اكتساب. ليس هناك حاجة لنطاق موحدة، والهدف، والتصفية، وهكذا.

يمكن تطبيق هذا الأسلوب يسهل على أي الحالة التي يحتاج المحقق إلى الكشف عن الدوائر داخل صورة هذا التباين مع خلفيتهم. كل الدوائر أخف وزنا وأكثر قتامة مما يمكن الكشف عن خلفيتهم، عد، وتقاس باستخدام هذا الأسلوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-إعداد الشرائح الحبر الهند

  1. "الماصة؛" 10 ميكروليتر من عينة الفطري إلى شريحة. سيعمل أي سلالة الخميرة التعميم ولكن لهذه التجربة كان H99 السلالة الوحيدة المستخدمة.
    ملاحظة: إذا كانت العينة مباشرة من وسائط الثقافة، تمييع 1:2 مع برنامج تلفزيوني أو المياه يمكن أن تساعد على منع الحبر الهند من التثاقل.
  2. "الماصة؛" 2 ميليلتر من وصمة الحبر الهند على العينة ومزيج ماديا دفع طرف الماصة للعينة وتتحرك في حركة دائرية حتى يظهر الحبر الهند موزعة بالتساوي.
  3. ضع ساترة على العينة بالضغط باستمرار على الحافة اليسرى من ساترة ضد سطح الشريحة، ثم بلطف وبشكل متساو خفض الجانب المعاكس ساترة على العينة.
  4. تسمح الشريحة للهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
  5. بلطف تطبيق طبقة خفيفة من طلاء الأظافر على الحدود ساترة لتشكيل ختم والحفاظ على وصمة الحبر الهند.

2-تصوير الشريحة

  1. وضع الشرائح في مجهر حقل مشرق مع مرفق الكاميرا والمعروفة بكسل إلى ميكرون التحويل. ضبط عوامل التصفية، وأهداف، والتباين حيث أن الكبسولات الخلية واضحة والهيئات الخلية عصابات الظلام، مركزة.
    ملاحظة: مختلف المرشحات، والأهداف، وإعدادات التباين ستعمل ولكن ينصح 20 × الهدف وتصفية Ph1 binning 2 × 2.
  2. ضمان مجال الرؤية كثيفة ولكن لا المكتظة بالسكان مع خلايا الفطري، مع تباين واضح بين كبسولة الخلية والخلفية، ومركزة بشكل صحيح مع خلايا الجسم تصور كعصابة الظلام.
    ملاحظة: العدد الدقيق للخلايا لصورة مثلى ستختلف بعينه والهدف قيد الاستخدام. الجوانب الهامة لضمان الخلايا غير متفاوت المسافات أو متداخلة، وأن الطائرتين تنسيق الخلية لا تختلف اختلافاً كبيرا، وأنه لا يوجد كبير الهند الحبر وصمة عار مرئية بوضوح في الخلفية (25 في المائة على الأقل من الحقل).
  3. حفظ الصور بدليل واحد مع عناوين واضحة، كما سيتم تشغيل خوارزمية القياس على الصور في دليل واحد، وسيتم تنظيم بيانات الإخراج حسب أسماء ملفات الصور.

3-خوارزمية برنامج الإعداد

  1. تثبيت بيثون الإصدار 2.7 من
  2. تثبيت مكتبات بايثون إضافية عن طريق تشغيل الأوامر "نقطة تثبيت وسادة" و "تثبيت برنامج تطبيق السلام أوبينبيكسل".
  3. تثبيت MATLAB باتباع الإرشادات التي تظهر في
  4. بناء مكتبة بيثون MATLAB باتباع الإرشادات المتوفرة في https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. تنزيل الملفات المطلوبة الثلاث المدرجة في "المواد التكميلية" هذه المخطوطة ("QCA.py" و "Analysis2.m" و "TestRun.m").
    ملاحظة: يمكن استخراج هذه الملفات إلى أي مكان، ولكن يجب أن يكون الثلاثة في نفس الدليل.

4-استخدام خوارزمية

  1. قم بتشغيل التطبيق بالنقر المزدوج على QCA.py.
    ملاحظة: التطبيق قد يستغرق عدة دقائق لبدء. يحتوي الملف "QCA.py" على هيكل البرنامج الذي يستدعي الملفات ".m" لتشغيل خوارزمية الفعلية.
  2. اتبع الخطوات الموضحة في البرنامج.
    1. إدخال نوع ملحق ملفات الصور التي تسبقه فترة ومفصولة بفواصل منقوطة (ex. ". معرض طرابلس؛. jpeg ") ثم اضغط على الزر Enter .
    2. اختر الدليل الذي توجد ملفات الصور بالنقر فوق الزر تحديد دليل تحديد المجلد الذي يحتوي على الصور.
    3. إنشاء قائمة ملفات الصور في الدليل عن طريق النقر فوق الزر إنشاء قائمة الصور . سيتم سرد الصور في مربع النص إلى اليمين. مراجعة والتأكد من القائمة دقيقة وكاملة.
    4. حدد صورة عشوائية من القائمة لاستخدامها كمعاينة قبل النقر فوق الزر تحديد صورة عشوائية .
      ملاحظة: إذا كانت الصورة غير قادر على فتح بسبب "خطأ وضع صورة غير صحيحة"، الخوارزمية سوف لا تزال تعمل بشكل صحيح على الرغم من عدم عرض الصورة. بعد خطوة 4.2.7، لا يزال سيتم عرض صورة الاختبار.
    5. مجهر الإدخال الهدف و binning الإعدادات. إذا لم تتطابق المجهر يستخدم الإعدادات الافتراضية، حدد "مخصص بكسل تحويل '' والمدخلات بكسل-إلى-أم التحويل لملفات الصور. وبمجرد اختيار، انقر فوق الزر حساب التحويل وضمان التحويل بشكل صحيح وفقا لمربع النص على الحق.
      ملاحظة: الصور التمثيلية هو مبين في الشكل 1 حسبت مع 40 x التكبير و 2 × 2 binning المحددة.
    6. إدخال معلمات خوارزمية للكشف عن الدائرة.
      1. إدخال دائرة نصف قطرها الحد الأدنى والحد الأقصى يمكن كشفها للكشف عن كبسولة الخارجي كإدخالات Min و Max كبسولة Radius. مجموعة أصغر تسمح نتائج أكثر دقة.
      2. إدخال دائرة نصف قطرها الحد الأدنى والحد الأقصى يمكن كشفها للكشف عن خلايا الجسم كإدخالات دقيقة ونصف قطر جسم الخلية ماكس.
        ملاحظة: كل أربعة من هذه الإدخالات يجب أن تكون الأرقام تمثل قيمها كل بكسل، وفقا لمصدر الصور.
      3. حرك مربعات التمرير الكبسولة وحساسية خلايا الجسم لضبط عتبة حساسية الخوارزمية. حساسية منخفضة ستكون صارمة والحد من الكشف عن دائرة إيجابية كاذبة، ولكن يمكن أيضا الكشف عن الدوائر الحقيقية أقل. على العكس من ذلك، ستزيد من معدل اكتشاف حساسية عالية لكن قد ينتج أيضا عن دوائر إيجابية كاذبة.
        ملاحظة: تم الحصول على النتائج الممثلة مع الحد الأدنى من دائرة نصف قطرها كبسولة من 7، الحد الأقصى من دائرة نصف قطرها كبسولة من 45، نصف قطر الجسم الحد الأدنى من 4، الجسم أقصى دائرة نصف قطرها 30، حساسية كبسولة من 87، وحساسية الجسم من 87.
    7. اختبار المعلمات على الصورة تم اختيارها عشوائياً بواسطة النقر فوق الزر تشغيل الاختبار . سيتم عرض النتائج في مركز العليا للبرنامج، استبدال الصورة الأصلية. إذا كانت النتائج تبدو دقيقة، من المستحسن لتحديد صورة عشوائية إضافية لمحاولة كذلك لكفالة المعلمات المحددة تناسب كافة الصور المحددة.
      1. زيادة عدد الهيئات والكشف عن كبسولات وبصريا فحص ما إذا كانت الدوائر التي تظهر لتناسب بشكل صحيح. سيتم عرض العدد الهيئات داخل كبسولات كشف في مربع النص إلى اليمين. وبخلاف ذلك، معالجة معلمات خوارزمية حتى تكون النتائج دقيقة.
        ملاحظة: دوائر ملونة سميكة فقط للمساعدة في التصور. الدوائر الفعلية التي تم إنشاؤها لقياس منحنى رياضية حسابها بواسطة خوارزمية كليات التقنية العليا.
    8. تشغيل خوارزمية الكشف على الدليل بأكمله لملفات الصور بالنقر فوق زر البدء في التحليل . وسيتم تحليل كل صورة، وسيعرض البرنامج "انتهت" في مربع النص إلى اليمين عند كل الصور قد تم تحليلها.
    9. انقر فوق الزر المباراة وتنظيف . وهذا تتطابق مع الهيئات الخلية المكتشفة على كبسولات المكتشفة يقيمون في، وحساب نصف قطر كبسولة الحقيقية عن طريق طرح مجموعة من كبسولة.
      ملاحظة: إذا كان يتم استخدام الخوارزمية للكشف عن الأسفار أو حالة أخرى فيها دائرة واحد فقط الكشف عن هذه الخطوة غير ضرورية. بدلاً من ذلك انقر فوق سحب الهيئات فقط أو الزر سحب كبسولات فقط لجمع البيانات للأزرق فقط أو فقط دوائر خضراء، على التوالي. من المهم ملاحظة أن إلا إذا كان يتم استرداد البيانات كبسولة دائرة نصف قطرها سوف تشير إلى مجموع نصف قطر الخلية كما لا يمكن طرح نصف قطر جسم الخلية.
    10. تحديد موقع البيانات المنجزة في الملف "CleanedOuput.csv" في الدليل الصورة. إلا إذا تم اختيار قطعة واحدة من البيانات، سيتم تسمية الملف "CleanedBodies.csv" أو "CleanedCapsules.csv".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتم أولاً الحصول على الصور بالفحص المجهري للحبر الهند الشرائح باستخدام مجهر حقل مشرق مقترنة بكاميرا (الشكل 1أ). من المهم أن تكون الخلايا المنفصلة وفي كثافة منخفضة بما فيه الكفاية لا باكتساح ميدان عرض، كذلك فيما يتعلق باستخدام وصمة عار ما يكفي لخلق تباين بين الخلايا والخلفية. وكما ورد في البروتوكول، ستختلف العدد الدقيق للخلايا لصورة مثلى عينة ومجهر والهدف المستخدمة. الجوانب الهامة لضمان الخلايا غير متفاوت المسافات أو متداخلة، وأن الطائرتين تنسيق الخلية لا تختلف اختلافاً كبيرا، وأنه لا يوجد كبير الهند الحبر وصمة عار مرئية بوضوح في الخلفية (25 في المائة على الأقل من الحقل). تسمح هذه الاتجاهات الخوارزمية لتحديد عتبة فريدة من نوعها لكل صورة بأخذ قيمة بكسل متوسط الكثافة وأضاف الانحراف المعياري. يعتبر أي بكسل مع قيمة كثافة أعلى من عتبة قال أبيض وأي مع قيمة كثافة أقل يعتبر أسود. الصورة الناتجة يسمح تمييز واضحة ونقية من حيث ينتهي الكبسولة (الشكل 1ب). الخوارزمية ثم دائرة تباين أبيض على أسود قوية تعتمد على كشف للكبسولة والصورة الأصلية توفر دائرة أبيض على أسود قوية للأجهزة المحمولة. يتم إنشاء مرئيات ممثل من الدوائر تم الكشف عنها كجزء من البرنامج (الشكل 1ج). وهذا يسمح للمستخدم لتحليل من خلال معالجة الصور بسرعة وضمان ظهور النتائج دقيقة.

من الضروري أن يتبع البروتوكول المحدد الحصول على صور أفضل. عادة ما يؤدي الصور دون المستوى الأمثل من عدم التناقض بين الكبسولة والحبر (الشكل 2أ). معلمات التباين واقتناء الأمثل يختلف استناداً إلى عينة، والتجربة، وكاميرا ومجهر نماذج، إلخ. صورة مثلى هي واحدة حيث يتم فصل خلايا الخميرة إذا كان ذلك ممكناً، حيث الحافة الخارجية للكبسولة على النقيض الواضح لوصمة عار الحبر الهند، وحيث يتركز جسم الخلية تظهر كعصابة الظلام الذي يتناقض بشدة مع خلفيتها. إذا كانت الخلايا كثيرة جداً في مجال الرؤية أو إذا كانت وصمة عار خفيفة جداً، سيتم تجميع قيم كثافة بكسل والبرنامج لن يكون قادراً على تحديد عتبة قادرة على توضيح الحجم الكبسولة (الشكل 2ب). عندما تستخدم الصور دون المستوى الأمثل البرنامج يمكن الكشف عن دوائر من أحجام غير صحيحة لا تكون قادرة على الكشف عن أي دوائر أو الكشف عن عدة دوائر الزائفة استناداً إلى النتائج الملموسة في الصورة عتبة (الشكل 2-ج).

الكشف عن الأجهزة المحمولة يطرح مشكلة مماثلة في ذلك يجب أن تصور الجسم خلية كقوى دائرة سوداء على خلفية بيضاء الكبسولة. وتعالج هذه المشكلة في البروتوكول عندما تصف المستوى البؤري المطلوب للحصول على الصور. أفضل تنسيق لاستخدام الطائرة هو واحد التي يظهر فيها الجسم خلية كعصابة الظلام، مركزة (الشكل 3أ). هذا المستوى البؤري مقبولة كمعيار لأنه يركز بشكل صحيح في الخلايا. وهذا ما أكده تصور جدار الخلية مع أوفيتيكس، وصمة عار كيتين (الشكل 3ب). وصمة عار ويبين بوضوح هش، ركز أوفيتيكس جدار الخلية مع إشارة ضعيفة في الوسط (حيث العلوي والسفلي من جسم الخلية سوف تكون الملون، خارج التركيز).

في تطوير هذا الأسلوب من المهم أيضا التأكد من أن هذه الخوارزمية يمكن تحديد دقة القياسات الكبسولة وجسم الخلية. بينما الدوائر الممثلة في الأرقام السابقة واعدة، تم مقارنة القياسات الفعلية بين الكمبيوتر والقياسات البشرية. عندما يتم اتباع البروتوكول بدقة وهي الحصول على صور أفضل، الخوارزمية دقيقة وموثوق بها (الشكل 4أ). ومع ذلك، إذا كان يتبع البروتوكول بشكل غير صحيح، ويتم الحصول على الصور دون المستوى الأمثل بسبب تلطيخ الفقراء، واكتظاظ السجون، أو معلمات أخرى سبق ذكرها، الخوارزمية يفقد الدقة ولا يمكن تلخيص القياسات البشرية (الشكل 4ب ). وبهذا الأسلوب وضعت أصلاً لشخص معين (البلاغ الأول)، طلب من شخص آخر لاستخدامها لتحديد إذا كانت الاختلافات بين أنماط تلطيخ وقياس سيؤثر على الدقة على الرغم من البروتوكول التالي. وأظهرت النتائج أن هذا الأسلوب لا ينطبق على نطاق واسع طالما كان يتبع البروتوكول كتعليمات (الشكل 4ج). وبالمثل، يمكن استخدام هذا الأسلوب مع أي مجهر قادرة على الحصول على مرحلة التباين الصور من الشرائح الحبر الهند مستعدة. لضمان لا يزال الخوارزمية دقيقة مع سائر الأجهزة مجهر وتكررت هذه التجربة بالثلث المحقق باستخدام مجهر حقل مشرق مختلفة مقترنة بكاميرا ومقارنة مع أقطار كبسولة المكتشفة مع كبسولة المقاسة يدوياً أقطار. ولوحظ لا يوجد فرق كبير بين الكمبيوتر والقياسات البشرية (الشكل 4د).

وأخيراً، تم استكشاف التطبيقات المستقبلية لهذه الخوارزمية في سياق تلطيخ الأسفار. منذ تصوير الأسفار تزال تعتمد على إشارة إلى نسب الضوضاء من قيم بكسل الكثافة ينبغي أن تكون الخوارزمية سهولة المنطبقة على الصور fluorescence طالما وصمة التعميم في الطبيعة. وقد تأكد هذا التطبيق عندما الخوارزمية كانت قادرة على كشف بنجاح أوفيتيكس الملون الهيئات الخلية من الصور تم وصفه مسبقاً (الشكل 5أ، 5). المستخدمين يجب أن تكون حذراً لتحسين معلمات خوارزمية لتجربتهم، وينبغي وضع بروتوكولات موحدة في المستقبل لأي طلبات جديدة.

Figure 1
الشكل 1 : نتائج تمثيلية للصورة التي تم الحصول عليها على النحو الأمثل. ألف الصورة الأولية المكتسبة بالفحص المجهري الحقل مشرق شريحة الحبر الهند. ب الصورة الثنائية التي تم إنشاؤها باستخدام عتبة محسوبة من كثافة بكسل متوسط القيمة المضافة للانحراف المعياري. وتعتبر كافة قيم أعلى من هذا الحد الأبيض وتعتبر جميع أدناه الأسود. جيم تصور كبسولات (الأخضر) وخلية الهيئات (أزرق) الكشف عنها بواسطة الخوارزمية. تم الحصول على جميع الصور في 40 x التكبير مع binning 2 × 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : نتائج الممثل صورة أمثل الفرعية التي تم الحصول عليها. ألف الشريحة الحبر الهند الأولية المكتسبة عن طريق مجهر الحقل مشرق. التفاوت وعدم كفاية تلطيخ النتائج في خلفية ساطعة لا سيما مع التدرجات من الكثافة. ب ثنائية الصورة الناتجة، التي لا يمكن تمييزها الواضح كبسولات سبب إشارة خلفية عالية. جيم كبسولات عدة لا يمكن اكتشافها. تم الحصول على جميع الصور في 40 x التكبير مع binning 2 × 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: كشف خلية الهيئات. أ حقل مشرقة صورة كبسولة تركزت في المستوى البؤري المفضل. باء أوفيتيكس fluorescence صورة الجسم خلية في المستوى البؤري المفضل. تم الحصول على الصور في 100 x التكبير مع binning 2 × 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تحليلات إجراء مقارنات للنتائج خوارزمية (أسود) والإنسان (رمادي). ألف عندما يتم إعداد الشرائح وفقا للبروتوكول وهي الحصول على صور الأمثل هناك أي اختلاف ملحوظ بين القياسات. ب إذا لم يتبع البروتوكول الخوارزمية لا يمكن بدقة تحديد وقياس كبسولات. هنا تحديداً الخلفية لم يكن متسقا، وهناك لم يكن واضحا التباين بين الخلفية وكبسولات. ويلاحظ وجود تباينات كبيرة حسابها عن طريق اختبار t ك * لقيم P < 0.05. جيم طلب محقق مستقل يتبع البروتوكول وقارن تحليلاتها مع الخوارزمية. هو الحفاظ على موثوقية عبر المراقبين طالما أن الصور يتم الحصول عليها بشكل صحيح. د محقق مستقل ثانية مع مجهر ثانية استخدمت لتأكيد الخوارزمية يحتفظ بدقة عبر الأفراد والأجهزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : إمكانية تطبيق الخوارزمية بديل: تحديد وقياس مجهرية fluorescence. كانت الهيئات الخلية الملون وتصويرها مع أوفيتيكس، ثم حددت بواسطة خوارزمية. تمتد دائرة تم الكشف عنها في الماضي ما يسمى كجدار الخلية لأنه يستند إلى الكشف عن إشارة الأسفار. خوارزمية الكشف يمكن تكييفها للتعرف على وجه التحديد تراكم ألمع إشارة (جدار الخلية) عن طريق تعديل العتبة المستخدمة لتوليد صورة ثنائية الأولى ممثلة في الأرقام 1B و 2B. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplemental Figure 1
تكميلية الشكل 1: لقطة تمثيلية من تطبيق قيد التشغيل في بيئة ويندوز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplemental Figure 2
تكميلية الشكل 2: تمثيلات للكشف عن مهدها الخميرة الخلايا. يمثل الشريط مقياس 10 ميكرون. أ حساب كل من خلية أصل وبرعم كخلايا منفصلة داخل الكبسولة الخاصة بهم. حساب كل من الخلية الأصل أ ب وبرعم مرتين، مجرد كبسولة ومرة واحدة للكبسولة خلية أخرى، أسفر عن أربع خلايا مجموع اكتشاف من أحد الوالدين وبرعم واحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplemental Figure 3
تكميلية الشكل 3: تمثيل البيانات النهائية المقدمة بعد الكشف عن الخلية والقياس. يشير ملف الصورة إلى اسم للصورة الأصلية. مجموع نصف قطر يشير إلى دائرة نصف قطرها دوائر خضراء الممثل والكبسولة وجسم الخلية جنبا إلى جنب. كبسولة x و y كبسولة تشير إلى إحداثيات الكبسولة التي ينطبق عليها هذه البيانات إلى. نصف قطر الجسم يشير إلى دائرة نصف قطرها الدوائر الزرقاء الممثل. دائرة نصف قطرها كبسولة يشير إلى نصف القطر الإجمالي ناقص نصف قطر الجسم، الناتجة في دائرة نصف قطرها من مجرد الكبسولة. ستكون هذه القيم في ميكرون طالما أن المستخدم وشملت نسبة تحويل بكسل إلى ميكرون في خطوة 3.2.5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخطوات الحاسمة لهذا الأسلوب هي إعداد الشريحة الحبر الهند وحيازة صور المجهر. حين تم بنجاح اختبار الخوارزمية مع مجموعة متنوعة من تقنيات الشريحة والصورة هو وصف البروتوكول الموصى بها في هذه المخطوطة. تم الكشف عن الكبسولة السكاريد استناداً إلى استبعاد جزيئات الحبر الهند من المجال الكبسولة كما هذه الجزيئات كبيرة جداً لاختراق الشبكة فيبريل السكاريد. نتائج الاستبعاد الحبر الهند في دائرة مشرقة على رأس خلفية داكنة. الخوارزمية الكشف عن الدوائر يستند جيدا كيف أنها على النقيض مع خلفيتهم. وهكذا، سيؤدي إلى وصمة حبر الهند ثقيلة أعلى النقيض بين كبسولة السكاريد والخلفية، زيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء، وتحسين نوعية النتائج. على العكس من ذلك، يتم الكشف عن خلايا الجسم كدائرة الظلام على رأس خلفية ساطعة. سيتم تغيير الجسم خلية المظهر استناداً إلى المستوى البؤري الذي يتم تعيين المجهر، الظهور كما منتشر غراي دائرة في الأعلى أو أسفل الخلية كعصابة الظلام مكثف في المركز. لنفس الأسباب التي سبق أن ناقشت، ينبغي أن تستخدم المستوى البؤري حيث يظهر نص الخلية كعصابة الظلام، مكثف للحصول على الصور كهذا سيؤدي إلى الكشف عن دائرة الأكثر دقة.

الطريقة التي ذكرت هنا تطورت من خلال العديد من التعديلات وجولات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. وكان الخوارزمية المبرمج يتوقعون أن الخلايا لن يكون أصغر من 4 أو أكبر من 60 بكسل استناداً إلى المجهر الذي تم استخدامه في البداية. لتوسيع نطاق تطبيق هذه الخوارزمية لتكبير مختلفة وأحجام الخلايا بدلاً من ذلك استعيض عن هذه الحدود حقول الإدخال المستخدم المبينة في البروتوكول. يمكن إدخال المستخدمين الآن معلمات محددة لكل تجربة لأقصى قدر من الدقة. إذا كان يتم تطبيق هذه الخوارزمية لحالة خارج القياس بين كبسولة من المستحسن لأول إعداد سلسلة من نطاق إيجاد الظروف لتحديد كيف ينبغي إنشاؤها العينات وتصويرها.

تحديد أهم من هذا الأسلوب أنه يهدف بتطبيق معين في الاعتبار، إلا وهي قياس كبسولة الفطري. في حين أنه يمكن تعديل سهولة لتناسب تطبيقات إضافية، هذا السيناريو فقط تنطبق مباشرة على البروتوكول القياس كبسولة المبينة أعلاه. ومع ذلك، يصف هذا القيد أيضا أهمية هذا الأسلوب فيما يتعلق بهذا المجال والأساليب القائمة. بالإضافة إلى ذلك، مهدها خلايا الخميرة يمكن أن تشكل مشكلة بالنسبة للمحققين الذين يرغبون في قياس الأحجام الخلية الأصل فقط. هذه الخوارزمية قادرة على اكتشاف براعم كخلايا فريدة من نوعها (S2A الشكل). أولاً، وهذا يمكن أن يكون مشكلة إذا كان المحقق في الحالة التي يودون إزالة برعم القياسات، أو إزالة كل الخلايا إذا كان لا يمكن أن يحدد الذي كشف عن دائرة المهد، والتي هي الأصل. ثانيا، وهذا يمكن أن يسبب مشكلة أخرى إذا تم الكشف عن البرعم كهيئة الخلية لا تزال ضمن حدود الكبسولة الأبوية (S2B الشكل) الذي سوف قياس الحالة الخوارزمية برعم إشارة إلى الكبسولة الأبوية. في هذا المثال سوف تحسب كل خلية مرتين لكل جسم الخلية موجود داخل كبسولات اثنين. أي من هذه المشاكل يمكن معالجتها بسهولة بمجرد الانتهاء من البروتوكول. مجموعة البيانات النهائية سوف تظهر كجدول بيانات التي يكتشف فيها كل فرد يسمى خلية طبقاً لملف الصورة من جاء، وعلامة x و y إحداثيات من جسم الخلية (S3 الرقم). يمكن ببساطة العثور على المحققين واستبعاد البيانات التي تطابق في مهدها. على الرغم من الحجم الكبسولة يتم هامة ودراستها بشكل كبير عامل فوعة الميدان بين لم تنشئ البروتوكولات القياسية لاقتناء القياس أو صورة كبسولة. تم تصميم هذه التقنية لملء هذه الأدوار بطريقة دقيقة ومريحة متاحة بحرية للمختبرات مع الحد الأدنى من المتطلبات الأساسية.

التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية إلى حد كبير لتطبيقه على تجارب أخرى. أي صورة على أساس الكشف أو ينبغي أن يكون قياس الأجسام الدائرية أناليزابلي عن طريق هذه الخوارزمية. يمكن تحليل الصور مجهر فلوري بتطبيق الخوارزمية على القنوات الفردية الليزر. عد مستعمرة بكتيرية يمكن أن يتحقق، ومع تعديل إضافية يمكن أن تميز بين الصحفيين اللبن. يمكن أيضا تقييم الخميرة مستعمرة فحوصات النمو باستخدام هذه الخوارزمية لتقدير حجم المنطقة مستعمرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgments

ونود أن نعترف بوين أنتوني الشرائح التي استخدمت كمقارنة جنبا بجنب بشرية ثانية فضلا عن نولان سابرينا الشرائح التي استخدمت كثالث البشرية-جنب والثانية مجهر المقارنة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23, (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4, (7), 019760 (2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76, (2), 508 (1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80, (7), Supplement (P04.007) 007 (2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209, (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7, (1), 29561 (2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3, (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12, (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71, (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
القياس الآلي كبسولة السكاريد الأنواع <em>الفطري</em> وجسم الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter