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Immunology and Infection

Misurazione automatica delle criptococcica capsula polisaccaridica di specie e corpo cellulare

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

Questa tecnica viene descritto un processore di immagine automatica in batch progettato per misurare i raggi di corpo e capsula del polisaccaride. Mentre inizialmente progettato per misurazioni capsule Cryptococcus neoformans , che il processore di immagine automatizzato può essere applicato anche ad altri rilevamento del contrasto basato di oggetti circolari.

Abstract

Lo scopo di questa tecnica è quello di fornire un processo coerenza, preciso e maneggevole per un gran numero di misure di capsula del polisaccaride.

In primo luogo, un'immagine di soglia viene generata in base ai valori di intensità in modo univoco calcolato per ogni immagine. Quindi, cerchi vengono rilevati basato sul contrasto tra oggetto e sfondo utilizzando l'algoritmo di trasformazione di Hough cerchio (CHT) ben consolidata. Infine, rilevato cellulare capsule e corpi sono abbinati secondo le coordinate del centro e la dimensione del raggio, e i dati vengono esportati per l'utente in un foglio di calcolo gestibile.

I vantaggi di questa tecnica sono semplici ma significativi. Primo, perché questi calcoli vengono eseguiti da un algoritmo piuttosto che un essere umano sia di precisione e di affidabilità sono aumentati. Non c'è nessun declino nella precisione o affidabilità indipendentemente da quanti campioni vengono analizzati. In secondo luogo, questo approccio costituisce una potenziale procedura operativa standard per il campo di Cryptococcus invece la situazione attuale, dove la capsula misura varia da laboratorio. In terzo luogo, dato che misure capsule manuali sono lento e monotono, l'automazione consente misure rapide su grandi numeri di cellule di lievito che a sua volta facilita l'elevato throughput dati analisi e statistiche sempre più potenti.

Le limitazioni principali di questa tecnica provengono da come le funzioni di algoritmo. In primo luogo, l'algoritmo genererà solo cerchi. Mentre le cellule Cryptococcus e loro capsule assumono una morfologia circolare, sarebbe difficile applicare questa tecnica al rilevamento di oggetti non circolare. In secondo luogo, a causa di come vengono rilevati cerchi l'algoritmo CHT può rilevare enormi pseudo-cerchi basati sui bordi esterni di parecchi cerchi in cluster. Tuttavia, eventuali corpi cellulari travisati catturati all'interno del pseudo-cerchio di possono essere facilmente rilevati e rimossi dal set di dati risultante.

Questa tecnica è destinata a misurare le capsule di polisaccaride circolare di Cryptococcus specie basato su microscopia del campo luminoso dell'inchiostro di India; anche se potrebbe essere applicato ad altri contrasto base misure oggetto circolare.

Introduction

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Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno trovato ubiquistmente intorno al globo che è associato con la malattia umana soprattutto in popolazioni immunosuppressed. C. neoformans in particolare rappresenta una causa significativa del totale dei decessi annuali nell'Africa subsahariana, a causa di malattie infettive1. La manifestazione clinica principale dell'infezione criptococcica è meningoencefalite, che segue l'invasione del sistema nervoso centrale con i mezzi in macrofagi infetti (Trojan horse maniera) o traversate dirette della barriera sangue - cervello. C. neoformans esprime numerosi fattori di virulenza, compresa la possibilità di replicare a temperatura del corpo umano, attività ureasica, melanizzazione e la formazione di una capsula del polisaccaride2. Capsula del polisaccaride è composto di ripetizione glucuronoxylomannan e polimeri glucoronoxylomannangalactan e funzioni come una barriera protettiva contro fattori come lo stress ambientale e host le risposte immunitarie2.

Sebbene la dimensione della dimensione della capsula del polisaccaride criptococcica non è sempre stata associata con virulenza, c'è prova che è un fattore nella patogenesi2,3,4,5, 6,7. Taglia capsula è associato con la meningite patologia6, possa influenzare la capacità dei macrofagi di controllare Cryptococcus infezione5e può provocare la perdita di virulenza se assenti8. Quindi, capsula dimensione misurazioni sono comuni nella ricerca criptococcica, ma non c'è nessun fieldwide standard per un metodo di misurazione capsula.

Attualmente, c. neoformans polisaccaride capsula misurazione si basa su misurazioni manuali di immagini di microscopia, e i metodi esatti delle acquisizioni di misura e di immagine variano attraverso laboratori9,10, 11. Un immediato interesse per questo metodo è che alcuni studi richiedono l'acquisizione di migliaia di misurazioni individuali, che rende difficile il mantenimento di accuratezza e affidabilità. Inoltre, anche quando i risultati sono pubblicati, c'è spesso insufficiente descrizione del metodo di misurazione. Molte pubblicazioni non spiegano come le loro misure sono state ottenute, che piano focale è stato utilizzato, come hanno determinato la soglia per l'identificazione di capsula, se hanno usato il raggio o il diametro, se hanno utilizzato una misurazione o una media diversi, o altri dettagli. Alcune pubblicazioni solo stato loro metodo come programma che è stato utilizzato, ad esempio, "Adobe Photoshop CS3 è stato usato per misurare le cellule"11. Questa mancanza di standardizzazione e reportistica di dettaglio può fare la riproducibilità difficile se non impossibile. Differenze di vista umana, luminosità computer, impostazioni di microscopio, far scorrere l'illuminazione e altri fattori possono variare non solo tra gli individui, ma anche tra i campioni, considerando che i calcoli basati su rapporti di valori di intensità di pixel rimarrà costanti e applicabile tra i campioni. Questa tecnica è stata generata nel contesto di fornire una tecnica standardizzata, precisa, rapida e semplice per misurare le dimensioni di capsule per un campo in cui non c'era nessuno prima.

Come accennato in precedenza, l'algoritmo CHT è consolidata e gli script per rilevare automaticamente i cerchi sono stati scritti prima. Questo metodo migliora nelle due aree dove altri script sarebbe caduta breve. In primo luogo, rilevare semplicemente cerchi non è sufficiente, perché con le cellule criptococciche due distinti cerchi devono essere rilevate in relazione reciproca. Questo metodo specificamente rileva corpi cellulari all'interno di capsule, discrimina tra i due ed esegue calcoli solo sulle coppie di corpo-capsula pertinenti. In secondo luogo, anche quando seguendo il protocollo stesso, diversi investigatori finirà con diversi acquisito immagini. Consentendo il controllo di investigatore sopra ogni parametro algorithm, questo strumento può essere regolato per soddisfare una vasta gamma di metodi di acquisizione. Non c'è nessuna necessità di un ambito standardizzato, obiettivo, filtro e così via.

Questa tecnica può essere applicata facilmente a qualsiasi situazione in cui lo sperimentatore deve rilevare cerchi all'interno di un'immagine che contrastano con il loro background. Entrambi i cerchi più leggeri e più scuri che può essere rilevato il loro background, contati e misurato utilizzando questa tecnica.

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Protocol

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1. preparazione dell'inchiostro di India Slide

  1. Pipettare 10 µ l di campione criptococcico in una diapositiva. Qualsiasi ceppo di lievito circolare funzionerà, ma per questo esperimento H99 era l'unico sforzo utilizzato.
    Nota: Se il campione è direttamente da terreni di coltura, diluizione 1:2 con PBS o acqua può aiutare a prevenire l'inchiostro di India da aggregazione.
  2. Pipettare 2 µ l di macchia di inchiostro di India sul campione e miscelare fisicamente spingendo la punta della pipetta per il campione e lo spostamento in un movimento circolare fino a quando l'inchiostro di India appare uniformemente distribuita.
  3. Porre un coprivetrino sopra il campione tenendo premuto il bordo sinistro del coprivetrino contro la superficie della diapositiva, quindi delicatamente e uniformemente abbassando il lato opposto del coprivetrino sopra il campione.
  4. Asciugare all'aria per 5 min.
  5. Applicare delicatamente un leggero strato di smalto a bordo del vetrino coprioggetti per formare un sigillo e preservare la macchia di inchiostro di India.

2. imaging diapositiva

  1. Mettere i vetrini in un microscopio a campo luminoso con un accessorio della fotocamera e conversione pixel-per-micron noti. Regolare contrasto, obiettivi e filtri in modo che capsule di cella sono chiari e corpi cellulari sono concentrati, scuri bande.
    Nota: Vari filtri, gli obiettivi e le impostazioni di contrasto funzionerà ma un 20x obiettivo, Ph1 filtro e 2 x 2 binning è raccomandato.
  2. Assicurarsi che il campo visivo è denso ma non sovrappopolata con cellule criptococciche, con netto contrasto tra cella capsula e sfondo e correttamente focalizzato con il corpo della cella visualizzato come una banda scura.
    Nota: Il numero esatto delle cellule per un'immagine ottimale variano a seconda dell'obiettivo utilizzato e campione. Gli aspetti importanti sono affinché le cellule non sono in cluster o sovrapposti, che i piani focali delle cellule non variano significativamente, e che non vi è significativa dell'inchiostro di India macchia chiaramente visibile sullo sfondo (almeno il 25% del campo).
  3. Salvare le immagini in una singola directory con titoli chiari, come l'algoritmo di misurazione verrà eseguito su immagini in un'unica directory e i dati di output saranno organizzati in base ai nomi dei file immagine.

3. algoritmo Setup

  1. Installare la versione di Python 2.7 da
  2. Installare le librerie python aggiuntive eseguendo i comandi "pip installare cuscino" e "pip install openpyxl".
  3. Installare MATLAB seguendo le istruzioni riportate in
  4. Costruire la libreria python MATLAB seguendo le istruzioni fornite alle https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Scaricare i tre file necessari inclusi in materiali di questo manoscritto supplementari ("QCA.py", "Analysis2.m" e "TestRun.m").
    Nota: Questi file possono essere estratti in qualsiasi posizione, ma tutti e tre devono essere nella stessa directory.

4. utilizzo dell'algoritmo

  1. Eseguire l'applicazione facendo doppio clic su QCA.py.
    Nota: L'applicazione potrebbe richiedere alcuni minuti per iniziare. Il file "QCA.py" contiene la struttura del programma che chiama i file di "m" per eseguire l'algoritmo effettivo.
  2. Attenersi alla procedura descritta nel programma.
    1. Input del tipo di estensione dei file di immagine preceduta da un periodo e separati da punti e virgola (ex. ". TIF;. JPEG") quindi fare clic sul pulsante di invio .
    2. Scegliere la directory in cui si trovano i file di immagine facendo clic sul pulsante Seleziona cartella e selezionando la cartella che contiene le immagini.
    3. Generare l'elenco di file di immagine nella directory facendo clic sul pulsante Generate Image List . Le immagini saranno elencate nella casella di testo a destra. Esaminare e verificare che l'elenco è accurato e completo.
    4. Selezionare un'immagine casuale dall'elenco per utilizzare come anteprima facendo clic sul pulsante Seleziona immagine casuale .
      Nota: Se l'immagine è in grado di aprire a causa di un "errore di modalità immagine non corretta", l'algoritmo continuerà a funzionare correttamente nonostante non visualizzazione dell'immagine. Dopo passo 4.2.7, continuerà a visualizzare l'immagine di prova.
    5. Obiettivo del microscopio e binning impostazioni di input. Se le impostazioni predefinite non corrispondono il microscopio utilizzato, selezionare "Custom Pixel conversione" e la conversione pixel-per-um per i file di immagine di input. Una volta selezionato, fare clic sul pulsante di Conversione di calcolare e verificare che la conversione viene corretta secondo la casella di testo sulla destra.
      Nota: Immagini rappresentative, illustrate nella Figura 1 sono state calcolate con 40 x ingrandimento e 2 x 2 binning selezionato.
    6. Inserire i parametri dell'algoritmo per il rilevamento di cerchio.
      1. Il raggio minimo e massimo rilevabile per la rilevazione di capsula esterna come voci di Min e Max capsula Radius in ingresso. Una gamma più ridotta vi permetterà di ottenere risultati più accurati.
      2. Il raggio minimo e massimo rilevabile per il rilevamento del corpo cellulare come voci di Min e Max corpo cellulare Radius in ingresso.
        Nota: Tutti e quattro di queste voci deve essere numeri che rappresentano i rispettivi valori in pixel, secondo le immagini sorgente.
      3. Spostare i cursori di capsula e la sensibilità del corpo cellulare per regolare la soglia di sensibilità dell'algoritmo. Una bassa sensibilità sarà rigorosa e ridurre il rilevamento di falsi positivi cerchio, ma potrebbe anche rilevare meno reale cerchi. Al contrario, un'alta sensibilità aumenterà il tasso di rilevazione, ma può anche provocare falsi positivi cerchi.
        Nota: I risultati rappresentativi sono stati ottenuti con un raggio minimo capsula di 7, raggio massimo capsula di 45, raggio minimo corpo di 4, raggio massimo del corpo di 30, capsula sensibilità di 87 e sensibilità del corpo dell'87.
    7. Verificare i parametri dell'immagine selezionato casualmente facendo clic sul pulsante Esegui Test . I risultati verranno visualizzati in alto al centro del programma, sostituendo l'immagine originale. Se i risultati sono accurati, si consiglia di selezionare un'immagine casuale aggiuntiva per cercare anche di garantire che i parametri selezionati si adattano a tutte le immagini selezionate.
      1. Massimizzare il numero di corpi e capsule rilevati e controllare visivamente se i cerchi sembrano adattarsi correttamente. Il numero di corpi all'interno di capsule rilevati verrà visualizzato nella casella di testo a destra. In caso contrario, modificare i parametri dell'algoritmo fino a quando i risultati sono accurati.
        Nota: La spessa cerchi colorati sono solo per aiutare con visualizzazione. I cerchi effettivi generati per la misura è una curva matematica calcolata dall'algoritmo HCT.
    8. Eseguire l'algoritmo di rilevamento per l'intera directory dei file di immagine facendo clic sul pulsante Analisi di iniziare . Ogni immagine sarà analizzata e il programma visualizzerà "finito" nella casella di testo a destra quando tutte le immagini sono state analizzate.
    9. Fare clic sul pulsante corrispondenza e pulitura . Questo abbinare corpi cellulari rilevati alle capsule rilevati in che risiedono e calcolare il vero raggio capsula sottraendo corpo dalla capsula.
      Nota: Se l'algoritmo viene utilizzato per rilevare la fluorescenza o un'altra situazione in cui un solo cerchio è rilevato questo passaggio è inutile. Invece di scegliere i Corpi solo tirare o il pulsante Solo tirare capsule per raccogliere i dati per solo il blu o solo i cerchi verdi, rispettivamente. È importante notare che se solo il capsula dati viene recuperati il raggio farà riferimento al raggio totale della cella come il raggio del corpo cellulare non potrebbe essere sottratta.
    10. Individuare i dati completati nel file "CleanedOuput.csv" nella directory delle immagini. Se solo un pezzo di dati è stato selezionato, il file sarà marcato "CleanedBodies.csv" o "CleanedCapsules.csv".

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Representative Results

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Immagini in primo luogo sono ottenute mediante microscopia di inchiostro di India diapositive utilizzando un microscopio a campo chiaro accoppiato con una macchina fotografica (Figura 1A). È importante avere cellule separate e nella densità sufficientemente bassa non per sopraffare il campo di vista, anche quanto a utilizzare abbastanza macchia per creare contrasto tra cellule e sfondo. Come indicato nel protocollo, il numero esatto delle cellule per un'immagine ottimale varierà a seconda del campione, microscopio e obiettivo utilizzato. Gli aspetti importanti sono affinché le cellule non sono in cluster o sovrapposti, che i piani focali delle cellule non variano significativamente, e che non vi è significativa dell'inchiostro di India macchia chiaramente visibile sullo sfondo (almeno il 25% del campo). Queste istruzioni consentono l'algoritmo per determinare una soglia unica ad ogni immagine prendendo il valore di intensità di pixel medi ed aggiungendo la deviazione standard. Ogni pixel con un valore di intensità supera a tale soglia viene considerato bianco e qualsiasi con un valore di intensità inferiore è considerato nero. L'immagine risultante consente una distinzione chiara e nitida di dove la capsula finisce (Figura 1B). L'algoritmo ha quindi un cerchio robusto contrasto bianco-nero-su base di rilevare per la capsula e l'immagine originale fornisce un robusto cerchio nero-su-bianco per corpi cellulari. Una visualizzazione di rappresentativi dei cerchi rilevati viene generata come parte del programma (Figura 1C). Questo consente all'utente di rapidamente analizzare attraverso immagini elaborate e verificare i risultati accurati.

È essenziale seguire il protocollo esatto per acquisire immagini ottimali. Immagini sub-ottimali sono generalmente frutto di una mancanza di contrasto tra capsula e inchiostro (Figura 2A). Parametri ottimali di contrasto e acquisizione varierà basato sul campione, esperimento, fotocamera e microscopio modelli, ecc. Un'immagine ottimale è uno dove le cellule di lievito sono separate e se possibile, dove il bordo esterno della capsula ha un chiaro contrasto alla macchia dell'inchiostro di India, e dove il corpo cellulare è focalizzato ad per apparire come una banda scura che contrasta fortemente con lo sfondo. Se troppe cellule sono nel campo di vista o se la macchia è troppo chiara, i valori di intensità di pixel verranno configurati in cluster e il programma non sarà in grado di stabilire una soglia capace di delucidamento taglia capsula (Figura 2B). Quando vengono utilizzate immagini sub-ottimale il programma può rilevare i cerchi di dimensioni errate, non essere in grado di rilevare qualsiasi cerchi o rilevare più pseudo-cerchi basati su artefatti nell'immagine soglia (Figura 2C).

Rilevamento di corpi cellulari pone un problema simile in quanto il corpo della cella deve essere visualizzato come un robusto cerchio nero sul fondo bianco della capsula. Questo problema è risolto nel protocollo quando si descrive il piano focale desiderato per acquisizione di immagini. Il piano focale migliore da utilizzare è uno in cui il corpo della cella viene visualizzato come una banda scura, concentrata (Figura 3A). Questo piano focale è accettabile come standard perché si concentra correttamente la cella. Ciò è stata confermata dalla visualizzazione della parete cellulare con Uvitex, una macchia di chitina (Figura 3B). Il Uvitex macchia mostra chiaramente un croccante, focalizzata parete cellulare con segnale debole al centro (dove la parte superiore e inferiore del corpo cellulare sarebbe essere macchiati, fuori fuoco).

Nello sviluppo di questo metodo era anche importante confermare che questo algoritmo potrebbe determinare con precisione le misure di capsula e corpo cellulare. Mentre i cerchi rappresentante nelle figure precedenti sono promettenti, le misurazioni effettive sono state confrontate fra computer e misure umane. Quando il protocollo è seguito con precisione e si ottengono immagini ottimali, l'algoritmo è preciso e affidabile (Figura 4A). Tuttavia, se il protocollo è seguito in modo non corretto e immagini non ottimali si ottengono a causa della scarsa colorazione, sovraffollamento o altri parametri menzionati in precedenza, l'algoritmo perde precisione e non può ricapitolare misure umane (Figura 4B ). Poiché questa tecnica è stato originariamente sviluppata per un individuo specifico (primo autore), una diversa è stato chiesto di utilizzarlo per determinare se le differenze tra gli stili di macchiatura e misura interesserebbe precisione nonostante il seguente protocollo. I risultati hanno mostrato che questa tecnica è stata ampiamente applicabile fintanto che il protocollo è stato seguito come indicato (Figura 4C). Allo stesso modo, questa tecnica può essere utilizzata con qualsiasi microscopio in grado di acquisire immagini di contrasto di fase dei vetrini preparati di inchiostro di India. Affinché che l'algoritmo rimane preciso con altre configurazioni di microscopio che questo esperimento è stato ripetuto da un terzo investigatore usando un microscopio a campo luminoso diverso accoppiato con una macchina fotografica e rispetto rilevati diametri capsula con capsula manualmente misurato diametri. Nessuna differenza significativa è stata osservata fra computer e misure umane (Figura 4D).

Infine, le applicazioni future di questo algoritmo sono state esplorate nel contesto di macchiatura di fluorescenza. Poiché l'imaging di fluorescenza è ancora basato sul segnale per rapporti di rumore di valori di intensità di pixel l'algoritmo dovrebbe essere facilmente applicabile a immagini di fluorescenza fino a quando la macchia è circolare nella natura. Questa applicazione è stata confermata quando l'algoritmo è stato in grado di rilevare correttamente che Uvitex macchiato corpi cellulari dalle immagini precedentemente descritte (Figura 5A, 5B). Gli utenti dovrebbero essere attenti ottimizzare i parametri dell'algoritmo per il loro esperimento e protocolli standardizzati dovrebbero essere sviluppati in futuro per le nuove applicazioni.

Figure 1
Figura 1 : Risultati rappresentativi di un'immagine ottenuta in modo ottimale. R. l'immagine iniziale acquisita da microscopia del campo luminoso di una diapositiva di inchiostro di India. B. l'immagine binaria creato utilizzando una soglia calcolata sul valore di intensità di pixel medi aggiunto per la deviazione standard. Tutti i valori sopra questa soglia sono considerati bianco e tutti i sotto nero. C. una visualizzazione delle capsule (verde) e corpi cellulari (blu) rilevati dall'algoritmo. Tutte le immagini sono state ottenute a 40 ingrandimenti con 2 x 2 binning. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Risultati rappresentativi di un'immagine in modo sub-ottimale ottenuta. R. la diapositiva iniziale di inchiostro di India acquistata tramite microscopia luminosa del campo. Irregolare e inadeguata risultati in uno sfondo particolarmente brillante con sfumature di intensità di colorazione. B. la risultante immagine binaria, in cui capsule non possono essere chiaramente distinti a causa di segnale di alta priorità bassa. C. diverse capsule sono rilevabili. Tutte le immagini sono state ottenute a 40 ingrandimenti con 2 x 2 binning. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: rilevamento corpi cellulari. R. campo luminoso immagine della capsula centrato al comodo piano focale. B. Uvitex immagine di fluorescenza del corpo delle cellule presso il comodo piano focale. Le immagini furono ottenute a 100 ingrandimenti con 2 x 2 binning. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: analisi di confronti di risultati per algoritmo (nero) e umane (grigio). R. quando scivoli sono preparati secondo protocollo e immagini ottimali si ottengono non c'è nessuna differenza apprezzabile tra le misurazioni. B. se il protocollo non è seguito l'algoritmo non può identificare accuratamente e misurare le capsule. Qui in particolare lo sfondo non era coerenza e ci non era chiaro contrasto tra capsule e sfondo. È notato variazioni significative calcolate tramite test t * per valori di P < 0.05. C. un investigatore indipendente è stato chiesto di seguire il protocollo e confrontare le analisi con l'algoritmo. Affidabilità è mantenuto attraverso osservatori, purché le immagini sono acquisite correttamente. D. di Un secondo investigatore indipendente con un microscopio secondo era utilizzato per confermare che l'algoritmo mantiene la precisione tra gli individui e l'hardware,. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Una potenziale applicazione alternativa dell'algoritmo: identificazione e misurazione di microscopia di fluorescenza. Corpi cellulari erano macchiati e imaged con Uvitex, poi identificati dall'algoritmo. Il cerchio rilevato si estende oltre quello che sarebbe essere etichettato come la parete cellulare perché il rilevamento è basato sul segnale di fluorescenza. L'algoritmo di rilevamento possa essere personalizzato per identificare specificamente l'accumulazione più brillante del segnale (la parete cellulare) modificando la soglia utilizzata per generare l'immagine binaria iniziale rappresentato nelle figure 1B e 2B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplemental Figure 1
Supplementare figura 1: un rappresentante screenshot dell'applicazione in esecuzione in un ambiente Windows. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplemental Figure 2
Supplementare nella figura 2: rappresentazioni di rilevati in erba cellule di lievito. Barra della scala rappresenta 10 µm. A. Una cellula madre e bud ogni contato come celle separate all'interno la propria capsula. B. cella a padre e bud ogni contato due volte, una volta per loro capsula e una volta per la capsula di altre cellule, con conseguente quattro celle totale rilevato da un genitore e un germoglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplemental Figure 3
Supplementare nella figura 3: una rappresentazione dei dati finali forniti dopo la cella rilevazione e misurazione. File di immagine si riferisce al nome dell'immagine originale. Raggio totale si intende il raggio dei cerchi verdi rappresentante, capsula e corpo cellulare combinati. Capsula x e y di capsula si riferiscono le coordinate della capsula per cui questi dati si riferisce. Raggio del corpo si riferisce al raggio dei cerchi blu rappresentante. Raggio di capsula si riferisce al raggio totale meno il raggio del corpo, con conseguente nel raggio di appena la capsula. Questi valori saranno in micron fino a quando l'utente incluso un rapporto di conversione pixel-per-micron al punto 3.2.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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I punti critici di questa tecnica sono preparando la diapositiva di inchiostro di India e acquisendo le immagini del microscopio. Mentre l'algoritmo è stato testato con successo con una varietà di tecniche di diapositiva e immagine il protocollo raccomandato è descritto in questo manoscritto. Capsula del polisaccaride viene rilevata basato sull'esclusione delle particelle di inchiostro di India dal dominio della capsula come queste particelle sono troppo grandi per penetrare la rete di fibrille di polisaccaride. L'esclusione dell'inchiostro di India risulta in un cerchio luminoso su uno sfondo scuro. L'algoritmo rileva cerchi basati su quanto bene essi contrastano con il loro background. Così, una macchia di inchiostro di India pesante si tradurrà in maggiore contrasto tra capsula polisaccaridica e sfondo, aumentando il rapporto segnale-rumore e migliorare la qualità dei risultati. Al contrario, il corpo cellulare viene rilevato come un cerchio scuro su uno sfondo luminoso. Il corpo cellulare cambierà aspetto basato su quale piano focale del microscopio è impostato su, apparendo come un diffuso grigio cerchio nella parte superiore o inferiore della cella e come una condensato fascia scura al centro. Per le stesse ragioni già discusse, il piano focale, dove il corpo della cella viene visualizzato come una band condensata, scura da utilizzarsi per acquisizione di immagini, come questo si tradurrà nella rilevazione cerchio più accurata.

Il metodo segnalato qui ha progredito attraverso diverse modifiche e turni di risoluzione dei problemi. L'algoritmo è stato inizialmente codificato in attesa che le cellule non sarebbe più piccole di 4 o maggiore di 60 pixel basato sul microscopio utilizzato. Espandere l'applicazione di questo algoritmo a diversi ingrandimenti e formati delle cellule, che questi limiti sono stati invece sostituiti dai campi di input utente descritti nel protocollo. Gli utenti possono ora input i parametri specifici per ogni esperimento per la massima accuratezza. Se questo algoritmo viene applicato a una situazione di fuori della capsula misura Cryptococcus si consiglia deve innanzitutto impostare una serie di condizioni per individuare l'intervallo per determinare come campioni dovrebbero essere generati e stampati.

La limitazione più significativa di questa tecnica è che è stato progettato con un'applicazione specifica in mente, vale a dire la misura della capsula da criptococco. Mentre può essere facilmente modificato per adattare le applicazioni aggiuntive, questo scritto è solo direttamente applicabile per il protocollo di misurazione capsula sopra indicato. Tuttavia, questa limitazione viene inoltre descritto il significato di questo metodo rispetto al suo campo e per i metodi esistenti. Inoltre, in erba cellule di lievito possono presentare un problema per i ricercatori che desiderano solo misurare dimensioni cella padre. Questo algoritmo è in grado di rilevare i germogli come uniche cellule (Figura S2A). In primo luogo, questo può essere un problema se lo sperimentatore in qual caso vorrebbero rimuovere misure bud o rimuovere entrambe le celle se non può essere determinato che rilevato cerchio è la gemma che è il padre. In secondo luogo, ciò può causare un altro problema se la gemma viene rilevata come un corpo cellulare ancora entro i confini della capsula parentale (Figura S2B) nel quale caso l'algoritmo misurerà il germoglio in riferimento la capsula parentale. In questo esempio ogni cella verrà conteggiato due volte perché ogni corpo cellulare risiede all'interno di due capsule. Uno di questi problemi possono essere risolti facilmente una volta terminato il protocollo. Il set di dati finale apparirà come un foglio di calcolo dove ogni individuo rilevato cellulare è etichettato secondo il file di immagine è venuto da e la x e y coordinate del corpo delle cellule (Figura S3). Gli investigatori possono semplicemente trovare ed escludere i dati che corrisponde sul nascere. Nonostante le dimensioni capsula essendo un importante e fortemente studiato fattore di virulenza che il campo Cryptococcus deve ancora stabilire protocolli standard per l'acquisizione di misurazione o immagine capsula. Questa tecnica era progettata per ricoprire questi ruoli in modo accurato e conveniente liberamente a disposizione di laboratori con i prerequisiti minimi.

Future applicazioni di questa tecnica sono in gran parte per applicarlo ad altri esperimenti. Qualsiasi immagine base di rilevamento o la misura di oggetti circolare dovrebbe essere analizzabile attraverso questo algoritmo. Immagini di microscopia fluorescente possono essere analizzati applicando l'algoritmo ai canali laser individuale. Colonia batterica conteggio può essere raggiunto e con ulteriori modifiche poteva distinguere fra i reporter di galattosio. Saggi di crescita di lievito Colonia potrebbero essere valutati anche mediante questo algoritmo per stimare la dimensione della zona di Colonia.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Anthony Bowen cui vetrini sono stati utilizzati come un secondo confronto side-by-side umano così come Sabrina Nolan cui vetrini sono stati utilizzati come un terzo umano side-by-side e un secondo microscopio confronto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23, (4), 525-530 (2009).
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Misurazione automatica delle <em>criptococcica</em> capsula polisaccaridica di specie e corpo cellulare
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Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

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