Summary

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

Published: January 11, 2018
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Summary

この手法では、多糖類のカプセルと体の半径を測定するために設計された自動バッチ イメージ プロセッサについて説明します。クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスカプセル測定用にデザインしながらの自動画像処理プロセッサは円形オブジェクトの他の基づいて、コントラスト検出にも適用できます。

Abstract

このテクニックの目的は、多数多糖類カプセル測定の一貫性のある、正確、かつ管理可能なプロセスを提供することです。

まず、一意に各イメージの計算された強度値に基づくしきい値のイメージが生成されます。その後、円は、オブジェクトと老舗サークル Hough 変換 (CHT) アルゴリズムを使用して背景のコントラストに基づいて検出されます。最後に、検出された細胞カプセルとボディ中心座標と半径のサイズと一致し、データが管理可能なスプレッドシートのユーザーにエクスポートします。

この手法の利点は、シンプルだが重要なです。最初に、これらの計算は人間ではなく、アルゴリズムによって実行されるので精度と信頼性を向上します。 正確性や信頼性に関係なく、どのように多くのサンプルは、分析の減少はありません。第 2 に、このアプローチは、クリプトコッカスフィールド カプセル測定がラボによって現在の状況ではなく潜在的な標準操作手順を確立します。第三に、手動カプセル測定されますがゆっくりと単調なため、オートメーションは高スループット データ解析およびますます強力な統計を円滑に多数の酵母細胞の迅速な測定ができます。

この技術の主要な制限方法から来るアルゴリズム関数。まず、アルゴリズムだけ円が生成されます。クリプトコッカス細胞と彼らのカプセルで円形の形態にかかる、非円形オブジェクトを検出するこの手法を適用することは困難でしょう。第二に、円を検出する方法のため、CHT アルゴリズムはクラスター化されたいくつかの円の外側のエッジに基づく巨大な擬似円を検出できます。ただし、擬似サークル内でキャッチすべての誤って細胞体簡単に検出できその結果のデータ セットから削除されます。

この手法は、インドのインク明視野顕微鏡に基づくクリプトコッカス属円形多糖類のカプセルを測定用適用される可能性が他のコントラストは円形オブジェクトの測定を用いた。

Introduction

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス免疫抑制の人口に主にひと疾患に関連付けられている世界中で普遍的見つける病原性酵母です。クリプトコッカスは、特に感染症1のためのサハラ以南アフリカで合計年間死亡の重要な原因を占めています。クリプトコッカス感染症の主な臨床症状は髄膜脳炎は、感染させた大食細胞 (トロイの木馬方法) の輸送によって中枢神経系の侵略に続くまたは血液-脳関門の直接交差。クリプトコッカスは、人間の体温、ウレアーゼ活性、メラニン化、多糖類カプセル2の形成で複製する機能を含むいくつかの病原因子を表しています。多糖類のカプセルは、環境ストレス、ホスト免疫反応2等に対する防護壁として glucuronoxylomannan と glucoronoxylomannangalactan ポリマーおよび関数を繰り返しので構成されます。

クリプトコッカス多糖類カプセルのサイズが一貫して関連付けられていない病原性、病態2,3,45の要因であることの証拠があります。 6,7。カプセル サイズ髄膜炎病理学6に関連付けられて、クリプトコッカス感染症5を制御するマクロファージの機能に影響を与えることができます、8不在の場合の病原性の低下を招きます。したがって、クリプトコッカスの研究では、一般的なカプセルのサイズ測定がカプセル測定方法の標準的な fieldwide はありません。

現在、クリプトコッカス多糖類のカプセル測定、顕微鏡画像の手動測定に基づいており、画像と計測の両方の買収の正確なメソッドは、研究所9,10、間で異なります 11。このメソッドの当面の関心事は、いくつかの研究では、精度と信頼性の維持を困難にする個々 の測定の何千もの取得を必要とします。さらに、結果を公開するときにもしばしばある測定法の不十分な説明。多くの出版物は彼らの測定値が得られた方法を説明しないかどうか、彼らは 1 つの測定を使用またはいくつか、または他の平均、半径または直径が使用されるかどうか、彼らはカプセルの識別のためのしきい値を決定する方法は、どのような焦点平面が使用されました。詳細。いくつかの出版物だけの状態プログラムとしての法を用い, 例えば、「Adobe Photoshop CS3 使用されたセルを測定する「11。標準化およびレポートの詳細のこの欠乏、再現困難不可能ではない場合。人間の視力、コンピューターの明るさ、顕微鏡設定の違いは、照明、スライドおよび他の要因は、ピクセルの明度の値の比率に基づいて計算は一定になりますが、個人間だけでなく、サンプル、間変わることができるとサンプルとの間に適用されます。この手法は、カプセルの前にどれもなかったフィールドのサイズを測定する標準化された、正確、迅速、簡単な手法を提供することのコンテキストで生成されました。

前述したように、CHT アルゴリズムは, 老舗し、サークルを自動的に検出するスクリプトは、前に書かれています。このメソッドは、他のスクリプトの短い秋、2 つの分野で向上します。まず、円を検出するだけ十分ではない、クリプトコッカス細胞 2 つの明瞭な円は互いに関連して検出する必要がありますので。このメソッドは具体的にカプセル内の細胞体を検出し、両者の差別、関連体カプセル ペアでのみ計算を実行します。第二に、でもときに続いて同じプロトコル、別の捜査官で終る異なる画像を取得しました。捜査官すべてアルゴリズム パラメーター制御を許可すると、このツールは、取得方法の広い範囲を一致するように調整できます。標準化されたスコープ、目的、フィルターの必要はありません。

この手法は、調査官がその背景とは対照的イメージ内の円の検出する必要がありますどのような状況に容易に適用できます。両方円軽量化とその背景を検出できるより暗くカウント、およびこの手法を用いて測定します。

Protocol

1. インドのインク スライドの準備 スライドにクリプトコッカス サンプルの 10 μ L をピペットします。すべての円形の酵母が動作しますが、この実験のため H99 は使用される唯一のひずみ。注: 文化メディアから直接サンプルの場合は、1:2 PBS または水で希釈すること防ぐことができますインドのインク群生します。 2 μ L のサンプル上にインドのインク汚れをピペットし、?…

Representative Results

画像は、カメラ (図 1A) と相まって明るいフィールド顕微鏡を使用してインドのインク スライドの顕微鏡観察によって得られる最初。細胞分離とセルと背景のコントラストを作成する十分な汚れを使用して、ビューのフィールドを同様負荷をかけないように十分に低密度を持つことが重要です。プロトコルで述べたように、最適な画…

Discussion

この手法の重要なステップはインドのインク スライドを準備、顕微鏡画像を取得します。さまざまなスライドと画像技術が正常にテストされてアルゴリズム間の推奨プロトコルはこの原稿で説明されます。これらの粒子が大きすぎて多糖類の線維ネットワークに侵入すると、カプセルのドメインからインドのインク粒子の排除に基づく多糖類カプセルが検出されました。インドのインク除外…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

そのスライドが第三人間サイド バイ サイドと 2 番目の顕微鏡比較として使われたサブリナ ノーランと同様、スライドの 2 番目の人間サイド ・ バイ ・ サイド比較として使われていたアンソニー ・ ボーエンを認識したいと思います。

Materials

India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22×22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

References

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Cite This Article
Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

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