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Immunology and Infection

Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

이 기술은 다 당 류 캡슐 몸과 반지름을 측정 하도록 설계 되어 자동된 배치 이미지 프로세서를 설명 합니다. 처음 Cryptococcus neoformans 캡슐 측정을 위해 설계 자동된 이미지 프로세서는 원형 개체의 다른 기반으로 하는 대비 검출에도 적용할 수 있습니다.

Abstract

이 기술의 목적은 많은 수의 다 당 류 캡슐 측정에 대 한 일관 된, 정확한, 및 관리 프로세스를 제공 하입니다.

첫째, 임계값 이미지 강도 값 고유 각 이미지에 대 한 계산에 따라 생성 됩니다. 그런 다음 원형 개체와 확고 원 Hough 변환 (CHT) 알고리즘을 사용 하 여 백그라운드에 따라 검색 됩니다. 마지막으로, 검색 된 셀 캡슐과 시체 중심 좌표와 반지름 크기, 일치 하 고 데이터 관리 스프레드시트에서 사용자에 게 보내집니다.

이 기법의 장점은 간단 하지만 중요 한입니다. 첫 번째, 이러한 계산 인간 보다는 알고리즘에 의해 수행 되기 때문에 정확성과 신뢰성 증가 된다. 정확성이 나 신뢰성 얼마나 많은 샘플 분석에 아무 하락이 있다. 둘째,이 이렇게 캡슐 측정 연구소에 의해 다릅니다 현재 상황 대신 Cryptococcus 필드에 대 한 잠재적인 표준 운영 절차를 설정 합니다. 셋째, 주어진 있다는 수동 캡슐 측정 느리고 단조, 자동화에 차례로 점점 강력한 통계 및 높은 처리량 데이터 분석을 용이 하 게 하는 효 모 세포의 큰 숫자에 빠른 측정 수 있습니다.

이 기술의 주요 제한 방법에서 온 알고리즘 기능. 첫째, 알고리즘 서클 생성할 것 이다. 동안 Cryptococcus 세포와 그들의 캡슐에 원형 형태, 비 원형 물체 감지에이 기술을 적용할 것은 어려울 것 이다. 둘째, 서클 감지는 어떻게 인해 CHT 알고리즘 여러 클러스터 된 서클의 바깥쪽 가장자리에 따라 거 대 한 의사 원을 검색할 수 있습니다. 그러나, 의사 원 안에 잡힌 안하고 셀 시체 수 있습니다 쉽게 감지 되며 결과 데이터 집합에서 제거.

이 기술은 인도 잉크 밝은 분야 현미경 검사 법;에 따라 Cryptococcus 종의 원형 다 당 류 캡슐을 측정 하기 위한 의미 그것은에 적용 될 수 있지만 다른 대비 원형 개체 측정을 기반으로 합니다.

Introduction

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Cryptococcus neoformans immunosuppressed 인구에서 주로 인간의 질병와 관련 된 전세계 편 발견 병원 성 효 모 이다. C. neoformans 전염병1인 사하라 총 연간 사망자의 중요 한 원인이 가장 주목할만 하 게 차지 한다. Cryptococcal 감염의 주요 임상 징후는 감염 된 대 식 세포 (트로이 목마 방법)에 전송 하 여 중앙 신경 시스템의 침공을 다음과 같이 meningoencephalitis 또는 혈액-뇌 장벽에의 직접 교차점. C. neoformans 는 인체 온도, urease 활동, melanization, 및 다 당 류 캡슐2의 형성에서 복제 하는 기능을 포함 한 몇 가지 독성 요소를 표현 한다. 다 당 류 캡슐 glucuronoxylomannan와 glucoronoxylomannangalactan 고분자와 기능 호스트 면역 반응2등 환경 스트레스 요인에 대 한 보호벽으로 반복 구성 됩니다.

Cryptococcal 다 당 류 캡슐 크기의 크기 일관 되 게 연관 되지 않은 독성과, 비록 증거가 병 인2,3,,45에 있는 요인 다는 것 6,7. 캡슐 크기 염 병 리6와 연결, 제어 Cryptococcus 감염5, 하 대 식 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다 이며 독성의 손실8결 석 하는 경우 발생할 수 있습니다. 따라서, 캡슐 크기 측정은 일반적인 cryptococcal 연구, 하지만 아무 fieldwide 캡슐 측정 하는 방법에 대 한 표준.

현재, C. neoformans 다 당 류 캡슐 측정 현미경 이미지, 수동 측정에 기반 하 고 실험실9,10, 마다 이미지 및 측정 취득의 정확한 방법 11. 이 방법에는 즉시 관심사는 일부 연구 요구 정확도 신뢰성 유지를 어렵게 만드는 개별 측정의 수천의 수집 이다. 또한, 결과 게시 하는 경우에 종종 있다 측정 방법의 부적당 한 설명. 많은 출판물 어떻게 그들의 측정 가져온, 설명 하지 어떤 초점 비행기 사용 되었다, 그들은 한 측정을 사용 하거나 몇 가지, 또는 다른 평균 반지름 또는 지름, 사용 여부를 어떻게 그들은 캡슐 식별에 대 한 임계값을 결정 세부 사항입니다. 일부 출판물만 상태는 프로그램으로 그들의 방법 사용 되었다, 예를 들어, "어도비 포토샵 c s 3의 사용 된 셀 측정 하"11. 재현성 어려울 수 있습니다 표준화 및 정보 보고의이 부족이 불가능 한 경우. 인간의 시력, 컴퓨터 밝기, 현미경 설정 차이 슬라이드 조명, 및 다른 요인 뿐만 아니라 개인 간의 하지만 샘플, 사이 계산 픽셀 강도 값의 비율에 따라 일정 하 게 유지 됩니다 반면 변화할 수 있다 고 샘플 사이의 적용 가능 합니다. 이 기술은 없는 없음 전에 필드에 대 한 캡슐 크기를 측정 하는 표준화, 신속, 정확 하 고 간단한 기술 제공의 맥락에서 생성 되었습니다.

앞에서 설명한 대로 CHT 알고리즘은 오래 된, 그리고 스크립트를 자동으로 검색 하는 원 전에 작성 되었습니다. 이 메서드는 어디 다른 스크립트 짧은을 것 이라고 하는 두 가지 영역에서 향상 됩니다. 첫째, 단순히 서클 감지 충분 하지 않습니다, cryptococcal 세포와 두 가지 동그라미 서로 관하여 감지 해야 하기 때문에. 이 방법은 특히 감지 캡슐 내에서 셀 시체, 둘 사이 차별 하 고 관련 몸 캡슐 쌍에 대해서만 계산을 수행. 둘째, 심지어 때 동일한 프로토콜, 다른 수 사관 다음으로 끝날 것 이다 다른 이미지 획득. 탐정 제어할 모든 알고리즘 매개 변수를 함으로써,이 도구는 수집 방법의 광범위 한 범위에 맞게 조정할 수 있습니다. 표준화 범위, 목표, 필터, 그리고에 대 한 필요가 있다.

이 기술은 이미지 내 원 그들의 배경과 그 명암을 감지 하는 탐정 필요 어떤 상황 든 지에 쉽게 적용할 수 있습니다. 두 원 가볍고 어두운 그들의 백그라운드 검출 될 수 있다, 보다,이 기술을 사용 하 여 측정.

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Protocol

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1입니다. 인도 잉크 슬라이드의 준비

  1. 슬라이드에 cryptococcal 샘플의 10 µ L 플라스틱 모든 원형 효 모 스트레인 작동 하지만이 실험에 대 한 H99 사용 유일한 스트레인.
    참고: 샘플 문화 미디어에서 직접 경우 PBS 또는 물과 1:2 희석 방지할 수 있습니다 인도 잉크 clumping에서.
  2. 샘플에 인도 잉크 얼룩의 2 µ L 플라스틱 하 고 물리적으로 샘플을 피 펫 팁을 밀고 하 인도 잉크 균등 하 게 분산 때까지 원운동에서 이동 하 여 혼합.
  3. 배치 하는 coverslip 샘플 다음 부드럽게 그리고 균일 하 게 낮추는 coverslip의 반대편 샘플 슬라이드의 표면에 대해 coverslip의 왼쪽된 가장자리를 눌러.
  4. 5 분 동안 건조 공기를 허용 합니다.
  5. 부드럽게 하는 물개를 형성 하 고 인도 잉크 얼룩 보존 coverslip 국경 매니큐어의 가벼운 레이어를 적용.

2. 이미지 슬라이드

  1. 카메라 부착 및 알려진된 픽셀 미크론 변환 밝은 분야 현미경에 슬라이드를 배치 합니다. 셀 캡슐은 명확 하 고 셀 몸은 초점, 어두운 밴드 필터, 목표, 및 대비를 조정 합니다.
    참고: 다양 한 필터, 목표, 및 대비 설정을 작동 하지만 목표, Ph1 필터, 2 x 2 비 닝 x 20는 것이 좋습니다.
  2. 보기의 필드는 하지만 하지 cryptococcal 세포로, 세포 캡슐과 배경, 사이 명확한 대조와 overpopulated 조밀 하 고 어두운 밴드 시각 셀 시체와 함께 제대로 초점을 확인 합니다.
    참고: 최적의 이미지에 대 한 셀의 정확한 수는 샘플 및 사용 목적에 따라 달라 집니다. 셀 클러스터 또는 중복 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 한 측면은, 셀 초점 비행기 크게 다양 하지 않습니다 그리고 그 중요 한 인도 잉크 얼룩 배경 (필드의 적어도 25%)에서 명확 하 게 볼 수 있습니다.
  3. 으로 측정 알고리즘 단일 디렉토리에 이미지에서 실행 되 고 출력 데이터는 이미지 파일의 이름에 따라 구성 됩니다 분명 제목, 단일 디렉터리에 이미지를 저장 합니다.

3. 알고리즘 설정

  1. Python 버전 2.7을 설치
  2. "핍 설치 베개" 명령을 실행 하 여 추가 파이썬 라이브러리를 설치 하 고 "핍 설치 openpyxl".
  3. MATLAB에서 지침에 따라 설치
  4. 빌드 https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html에서 제공 하는 지침에 따라 MATLAB 파이썬 라이브러리.
  5. 이 원고 보충 자료 ("QCA.py", "Analysis2.m", 및 "TestRun.m")에 포함 된 세 가지 필요한 파일을 다운로드 합니다.
    참고:이 파일은 어떤 위치에 추출 될 수 있다 하지만 모든 3 동일한 디렉터리에 있어야 합니다.

4입니다. 알고리즘의 사용

  1. QCA.py를 두 번 클릭 하 여 응용 프로그램을 실행 합니다.
    참고: 응용 프로그램 시작 하려면 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. "QCA.py" 파일 ".m" 파일 실제 알고리즘 실행을 호출 하는 프로그램 구조를 포함 되어 있습니다.
  2. 프로그램에 설명 된 단계를 따릅니다.
    1. 이미지 파일의 확장 형식 앞에 마침표와 세미콜론으로 구분 된 입력 (예. ". TIF;입니다. jpeg") 다음 클릭 버튼을 입력 합니다.
    2. 디렉터리 선택 단추를 클릭 하 고 이미지를 포함 하는 폴더를 선택 하 여 이미지 파일이 있는 디렉터리를 선택 하십시오.
    3. 이미지 목록 생성 버튼을 클릭 하 여 디렉터리에서 이미지 파일의 목록을 생성 합니다. 이미지는 오른쪽에 텍스트 상자에 나열 됩니다. 검토 하 고 목록을 정확 하 고 완전 한 확인 하십시오.
    4. 무작위 이미지 선택 버튼을 클릭 하 여 미리 보기를 사용 하 고 목록에서 임의의 이미지를 선택 합니다.
      참고: 이미지를 "잘못 된 이미지 모드 오류" 열 수 없는 경우 알고리즘은 여전히 제대로 작동 하지 이미지를 표시 하는도 불구 하. 4.2.7 단계 후 테스트 이미지는 여전히 표시 됩니다.
    5. 현미경 목적과 binning 설정을 입력 합니다. 기본 설정이 일치 하지 않는 경우 사용 하는 현미경 "사용자 정의 픽셀 변환"을 선택 하 고 이미지 파일에 대 한 픽셀을 음 변환 입력. 일단 선택, 계산 변환 버튼을 클릭 하 고 오른쪽에 텍스트 상자에 올바른 변환을 확인 하십시오.
      참고: 그림 1 에 표시 된 대표 이미지 확대와 2 x 2 비 닝 선택 x 40로 계산 했다.
    6. 서클 검색 알고리즘 매개 변수를 입력 합니다.
      1. Min과 Max 캡슐 반경 항목으로 외부 캡슐 탐지에 대 한 감지 최소 및 최대 반지름을 입력 합니다. 작은 범위에는 더 정확한 결과 얻을 수 있게 됩니다.
      2. 최소 및 최대 셀 바디 반경 항목으로 세포 체 감지 감지 최소 및 최대 반지름을 입력 합니다.
        참고: 이러한 항목의 모든 4 소스 이미지에 따라 그들의 각각 값을 픽셀 단위로 표현 하는 숫자 이어야 합니다.
      3. 알고리즘의 감도 임계값 조정 캡슐 및 셀 바디 감도 슬라이더를 이동 합니다. 낮은 감도 엄격한 될 것입니다 고 거짓 긍정적인 원 탐지 줄어들지만 적은 진짜 서클을 검색할 수 있습니다. 반대로, 높은 감도 검색 속도 증가 하지만 거짓 긍정적인 원형에서 또한 발생할 수 있습니다.
        참고: 대표적인 결과 최소 캡슐 반경 7, 45의 최대 캡슐 반지름, 최소 몸 반경 4, 30의 최대 몸 반지름, 87, 캡슐 감도 및 87의 바디 감도 얻은 했다.
    7. 테스트 실행 버튼을 클릭 하 여 무작위로 선택 된 이미지에 매개 변수를 테스트 합니다. 결과 원본 이미지를 대체 하는 프로그램의 위 중심에 표시 됩니다. 결과 정확한 경우에, 또한 선택 된 파라미터 모든 선택 된 이미지에 맞는 보장 하려고 추가 임의 이미지를 선택 하는 것이 좋습니다.
      1. 기관 및 감지 하는 캡슐의 수를 최대화 하 고 시각적으로 동그라미 제대로 맞게 표시 여부 검사. 감지 하는 캡슐 내에서 시체의 수 오른쪽에 텍스트 상자에 표시 됩니다. 그렇지 않으면, 결과 정확한 될 때까지 알고리즘 매개 변수를 조작 합니다.
        참고: 두꺼운 색된 동그라미는 시각화 도움에. 측정에 대 한 생성 하는 실제 원 HCT 알고리즘에 의해 계산 하는 수학 곡선입니다.
    8. 분석 시작 단추를 클릭 하 여 이미지 파일의 전체 디렉터리에 감지 알고리즘을 실행 합니다. 각 이미지 분석 될 것 이다 고 프로그램 표시 됩니다 "완료" 오른쪽 텍스트 상자에 모든 이미지를 분석 하는 경우.
    9. 일치 및 정리 단추를 클릭 합니다. 일치 하는 검색 된 캡슐에, 감지 셀 시체와 진정한 캡슐 반경 캡슐에서 몸을 빼서 계산 됩니다.
      참고: 경우 형광을 검출 하는 알고리즘 사용 되 고 또는 다른 상황이 하나의 원형은 감지이 단계 필요 하지 않습니다. 대신 당겨 시체 또는 당겨 캡슐 버튼 각각만 파란색 이나 녹색 원만에 대 한 데이터를 수집 하려면 클릭 합니다. 그것은 그 캡슐 데이터를 검색 하는 경우에 반지름 됩니다 참조 셀의 총 반경 세포 체의 반경 수 없습니다 뺄 때 주의 하는 것이 중요.
    10. 이미지 디렉토리에 "CleanedOuput.csv" 파일에 완성 된 데이터를 찾습니다. 데이터의 원피스를 선택 하는 경우에 "CleanedBodies.csv" 또는 "CleanedCapsules.csv" 파일이 표시 됩니다.

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Representative Results

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카메라(그림 1)과 함께 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 인도 잉크 슬라이드의 현미경 사용 이미지를 먼저 얻을 수 있습니다. 세포 분리 및 세포와 배경 사이 대조를 만들 충분 한 얼룩을 사용 또한 보기의 필드를 압도 하지 충분히 낮은 밀도를 중요 하다. 프로토콜에서 설명 했 듯이, 최적의 이미지에 대 한 셀의 정확한 수 샘플, 현미경, 사용 목적에 따라 달라 집니다. 셀 클러스터 또는 중복 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 한 측면은, 셀 초점 비행기 크게 다양 하지 않습니다 그리고 그 중요 한 인도 잉크 얼룩 배경 (필드의 적어도 25%)에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이러한 방향 평균 픽셀 휘도 값과 표준 편차를 추가 하 여 각 이미지에 고유한 임계값을 결정 하는 알고리즘을 수 있습니다. 강도 값이 말했다 임계값 보다 높은 모든 픽셀은 흰색 간주 됩니다 및 낮은 강도 값을 가진 모든 검은 간주 됩니다. 결과 이미지는 캡슐 끝나는 (그림 1B)의 명확 하 고 선명한 구별 수 있습니다. 알고리즘 다음 캡슐에 대 한 검색을 기반으로 하는 강력한 화이트에 블랙 대비 원 있으며 원본 이미지 셀 시체에 대 한 강력한 흑백에 동그라미를 제공 합니다. 검색 된 서클의 대표적인 시각화 (그림 1C) 프로그램의 일환으로 생성 됩니다. 신속 하 게 처리 된 이미지를 통해 구문 분석 하 고 결과 표시 정확한 사용자 수 있습니다.

최적의 이미지 정확한 프로토콜을 따르는 것이 필수적입니다. 최적의 이미지는 보통 캡슐와 잉크 (그림 2A)의 부족에서 결과. 대비 및 수집 최적의 샘플, 실험, 카메라와 현미경 모델, 등등에 따라 달라 집니다. 최적의 이미지 어디 효 모 세포 분리 가능한 경우, 캡슐의 외부 가장자리는 명확한 대조 인도 잉크 얼룩과 세포 체 배경와 예리하게 대조 한 어두운 밴드를 초점을 맞추고 하나입니다. 너무 많은 셀 보기의 필드에는 또는 얼룩은 너무 가벼운 화소 강도 값은 클러스터 고 프로그램 elucidating 캡슐 크기 (그림 2B)의 임계값을 설정할 수 없습니다. 최적의 이미지를 사용 하는 경우 프로그램 수 잘못 된 크기의 동그라미를 감지, 하지 어떤 서클을 검색할 수 또는 감지 임계값 이미지 (그림 2C)에 유물에 따라 여러 개의 의사 동그라미.

셀 시체를 감지 셀 바디 캡슐의 흰색 바탕에 강력한 검은 원형으로 시각화 해야 한다는 점에서 비슷한 문제가 포즈지 않습니다. 이 문제는 이미지 수집에 대 한 원하는 초점 비행기를 설명 하는 프로토콜에 해결 됩니다. 사용 하 여 최고의 초점 평면 세포 체 어두운, 집중 악대 (그림 3A)로 표시 하나입니다. 이 초점 비행기는 제대로 셀을 초점을 맞추고 있기 때문에 표준으로 받아들일 수 있습니다. 이 시각화 하는 Uvitex, 틴 얼룩 (그림 3B)와 세포 벽에 의해 확인 되었다. Uvitex (어디 위아래 세포 체의 것이 얼룩이 질, 초점) 센터에서 약한 신호를 가진 세포 벽에 초점을 맞춘 얼룩 명확 하 게 보여준다는 파 삭 파 삭.

그것은 또한 확인 하는 것이 중요이 방법 개발이 알고리즘 정확 하 게 캡슐 및 세포 체 측정을 결정할 수 있었다. 이전 그림에서 대표 원 유망한 동안, 실제 측정 컴퓨터와 인간의 측정 사이 비교 되었다. 알고리즘은 정확 하 고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 정확 하 게 뒤에 때 최적의 이미지를 얻을 수 있습니다(그림 4). 그러나, 프로토콜 올바르게 다음 차선의 이미지 가난한 얼룩과 밀, 또는 다른 설명한 매개 변수 얻을 수 있습니다, 알고리즘 정확도 잃는다 고 인간의 측정 (그림 4B 정리 수 없습니다. ). 이 기술은 원래 특정 개인에 대 한 개발 된 이후 (첫 번째 저자), 다른 개인 얼룩 및 측정 스타일 간의 차이점 다음 프로토콜에도 불구 하 고 정확도 영향을 줄 경우 결정 하 게 되었다. 결과으로 프로토콜 설명된 (그림 4C)로 그 뒤를 이었다이 기술은 광범위 하 게 적용 했다 보여주었다. 마찬가지로,이 기술은 모든 현미경 단계 준비 인도 잉크 슬라이드 이미지 수 있는 사용할 수 있습니다. 알고리즘이이 실험 3 반복 되었다 다른 현미경 설정을 정확 하 게 유지 하려면 탐정 다른 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 카메라와 함께 결합 하 고 수동으로 측정된 캡슐과 감지 된 캡슐 직경 비교 직경입니다. 컴퓨터와 인간의 측정 (그림 4D) 사이의 중요 한 차이가 관찰 되었다.

마지막으로,이 알고리즘의 미래 응용 프로그램 형광 염색 법의 맥락에서 탐구 했다. 형광 이미징은 여전히 픽셀 강도 값의 잡음 비율에 신호에 기반을 얼룩은 자연에서 원형으로 알고리즘 형광 이미지에 즉시 적용 해야 합니다. 이 응용 프로그램 알고리즘 Uvitex 스테인드 셀 시체 앞에서 설명한 이미지 (그림 55B)에서 성공적으로 감지 수 있었다 확인 했다. 사용자가 그들의 실험에 대 한 알고리즘 매개 변수를 최적화 하기 위해 주의 해야 하 고 미래에 어떤 새로운 응용 프로그램에 대 한 표준화 된 프로토콜을 개발 한다.

Figure 1
그림 1 : 최적의 얻은 이미지의 대표적인 결과. A. 초기 이미지는 인도 잉크 슬라이드의 밝은 분야 현미경 검사 법에 의해 인수. B. 임계값을 사용 하 여 만든 바이너리 이미지 표준 편차에 추가 평균 강도 값에서 계산 됩니다. 모든 값이이 임계값 이상 백색 이라고 여겨진다 고 아래 모든 검정을 간주 됩니다. C. 캡슐 (녹색) 및 셀 시체 (블루) 알고리즘에 의해 감지의 시각화. 모든 이미지는 2 x 2 비 닝으로 40 배 확대에서 얻은 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 하위 최적으로 얻은 이미지의 대표적인 결과. A. 밝은 분야 현미경 검사 법을 통해 인수 초기 인도 잉크 슬라이드. 특히 밝은 배경에 그라디언트 강도의 결과 고르지 및 부적당 한 얼룩. B. 결과 바이너리 이미지, 없는 캡슐 수 없습니다 명확 하 게 구분 높은 배경 신호 때문. C. 여러 캡슐 감지 되지 않습니다. 모든 이미지는 2 x 2 비 닝으로 40 배 확대에서 얻은 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 검색 셀 시체. A. 기본 초점면에서 중심으로 캡슐의 밝은 필드 이미지. B. 기본 초점면에서 세포 체의 형광 이미지를 Uvitex. 이미지는 2 x 2 비 닝으로 100 배 확대에서 얻은 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 알고리즘 (블랙)과 인간 (회색)에 대 한 결과의 비교 분석. A. 감지할 수 차이 측정은 프로토콜에 따라 슬라이드를 준비 하 고 최적의 이미지를 얻을 수 있습니다. B. 프로토콜을 준수 하지 않으면 알고리즘 및 수 없습니다 정확 하 게 식별 캡슐을 측정. 여기 특별히 배경 일치 되지 않았습니다 그리고 캡슐과 배경 사이 대조를 분명 하지 했다. T-검정을 통해 계산 하는 중요 한 변이로 지적 * P 값 0.05 < 대 한. C. 독립적인 조사 프로토콜을 따르고 그들의 분석 알고리즘을 비교 하도록 요청 했다. 이미지는 제대로 취득으로 신뢰성 관측에서 유지 됩니다. 두 번째 현미경으로 두 번째 독립 조사는 개인 및 하드웨어 정확도 유지 하는 알고리즘을 확인 하 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 알고리즘의 잠재적인 대체 응용 프로그램: 식별 및 형광 현미경 검사 법의 측정. 셀 시체 스테인드 및 Uvitex와 몇 군데 다음 알고리즘으로 식별. 검색 된 원 탐지 형광 신호에 기반 하기 때문에 어떤 세포 벽으로 분류 될 것 이라고 과거 확장 합니다. 검색 알고리즘 그림 1B 2B에 나타나는 초기 이진 이미지를 생성 하는 데 사용 하는 임계값을 수정 하 여 특별히 똑똑한 축적 신호 (세포 벽)의 식별에 맞출 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Supplemental Figure 1
보충 그림 1: Windows 환경에서 실행 되는 응용 프로그램의 대표적인 화면 캡처. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Supplemental Figure 2
보충 그림 2: 검색 된 신진의 효 모 세포. 눈금 막대를 나타냅니다 10 µ m. a. 부모 셀 및 꽃 봉 오리는 각 그들의 자신의 캡슐 내에서 별도 셀으로 계산. B. A 부모 셀 버드 각 계산, 두 번 자신의 캡슐 및 다른 셀 캡슐에 대 한 한 번, 하나의 부모와 한 꽃 봉 오리에서 인식 4 총 셀에 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Supplemental Figure 3
보충 그림 3: 셀 검출 및 측정 후 제공 하는 최종 데이터의 표현. 이미지 파일은 원본 이미지의 이름을 가리킵니다. 총 반경 대표적인 녹색 원, 캡슐 및 결합 하는 세포 체의 반지름을 말합니다. 캡슐 x 및 캡슐 y는이 데이터에 적용 하는 캡슐의 좌표를 참조 하십시오. 바디 반경 대표 파란색 동그라미의 반지름을 말합니다. 캡슐 반경 그냥 캡슐의 반경에 따른 신체 반경 마이너스 총 반지름을 말합니다. 이 값으로 사용자 단계 3.2.5에서에서 미크론에 픽셀 변환 비율을 포함 미크론에 있을 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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이 기술의 중요 한 단계는 인도 잉크 슬라이드를 준비 하 고 현미경 이미지를 획득. 알고리즘의 다양 한 슬라이드와 이미지 기술 성공적으로 테스트 되었습니다 동안 권장된 프로토콜이이 원고에 설명 되어 있습니다. 다 당 류 캡슐이이 입자는 너무 커서 다 당 류 fibril 네트워크 침투 캡슐의 도메인에서 인도 잉크 입자의 배제에 기반으로 감지 됩니다. 인도 잉크 제외 어두운 배경 위에 밝은 원 발생합니다. 알고리즘 서클 얼마나 잘 그들은 그들의 배경과 대조에 따라 검색 합니다. 따라서, 다 당 류 캡슐과 배경, 신호 대 잡음 비율을 증가 하 고 결과 품질 향상 간의 높은 대비 무거운 인도 잉크 얼룩 발생 합니다. 반대로, 세포 체는 밝은 배경 위에 어두운 원형으로 감지 됩니다. 세포 체는 현미경으로, 설정 되어 있는 초점면 확산으로 나타나는 원 상단에 회색 또는 셀의 아래쪽으로 센터에서 압축 된 어두운 밴드를 기반으로 모양이 변경 됩니다. 가장 정확한 원 감지에 발생이 같은 이유로 이미 논의 세포 체 압축, 어두운 악대로 나타나는 초점면 이미지 수집을 위해 사용 해야 합니다.

여기에 보고 하는 메서드는 몇 가지 수정 및 문제 해결의 라운드를 통해 점진 했다. 알고리즘 처음 셀 4 보다 작은 될 것 이라고 기대 하 고 코딩 되었거나 사용 된 현미경에 따라 60 픽셀 보다 큰 합니다. 다른 배율 및 셀 크기가이 제한 대신 프로토콜에서 설명 하는 사용자 입력된 필드에 의해 대체 되었다이 알고리즘의 응용 프로그램을 확장 합니다. 사용자가 최대 정확도 대 한 각 실험 매개 변수 입력 이제 수 있습니다. 이 알고리즘 Cryptococcus 캡슐 측정 외부 상황에 적용 될 경우 어떻게 샘플 생성 해야 하 고 몇 군데를 결정 하기 위해 일련의 조건을 찾는 범위를 첫 번째 집합에 좋습니다.

이 기법의 가장 중요 한 제한이 이다 마음, 즉 cryptococcal 캡슐의 측정에에서는 특정 응용 프로그램으로 설계 되었습니다. 그것은 추가 응용 프로그램에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다, 하는 동안이 스크립트만 위에서 설명한 캡슐 측정 프로토콜에 직접 적용 됩니다. 그러나,이 한계는 또한 그것의 분야에 대해 기존의 방법에이 방법의 중요성을 설명합니다. 또한, 신진 효 모 세포만 부모 셀 크기를 측정 하고자 수 사관에 대 한 문제를 제시할 수 있습니다. 이 알고리즘은 독특한 세포 (그림 S2A)로 싹을 감지 가능 하다. 첫째, 버드 측정, 제거 하거나 두 셀 수 없는 경우 제거 하려는 것이 경우는 원형은 새싹 발견 결정와 탐정 부모인 경우 문제가 될 수 있다이. 둘째,이 여전히 경계 내에 있는 경우 알고리즘 부모의 캡슐에 관하여 새싹을 측정할 것 이다 부모의 캡슐 (그림 S2B)의 셀 시체로 발견 되 면 또 다른 문제를 일으킬 수 있습니다. 이 예제에서 두 번 있기 때문에 각 셀 몸 두 캡슐 내에 있는 각 셀 집계 됩니다. 이러한 문제 중 하나로 해결할 수 있습니다 쉽게 프로토콜 완료 되 면. 마지막 데이터 집합 각 개별 셀에서 온 이미지 파일 및 x 표시 됩니다 감지 하는 있는 스프레드시트로 표시 됩니다, 세포 체 (그림 S3)의 y 좌표. 수 사관 수 단순히 찾을 하 고 꽃 봉 오리와 일치 하는 데이터를 제외 합니다. 캡슐 크기에도 불구 하 고 중요 한 되 고 무 겁 게 Cryptococcus 필드 아직 캡슐 측정 또는 이미지 수집을 위한 표준 프로토콜을 설정 하는 독성 요소를 공부 했습니다. 이 기술은 최소한의 필수 구성 요소와 실험실을 자유롭게 사용할 수 있는 정확 하 고 편리한 방식으로이 역할을 채우기 위해 설계 되었습니다.

이 기술의 미래 응용 프로그램은 주로 다른 실험에 적용. 모든 이미지 기반 탐지 또는 원형 개체의 측정은이 알고리즘을 통해 analyzable 이어야 한다. 형광 현미경 이미지 개별 레이저 채널에 알고리즘을 적용 하 여 분석할 수 있습니다. 달성 될 수 있다 세균성 식민지 세 고 추가 수정 갈 락 토스 기자 사이 구별할 수 있는. 효 모 식민지 성장 분석 실험 수 또한 식민지 영역 크기를 예측 하려면이 알고리즘을 사용 하 여 평가할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

우리는 누구의 슬라이드 두 번째 인간의 측면-의해-측면 비교로 서 사용 된 안토니 보 웬 사 브리 나 놀란 그 슬라이드 3 인간의 측면-의해-측면 및 두 번째 현미경 비교로 사용 했다 인정 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

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References

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<em>Cryptococcal</em> 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정
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Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

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