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Immunology and Infection

Medición automatizada de la cápsula de polisacárido de Cryptococcus especies y cuerpo de la célula

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

Esta técnica describe un procesador de imágenes por lotes automatizado diseñado para medir radios de cuerpo y cápsula de polisacárido. Si bien inicialmente diseñado para las mediciones cápsulas Cryptococcus neoformans , que el procesador de imagen automatizado puede aplicarse también a otros detección de contraste basado de objetos circulares.

Abstract

El propósito de esta técnica es proporcionar un proceso manejable, preciso y consistente de un gran número de mediciones de cápsula de polisacárido.

En primer lugar, se genera una imagen de umbral basado en valores de intensidad única calculados para cada imagen. Entonces, círculos son detectados basados en el contraste entre el objeto y el fondo usando el algoritmo de transformación de Hough de círculo (CHT) bien establecido. Finalmente, las cápsulas detectado células y órganos se corresponden según el centro de coordenadas y el tamaño de radio, y los datos se exportan al usuario en una hoja de cálculo manejable.

Las ventajas de esta técnica son simples pero significativos. Primero, porque estos cálculos son realizados por un algoritmo en lugar de un humano se aumentan la precisión y fiabilidad. No hay ninguna disminución de la exactitud o confiabilidad independientemente de cuántas muestras se analizan. En segundo lugar, este enfoque establece un potencial procedimiento de funcionamiento estándar para el campo de Cryptococcus en lugar de la situación actual donde medida cápsula varía según el laboratorio. En tercer lugar, dado que las mediciones cápsulas manual lento y monótono, automatización permite realizar mediciones rápidas en gran número de células de levadura que a su vez facilita el análisis de datos de alto rendimiento y estadísticas cada vez más potentes.

Las principales limitaciones de esta técnica provienen de cómo las funciones del algoritmo. En primer lugar, el algoritmo generará sólo círculos. Mientras que las células de Cryptococcus y sus cápsulas en una morfología circular, sería difícil aplicar esta técnica para detección de objetos no circular. En segundo lugar, debido a cómo se detectan los círculos el algoritmo CHT puede detectar enormes círculos pseudo basados en los bordes exteriores de varios círculos agrupados. Sin embargo, cualquier tergiversados cuerpos celulares dentro del círculo pseudo fácilmente detectados y eliminados de los conjuntos de datos resultantes.

Esta técnica se significa para medir las cápsulas circular polisacárido de Cryptococcus especie basado en microscopía de campo brillante de tinta de la India; Aunque se podría aplicar a otros contraste realiza las mediciones del objeto circular.

Introduction

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Cryptococcus neoformans es una levadura patógena encontrada ubicuo alrededor del mundo que se asocia a enfermedad humana, sobre todo en las poblaciones de inmunodeprimidos. C. neoformans en particular representa una causa significativa del total de muertes anual en el África subsahariana debido a enfermedades infecciosas1. La principal manifestación clínica de la infección cryptococcal es meningoencefalitis, que sigue la invasión del sistema nervioso central por transporte en macrófagos infectados (forma de caballo de Troya) o cruce directo de la barrera blood - brain. C. neoformans expresa varios factores de virulencia, incluyendo la capacidad de replicar en la temperatura del cuerpo humano, actividad de la ureasa, melanization y formación de una cápsula de polisacárido2. La cápsula de polisacárido se compone de glucuronoxylomannan y polímeros glucoronoxylomannangalactan y funciones de repetición como una barrera protectora contra factores de estrés ambiental como anfitrión inmunorespuestas2.

Aunque el tamaño del tamaño de la cápsula de polisacárido de Cryptococcus no siempre se ha asociado con virulencia, hay evidencia de que es un factor en la patogenesia2,3,4,5, 6,7. Tamaño de la cápsula se asocia a meningitis patología6puede afectar la capacidad del macrófago para control de infección por Cryptococcus 5y puede resultar en la pérdida de virulencia si ausente8. Por lo tanto, las mediciones de tamaño de la cápsula son comunes en la investigación de Cryptococcus, pero no hay fieldwide estándar para un método de medición de cápsulas.

Actualmente, C. neoformans polisacárido cápsula medición se basa en mediciones manuales de imágenes de microscopia y los métodos exactos de imagen y medición adquisiciones varían de laboratorios9,10, 11. Una preocupación inmediata para este método es que algunos estudios requieren la adquisición de miles de mediciones individuales, lo que dificulta mantener precisión y fiabilidad. Además, incluso cuando los resultados se publican, a menudo hay insuficiente Descripción de los métodos de medición. Muchas publicaciones no explican cómo obtuvieron sus mediciones, qué plano focal fue utilizado, cómo determina el umbral para la identificación de la cápsula, si usaron radio o diámetro, si se utiliza una medición o un promedio de varios, o de otro detalles. Algunas publicaciones sólo estado su método como programa que se utilizó, por ejemplo, "Adobe Photoshop CS3 se utilizó para medir las células"11. Esta falta de estandarización y presentación de informes detalle puede hacer reproducibilidad difícil si no imposible. Diferencias en la vista humana, brillo de la computadora, configuración del microscopio, deslice la iluminación y otros factores pueden variar no sólo entre individuos sino entre las muestras, mientras que cálculos basados en relaciones de los valores de intensidad del píxel permanece constantes y aplicable entre muestras. Esta técnica fue generada en el contexto de proporcionar una técnica estandarizada, precisa, rápida y simple para medir tamaños de cápsulas para un campo en el que hubo antes.

Como se mencionó anteriormente, el algoritmo de la CHT es larga, y se han escrito scripts para que detecte automáticamente círculos antes. Este método mejora en dos áreas donde otros scripts le quedan cortos. En primer lugar, detectar simplemente círculos no es suficiente, porque con las células de Cryptococcus deben detectarse dos círculos distintos en relación con cada uno otro. Este método específicamente detecta cuerpos celulares dentro de cápsulas, discrimina entre los dos y realiza cálculos sólo en los correspondientes pares de cápsula de cuerpo. En segundo lugar, incluso cuando siguiendo el mismo protocolo, diferentes investigadores acabará con diferentes adquirió imágenes. Permitiendo el control del investigador sobre cada parámetro del algoritmo, esta herramienta se puede ajustar para que coincida con una amplia gama de métodos de adquisición. No hay necesidad para un alcance estándar, objetivo, filtro y así sucesivamente.

Esta técnica se puede aplicar fácilmente a cualquier situación en la que el investigador necesita detectar círculos dentro de una imagen que contrasta con su fondo. Ambos círculos más claros y más oscuros que su fondo puede ser detectada, contados y medidos con esta técnica.

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Protocol

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1. preparación de portaobjetos de tinta de la India

  1. Pipetear 10 μl de muestra cryptococcal en un portaobjetos. Cualquier cepa de levadura circular funcionará pero para este experimento H99 era la única tensión que utiliza.
    Nota: Si la muestra es directamente en medios de cultivo, diluir 1:2 con PBS o agua puede ayudar a evitar que la tinta de la India de agrupar.
  2. Pipetear 2 μl de mancha de tinta de la India sobre la muestra y mezclar físicamente empujando la punta de la pipeta a la muestra y moviéndose en un movimiento circular hasta que la tinta de la India aparece distribuido uniformemente.
  3. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra, mantenga el borde izquierdo del cubreobjetos sobre la superficie de la diapositiva, entonces suavemente y uniformemente bajando el lado opuesto del cubreobjetos sobre la muestra.
  4. Seque el portaobjetos al aire durante 5 minutos.
  5. Aplique suavemente una ligera capa de esmalte de uñas a frontera de cubreobjetos para formar un sello y preservar la mancha de tinta de la India.

2. proyección de imagen de diapositiva

  1. Coloque los portaobjetos en un microscopio de campo brillante con un accesorio de cámara y conversión de píxeles a micrón conocido. Ajustar contraste, filtros y objetivos lo que cell cápsulas son claros y cuerpos celulares son bandas concentrados, oscuros.
    Nota: Varios filtros objetivos y ajustes de contraste funcionará pero se recomienda una de 20 x objetivo, filtro Ph1, 2 x 2 binning.
  2. Asegúrese de que el campo de visión es denso pero no superpoblado con las células de Cryptococcus, con contraste claro entre la cápsula de la célula y el fondo y bien centrada con el cuerpo de la célula visualizado como una banda oscura.
    Nota: El número exacto de las células para una imagen óptima variará dependiendo de la muestra y el objetivo se utiliza. Los aspectos importantes para las células no son agrupados o superpuestos, que los planos focales de células no varían significativamente, y que hay tinta India significativa manchan visible en el fondo (al menos el 25% del campo).
  3. Guardar imágenes en un solo directorio con títulos claros, como el algoritmo de medición se ejecutará en imágenes en un solo directorio y los datos de salida se organizarán según los nombres de los archivos de imagen.

3. algoritmo configuración

  1. Instala Python versión 2.7 de
  2. Instalar librerías adicionales python ejecutando los comandos "pip install pillow" y "pip install openpyxl".
  3. Instalar MATLAB, siguiendo las instrucciones en
  4. Construir la biblioteca de python MATLAB, siguiendo las instrucciones en https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Descargar los tres archivos necesarios incluidos en materiales suplementarios de este manuscrito ("QCA.py", "Analysis2.m" y "TestRun.m").
    Nota: Estos archivos se pueden extraer a cualquier lugar, pero los tres deben estar en el mismo directorio.

4. el uso del algoritmo de

  1. Ejecute la aplicación haciendo doble clic en QCA.py.
    Nota: La aplicación puede tardar varios minutos para empezar. El archivo "QCA.py" contiene la estructura de programa que se llama los archivos ". m" para ejecutar el algoritmo real.
  2. Siga los pasos descritos en el programa.
    1. Entrada del tipo de extensión de los archivos de imagen precedida por un período y separados por punto y coma (ex. ". TIF;. JPEG") luego haga clic en el botón Enter .
    2. Elegir el directorio en el que se encuentran los archivos de imagen haciendo clic en el botón Seleccionar directorio y selecciona la carpeta que contiene las imágenes.
    3. Generar la lista de archivos de imagen en el directorio haciendo clic en el botón Generar lista de imágenes . Las imágenes se mostrará en el cuadro de texto a la derecha. Revisar y asegurar que la lista sea precisa y completa.
    4. Seleccione una imagen al azar de la lista para usar como una vista previa haciendo clic en el botón Seleccionar imagen al azar .
      Nota: Si la imagen es incapaz de abrir debido a un "error de modo de imagen incorrecta", el algoritmo todavía funcionará correctamente a pesar de no mostrar la imagen. Después paso 4.2.7, todavía se mostrará la imagen de prueba.
    5. Objetivo de microscopio y binning configuración de entrada. Si la configuración por defecto no coinciden con el microscopio, seleccione "Custom conversión de píxeles" y pixel-a-um la conversión para los archivos de imagen de entrada. Una vez seleccionado, haga clic en el botón de Conversión calcular y garantizar que la conversión es correcta según el cuadro de texto a la derecha.
      Nota: Imágenes representativas, que se muestra en la figura 1 se calculan con 40 aumentos y 2 x 2 binning seleccionado.
    6. Entrada de parámetros de algoritmo para la detección del círculo.
      1. De entrada el radio mínimo y máximo detectable para la detección de cápsula externa como las entradas de Min y Max cápsula de radio. Una gama más pequeña le permitirá obtener resultados más precisos.
      2. El radio mínimo y máximo detectable para la detección del cuerpo de la célula como las entradas de Min y Max cuerpo celular radio de entrada.
        Nota: Los cuatro de estas entradas deben ser números representando a sus respectivos valores en píxeles, de acuerdo a las imágenes de fuente.
      3. Mueve los deslizadores de la cápsula y la sensibilidad del cuerpo de la célula para ajustar el umbral de sensibilidad del algoritmo. Una sensibilidad baja será estricta y detección del círculo positivo falso, pero también puede detectar menos círculos reales. Por el contrario, una alta sensibilidad aumentará la tasa de detección, pero también puede resultar en falsos positivos círculos.
        Nota: Se obtuvieron resultados representativos con un radio mínimo de la cápsula de 7 radio cápsula máximo de 45, radio cuerpo mínimo de 4, radio cuerpo máximo de 30, cápsula sensibilidad de 87 y la sensibilidad del cuerpo de 87.
    7. Comprobar los parámetros de la imagen seleccionada al azar haciendo clic en el botón de Prueba funcionamiento . Los resultados se mostrarán en el centro superior del programa de sustitución de la imagen original. Si los resultados mira precisos, se recomienda para elegir una imagen aleatoria adicional para así intentar asegurar que los parámetros seleccionados caben todas las imágenes seleccionadas.
      1. Maximizar el número de cuerpos y cápsulas detectan y visualmente si los círculos parecen encajar correctamente. El número de organismos dentro de cápsulas detectados se mostrarán en el cuadro de texto a la derecha. Manipular los parámetros del algoritmo hasta que los resultados son exactos.
        Nota: Los círculos de colores gruesos son sólo para visualización. Los círculos reales generados para la medición es una curva matemática calculada por el algoritmo HCT.
    8. Ejecutar el algoritmo de detección en todo el directorio de archivos de imagen haciendo clic en el botón Iniciar análisis . Se analizará cada imagen y el programa mostrará "terminar" en el cuadro de texto a la derecha cuando se han analizado todas las imágenes.
    9. Haga clic en el botón Match y limpieza . Esto coincidirá con detectado cuerpos de la célula a las cápsulas detectados residen en y calcular el radio cápsula verdadera restando el cuerpo de la cápsula.
      Nota: Si el algoritmo se utiliza para detectar la fluorescencia u otra situación en la que es solamente un círculo detecta este paso es innecesario. En su lugar haga clic en Sólo tirar cuerpos o las Cápsulas sólo tire para recoger los datos de sólo el azul o sólo los círculos verdes, respectivamente. Es importante tener en cuenta que si sólo se recuperan los datos cápsulas el radio se refiere al radio total de la célula como el radio del cuerpo de la célula no podría restar.
    10. Localizar los datos completados en el archivo "CleanedOuput.csv" en el directorio de imágenes. Si sólo se selecciona un dato, el archivo será marcado "CleanedBodies.csv" o "CleanedCapsules.csv".

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Representative Results

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Primero se obtienen las imágenes por microscopia de diapositivas, tinta de la India utilizando un microscopio de campo brillante, juntado con una cámara (figura 1A). Es importante que las células separadas y en la densidad suficientemente baja no para abrumar el campo de visión, así como utilizar suficiente mancha para crear contraste entre las células y el fondo. Como se indica en el protocolo, el número exacto de las células para una imagen óptima variará dependiendo de la muestra, el microscopio y el objetivo se utiliza. Los aspectos importantes para las células no son agrupados o superpuestos, que los planos focales de células no varían significativamente, y que hay tinta India significativa manchan visible en el fondo (al menos el 25% del campo). Estas instrucciones permiten que el algoritmo determinar un umbral único a cada imagen tomando el valor de intensidad medio píxel y agregando la desviación estándar. Un píxel con un valor de intensidad superior a dicho umbral se considera blanco y cualquiera con un valor de intensidad menor se considera negro. La imagen resultante permite una distinción clara y nítida de donde la cápsula extremos (figura 1B). El algoritmo entonces tiene un contraste de blanco sobre negro robusto basado para la detección de la cápsula y la imagen original proporciona un sólido círculo negro sobre blanco para cuerpos de la célula. Se genera una visualización representativa de los círculos detectados como parte del programa (figura 1C). Esto permite al usuario analizar a través de imágenes procesadas y asegurar que los resultados aparecen precisos rápidamente.

Es esencial seguir el protocolo exacto para adquirir imágenes óptimas. Imágenes óptimos generalmente resultan de una falta de contraste entre la cápsula y la tinta (figura 2A). Parámetros óptimos de contraste y adquisición variará basado en muestras, modelos de experimento, la cámara y el microscopio, etcetera. Una imagen óptima es uno donde las células de levadura están separadas si es posible, donde el borde exterior de la cápsula tiene claro contraste a la mancha de tinta de la India, y donde el cuerpo celular está enfocado para aparecer como una banda oscura que contrasta agudamente con su fondo. Si muchas células se encuentran en el campo de visión, o si la mancha es demasiado ligera, se agrupan los valores de intensidad del píxel y el programa no será capaz de establecer un umbral capaz de dilucidar el tamaño de la cápsula (figura 2B). Cuando se utilizan imágenes óptimos el programa puede detectar círculos de tamaños incorrectos, no ser capaz de detectar cualquier círculos o detectar múltiples círculos pseudo basados en artefactos en la imagen de umbral (figura 2C).

Detección de cuerpos celulares plantea un problema similar en que el cuerpo de la célula debe visualizarse como un círculo negro sólido en el fondo blanco de la cápsula. Este problema se aborda en el protocolo al describir el plano focal deseado para la adquisición de la imagen. El mejor plano focal a utilizar es uno en que el cuerpo de la célula aparece como una banda oscura, concentrada (figura 3A). Este plano focal es aceptable como estándar porque se enfoca correctamente la celda. Esto fue confirmado por visualización de la pared celular con Uvitex, una mancha de quitina (figura 3B). El Uvitex mancha muestra claramente un nítido, enfocado a pared celular con señal débil en el centro (donde la parte superior e inferior del cuerpo de la célula teñirse, fuera de foco).

En el desarrollo de este método también es importante confirmar que este algoritmo podría determinar con exactitud las medidas de la cápsula y el cuerpo de la célula. Mientras que los círculos representativos en las figuras anteriores son alentadores, las medidas reales se compararon entre ordenador y medidas humanas. Cuando el protocolo es seguido con precisión y se obtienen imágenes óptimas, el algoritmo es exacto y confiable (figura 4A). Sin embargo, si el protocolo se sigue correctamente y se obtienen imágenes subóptimas debido a pobre coloración, hacinamiento u otros parámetros anteriormente mencionados, el algoritmo pierde precisión y no puede recapitular las mediciones humanas (figura 4B ). Puesto que esta técnica fue desarrollada originalmente para un individuo específico (primer autor), un individuo diferente se le preguntó a utilizar para determinar si las diferencias entre estilos de coloración y a la medida afectaría a exactitud a pesar del siguiente protocolo. Los resultados mostraron que esta técnica fue ampliamente aplicable siempre y cuando el protocolo fue seguido como instrucciones (figura 4C). Del mismo modo, esta técnica puede utilizarse con cualquier microscopio capaz de adquirir imágenes de contraste de fase las muestras preparadas de tinta de la India. Para garantizar el algoritmo exacto con otras configuraciones de microscopio que este experimento fue repetido por un tercer investigador utilizando un microscopio de campo claro diferentes junto con una cámara y en comparación con diámetros cápsulas detectados con cápsula de medición manualmente diámetros. Ninguna diferencia significativa se observó entre computadoras y humanas medidas (figura 4D).

Finalmente, futuras aplicaciones de este algoritmo fueron exploradas en el contexto de tinción de fluorescencia. Puesto que la proyección de imagen de fluorescencia se basa todavía en señal a proporción de ruido intensidad de valores de píxel el algoritmo debe ser fácilmente aplicable para imágenes de fluorescencia siempre y cuando la mancha es circular en la naturaleza. Esta aplicación fue confirmada cuando el algoritmo fue capaz de detectar con éxito que uvitex manchados cuerpos celulares de las imágenes anteriormente descritos (figura 5A, 5B). Los usuarios deben ser cuidadosos optimizar los parámetros del algoritmo para su experimento, y deben desarrollar protocolos estandarizados en el futuro para las nuevas aplicaciones.

Figure 1
Figura 1 : Resultados representativos de una imagen óptima obtenida. A. la inicial imagen obtenida por microscopía de campo brillante de una diapositiva de tinta de la India. B. la imagen binaria creada usando un umbral de calcula el valor de intensidad medio pixel añadido a la desviación estándar. Todos los valores por encima de este umbral se consideran blanco y todos abajo se consideran negro. C. una visualización de las cápsulas (verde) y cuerpos de la célula (azul) detectados por el algoritmo. Todas las imágenes se obtuvieron con 40 aumentos con 2 x 2 binning. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Resultados representativos de una imagen óptima obtenida. A. la diapositiva inicial de tinta de la India adquirida mediante microscopía de campo brillante. Desigual e insuficiente da lugar a un fondo especialmente brillante con gradientes de intensidad de tinción. B. la resultante imagen binaria, en la cual cápsulas no se pueden distinguir claramente debido a la señal de fondo alto. C. varias cápsulas son indetectables. Todas las imágenes se obtuvieron con 40 aumentos con 2 x 2 binning. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: cuerpos de la célula de detección. A. imagen de campo claro de cápsula centrada en el plano focal preferido. B. imagen de fluorescencia Uvitex del cuerpo celular en el plano focal preferido. Imágenes fueron obtenidas con 100 aumentos con 2 x 2 binning. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de comparaciones de los resultados para el algoritmo (negro) y humanos (gris). A. cuando se preparan diapositivas según protocolo y se obtienen imágenes óptimas no hay ninguna diferencia apreciable entre las mediciones. B. si el Protocolo no se sigue el algoritmo no precisa identificar y medir cápsulas. Aquí específicamente el fondo no era constante y que no estaba claro contraste entre cápsulas y el fondo. Variaciones calculadas mediante t-test se observa como * para valores de P < 0.05. C. un investigador independiente se le pidió seguir el protocolo y comparar sus análisis con el algoritmo. Fiabilidad se mantiene a través de observadores como correctamente se adquieren las imágenes. D. Un segundo investigador independiente con un microscopio de segunda se utiliza para confirmar que el algoritmo conserva la precisión a través de individuos y hardware. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Una aplicación alternativa potencial del algoritmo: identificación y valoración de microscopía de fluorescencia. Cuerpos celulares se tiñe y reflejados con Uvitex se identificado por algoritmo. El círculo detectado se extiende más allá de lo que sería ser etiquetada como la pared celular porque la detección se basa en la señal de fluorescencia. El algoritmo de detección puede ser adaptado para identificar específicamente la acumulación más brillante de la señal (la pared de célula) modificando el umbral utilizado para generar la imagen binaria inicial representada en figuras 1B y 2B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplemental Figure 1
Suplementario Figura 1: una representante captura de pantalla de la aplicación que se ejecuta en un entorno Windows. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplemental Figure 2
Suplementario Figura 2: representaciones del florecimiento detectado células de levadura. Barra de escala representa 10 μm. A. Una célula padre y brote cada cuentan como celdas separadas dentro de su cápsula. B. A los padres célula y brote cada contaron dos veces, una vez por su propia cápsula y una vez para la otra cápsula de célula, dando por resultado cuatro células total detectado de uno de los padres y una bud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplemental Figure 3
Suplementario Figura 3: representación de los datos finales después de la célula detección y medida. Archivo de imagen se refiere al nombre de la imagen original. Radio total se refiere al radio de los círculos verdes representativos, cápsula y combinado del cuerpo de la célula. X cápsula y cápsula y se refieren a las coordenadas de la cápsula para que esta información se aplica a. Radio del cuerpo se refiere al radio de los círculos azul representativos. Radio cápsula se refiere al radio total menos el radio del cuerpo, dando por resultado el radio de sólo la cápsula. Estos valores serán en micrones siempre y cuando el usuario incluye una tasa de conversión de pixel en micrones paso 3.2.5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Los pasos críticos de esta técnica son preparar el carro de tinta de la India y adquiriendo las imágenes de microscopio. Mientras que el algoritmo ha sido probado con éxito con una variedad de técnicas de imagen y diapositiva en este manuscrito se describe el protocolo recomendado. La cápsula polisacárida es detectada basado en la exclusión de partículas de tinta de la India del dominio de la cápsula de estas partículas son demasiado grandes para penetrar la red fibrilar de polisacárido. Exclusión de la tinta de la India resulta en un círculo brillante sobre un fondo oscuro. El algoritmo detecta círculos basados en lo bien que contrasten con su fondo. Así, una mancha de tinta de la India pesada resultará en mayor contraste entre la cápsula de polisacárido y fondo, aumentar la relación señal a ruido y mejorar la calidad del resultado. Por el contrario, el cuerpo celular se detecta como un círculo oscuro sobre un fondo brillante. El cuerpo de la célula cambiará de aspecto basado en que plano focal del microscopio está establecido, apareciendo como una difusa gris círculo en la parte superior o inferior de la célula y como una banda oscura condensada en el centro. Por las mismas razones ya discutidas, el plano focal donde el cuerpo de la célula aparece como una banda oscura, condensada debe utilizarse para la adquisición de la imagen ya que esto de la detección más exacta del círculo.

El método divulgado aquí ha progresado a través de varias modificaciones y rondas de solución de problemas. El algoritmo fue inicialmente codificados esperando que las células no sería inferiores a 4 o superiores a 60 píxeles basados en el microscopio que se usó. Para ampliar la aplicación de este algoritmo a diferentes aumentos y tamaños de célula que estos límites en su lugar fueron sustituidos por los campos de entrada de usuario que se describe en el protocolo. Los usuarios ahora pueden ingresar parámetros específicos de cada experimento para máxima precisión. Si este algoritmo se aplica a una situación fuera de medida cápsula Cryptococcus se recomienda primero establecer una serie de condiciones de determinación para determinar cómo las muestras deben ser generadas y reflejadas.

La limitación más importante de esta técnica es que se ha diseñado con una aplicación específica en mente, es decir, la medición de la cápsula de Cryptococcus. Mientras que pueden ser fácilmente modificado para adaptarse a aplicaciones adicionales, este script solo es directamente aplicable al Protocolo de cápsula de medición señalado anteriormente. Sin embargo, esta limitación también describe la importancia de este método con respecto a su campo y a los métodos existentes. Además, el florecimiento células de levadura pueden presentar un problema para los investigadores que deseen sólo medir tamaños de célula madre. Este algoritmo es capaz de detectar brotes como células únicas (Figura S2A). En primer lugar, esto puede ser un problema si el investigador en caso que deseen quitar medidas de bud o quite las pilas si no puede ser determinado que detecta es el brote y que es el padre. En segundo lugar, esto puede causar otro problema si el brote es detectado como un cuerpo de la célula todavía dentro de los límites de la cápsula de los padres (Figura S2B) en el cual caso el algoritmo medirá el brote en referencia a la cápsula de los padres. En este ejemplo, cada célula se contará dos veces ya que cada cuerpo de la célula reside en dos cápsulas. Cualquiera de estos problemas pueden abordarse fácilmente una vez finalizado el protocolo. El conjunto final de datos aparece como una hoja de cálculo donde cada individuo detectado célula se etiqueta según el archivo de imagen vinieron de y el x y y coordenadas del cuerpo de la célula (Figura S3). Los investigadores simplemente buscar y excluir los datos que coincide con el brote. A pesar del tamaño de la cápsula es un importante y muy estudiado el factor de virulencia que Cryptococcus campo todavía tiene que establecer protocolos para la adquisición cápsula de medición o la imagen. Esta técnica fue diseñada para llenar estas funciones de una manera precisa y práctica libremente disponible para laboratorios con mínimos requisitos.

Futuras aplicaciones de esta técnica son en gran parte aplicar a otros experimentos. Cualquier imagen basado en la detección o medición de objetos circulares debe ser analizable a través de este algoritmo. Imágenes de microscopia fluorescente pueden ser analizadas aplicando el algoritmo a los canales de láser individuales. Recuento de Colonia bacteriana puede alcanzar y con la modificación adicional podría distinguir entre reporteros de galactosa. Ensayos de crecimiento de colonias de levaduras también podrían evaluarse mediante este algoritmo para estimar tamaño de la zona de Colonia.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Acknowledgments

Nos gustaría reconocer Anthony Bowen cuyas diapositivas fueron utilizados como una segunda comparación de lado a lado humana como Sabrina Nolan cuyas diapositivas fueron utilizados como un tercer humano side-by-side y segunda comparación del microscopio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medición automatizada de la cápsula de polisacárido de <em>Cryptococcus</em> especies y cuerpo de la célula
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Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

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