פלטפורמה משולבת עבור מיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית באמצעות שבב בתפוקה גבוהה-רצף ברקמות הגידול
Summary
כאן, אנו מתארים, אופטימיזציה תפוקה גבוהה שבב-רצף פרוטוקול ו ניתוחים חישובית צינור מצפני הגנום כולו כרומטין דפוסי המדינה בין קפוא גידול רקמות שורות תאים.
Abstract
היסטון השינויים מהווים מרכיב עיקרי של epigenome, תפקיד רגולטורי חשוב בקביעת מצב תעתיק לוקוסים המשויך. בנוסף, הנוכחות של שינויים ספציפיים שימש כדי לקבוע את המיקום ואת זהות ללא קידוד פונקציונלי רכיבים כגון מוצרי טיפוח טבעיים. בשנים האחרונות, immunoprecipitation כרומטין ואחריו רצף הדור הבא (צ’יפ-seq) הפך להיות כלי רב עוצמה בקביעת הפרופילים ברמת הגנום של שינויים היסטון בודדים. עם זאת, הוא הפך יותר ויותר ברור כי דפוסי קומבינטורית שינויים כרומטין, המכונה כרומטין הברית, לקבוע את הזהות ואת אופי מיקומה גנומית המשויך. לכן, זרימות עבודה המורכב חזקים מתודולוגיות (HT) תפוקה גבוהה עבור פרופיל מספר סימני שינוי היסטון, כמו גם ניתוחים חישובית צינורות מסוגל לטפל רבבות שבב-Seq פרופיל datasets, יש צורך נחישות מקיף של מדינות epigenomic במספר גדול של דוגמאות. זרימת העבודה HT-צ’יפ-Seq המובאת כאן כוללת שני מודולים: 1) טיפול נסיוני פרופיל מספר שינויים היסטון של כמויות קטנות של הגידול ודוגמאות שורות תאים בתבנית 96-ובכן; ו- 2) צינור ניתוח נתונים חישובית משלב בין הכלים הקיימים לחישוב התפוסה מארק בודדים והן כרומטין קומבינטורית המדינה דפוסים. יחד, אלה שני מודולים להקל קל לעיבוד של מאות דוגמאות שבב-Seq בצורה מהירה ויעילה. זרימת העבודה המוצגת כאן משמש שואבים כרומטין המדינה דפוסי פרופילי מארק היסטון 6 גידולים מלנומה, שורות תאים. בסך הכל, אנו מציגים מקיף שבב-seq שזרימת עבודה שניתן להחיל על עשרות שורות תאים סרטן כדי לקבוע סטיות epigenomic של גידולים ממאירים שונים ודוגמאות גידול אנושי.
Introduction
הרוב המכריע של הגנום יונקים (98-99%) המורכב מעובדים noncoding רצף, אזורים אלה nocoding להכיל רגולציה מרכיבים הידועים להשתתף בשליטה על ביטוי גנים וכרומטין הארגון1,2. בתא רגיל, הרכבה ספציפיים של דנ א גנומי לתוך הכרומטין הדחוס הוא קריטי עבור הארגון המרחבי, רגולציה תזמון מדויק של תהליכים הקשורים דנ א שונים3,4,5. בתא סרטן אולם כרומטין שינויים על ידי מנגנוני epigenetic סוטה יכול להוביל ארגון לקוי של הכרומטין, כולל גישה אלמנטים רגולטוריות, מערכות לולאה כרומוזומלית, דפוסי ביטוי גנים6, 7,8,9,10.
למרות ההתקדמות, מוגבלים הבנה של שינויים epigenetic המקושרים עם התקדמות הגידול או תגובה טיפולית. Epigenome מורכב מערך של שינויים, כולל סימני היסטון מתילציה DNA, אשר יחדיו יוצרים מדינה דינמי (המכונה כרומטין המדינה) או”עובדות ג’ין ביטוי רשתות ותהליכים אחרים קריטיים לשמירה הזהות הסלולר. לאחרונה, כבר הראו שינויים משפרי ב ממאירות מרובים על ידי לימוד פרופילים H3K27Ac11. למרות מחקרים כאלה לספק תובנה המתאם של סימני epigenetic מבודד, יותר מ-100 שינויים epigenetic היה מזוהה12,13 ללא הבנה ברורה של התפקידים הביולוגיים שלהם, תלות הדדית. יתר על כן, יש מספר גדול עוד יותר דפוסי קומבינטורית אפשרי היסטון ובשינויי הדנ א הללו, וזה דפוסי קומבינטורית – שינויים לא בודדים – אלה המכתיבים הברית epigenetic14. לפיכך, יש צורך אדיר כדי לזהות שינויים במדינות אלה כרומטין במהלך התקדמות סרטן או תגובות על טיפול. מידע מקיף על epigenome שינויים ב סרטן יש כבר משתרך בחלקו בשל טכני (למשל הדור של נתונים בקנה מידה גדול כמות קטנה של תאים בודד חומר קליני) אנליטיים (למשל אלגוריתמים כדי להגדיר אתגרים קומבינטורית הברית). לכן, יש צורך קריטי עבור שיטות יציבות תפוקה גבוהה עבור פרופיל מספר גדול של סימני שינוי היסטון חומר קליני, קל ליישם שיטות חישוביות לצורך לחזות דפוסי קומבינטורית אשר יקל הנחישות של הברית epigenetic הקשורים עם שלבים שונים של tumorigenesis והתנגדות טיפולית. נתונים נוספים, מהשעה האחרונה epigenome פרופיל מחקרים15,16,17,18,19,20,21, 22,23 רקמות רגילה, שורות תאים ניתן לשלב עם כרומטין פרופילים של גידולים עבור עוד תובנות epigenome תרומתו הגידול ביולוגיה.
כרומטין פרופיל הפך להיות כלי רב עוצמה לזיהוי דפוסי האיגוד העולמי שונים כרומטין שינויים15,24. בשנים האחרונות הפך שבב-seq “תקן הזהב” ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א26,25,מידה עולמי27. עבור כל ניסוי שבב-seq, ישנם שלבים קריטיים הכרחי להצלחה שלו, לרבות עיבוד רקמה של השיוך, קובע תנאים sonication אופטימלית, קובע ריכוז נוגדן אופטימלית עבור משקעים, ספריית הכנה, רצף שלאחר עיבוד נתונים, וניתוח במורד הזרם. כל הצעדים האלה מכילים מחסומים מרכזיים בקרת איכות, כאשר נלקח יחד מכריעים לזיהוי מטרות אפשריות עבור אימות פונקציונלי כראוי. באמצעות חדשנות בשלבים אלה, מספר מחקרים קודמים פיתחו שיטות לביצוע צ’יפ או שבב-Seq מתוך כמות קטנה של רקמות28,29,30,31,32 . יתר על כן, מספר מחקרים הציעו פרוטוקולים לניסויים שבב תפוקה גבוהה, ואחריו PCR המבוסס על כימות33,34. לבסוף, בחלק מהפלטפורמות ניתוח בפומבי זמינים עבור שבב-Seq נתונים זמינים כעת Easeq35 ו גלקסי36. עם זאת, יש שהיה חסר פלטפורמה משולבת לביצוע שבב-Seq אופנה תפוקה גבוהה בשילוב עם צינור חישובית לבצע מארק יחיד, כמו גם ניתוחים המדינה כרומטין.
פרוטוקול זה מתאר מלא ומקיף, צ’יפ-seq זרימת עבודה למיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית גידול רקמות, שורות תאים, עם קל לעקוב אחר הנחיות המקיף את כל השלבים הדרושים עבור ניסוי יירוט מוצלח. על ידי אימוץ שיטת תפוקה גבוהה שתואר קודם לכן על ידי בלכר-גונן. et al. 37, פרוטוקול זה יכול להתבצע על עשרות דוגמאות במקביל, הוחל בהצלחה על שורות תאים סרטן וגידולים אנושיים כגון מלנומה, המעי הגס, הערמונית, glioblastoma חוזרות. נדגים את המתודולוגיה במשך ששה שינויים היסטון הליבה המייצגים רכיבי מפתח של הנוף רגולטוריות epigenetic שורות תאים מלנומה אנושית ודוגמאות הגידול. שינויים אלה כוללים H3K27ac (משפרי), H3K4me1 (משפרי פעיל ולאחר מקסימה), H3K4me3 (היזמים), H3K79me2 (עיבד אזורים), H3K27me3 (דיכוי polycomb), ו- H3K9me3 (דיכוי heterochromatic). סימנים אלה יכול לשמש לבד או בשילוב לזהות מצבי כרומטין פונקציונלית נפרדים המייצגים תחומי הדיכוי והן פעיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר מודול שבב-seq מלא ומקיף, של תפוקה גבוהה, למיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית רקמות הגידול האנושית ואת שורות תאים. בכל פרוטוקול שבב-seq, אחד הצעדים החשובים ביותר הוא נוגדן ירידה לפרטים. . הנה, שיטה זו ממחישה immunoprecipitation התנאים המתוארים שישה היסטון השינויים, כל אשר שבב-כיתה, יש קודם …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מרקוס קויל, Gumbs קרטיס, הליבה SMF MDACC לתמיכה רצף. העבודה המתוארות במאמר זה נתמך על ידי מענקים מן המענק NIH (CA016672) SMF הליבה של NCI פרסים (1K99CA160578 ו- R00CA160578) ק ר
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
References
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
- Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
- Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
- Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
- Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
- Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
- Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
- Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
- Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
- Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
- Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
- Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- O’Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
- Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
- Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
- Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
- Koster, J., Rahmann, S. Snakemake–a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
- Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
- Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
- Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
- Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
- Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).
