Summary
여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.
Abstract
히스톤 수정은 epigenome의 주요 구성 요소를 구성 하며 중요 한 역할을 규제 관련된 loci의 transcriptional 상태를 결정 합니다. 또한, 특정 수정의 존재 위치와 강화 등 비 코딩 기능 요소 정체성을 결정 하 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, chromatin immunoprecipitation 다음 세대 시퀀싱 (칩 seq) 다음 개별 히스톤 수정의 게놈 넓은 프로필 결정에 강력한 도구가 되고있다. 그러나, 그것은 점점 더 분명 chromatin 수정, Chromatin 상태 라고의 조합 패턴 정체성과 관련 된 genomic 소재 시의 결정 되고있다. 따라서, 다양 한 전산 분석 파이프라인 수 뿐만 아니라 히스톤 수정 표시를 프로 파일링에 대 한 강력한 높은 처리량 (HT) 방법론의 구성 된 워크플로 처리 칩 Seq의 무수의 프로 파일링 데이터 집합에 필요한 샘플의 많은 수에 있는 epigenomic 국가의 포괄적인 결정. 여기는 HT 칩 Seq 워크플로 두 개의 모듈로 구성: 1) 적은 양의 종양 샘플 및 96-잘 형식; 셀 라인에서 여러 히스톤 수정 프로 파일링 실험 프로토콜 그리고 2) 개별 마크 인 및 조합 chromatin 상태 패턴을 계산 하는 기존 도구를 결합 하 여 전산 데이터 분석 파이프라인. 함께,이 두 가지 모듈 쉽게 처리 칩 Seq 샘플의 수백의 신속 하 고 효율적인 방식으로 촉진 한다. 여기에 제시 된 워크플로 chromatin 상태 패턴 흑색 종 종양 세포에서 6 히스톤 마크 프로필에서 파생 하는 데 사용 됩니다. 전반적으로, 우리는 인간의 종양 샘플 및 다양 한 악성 종양에 epigenomic 착오를 결정 하기 위해 암 세포 라인에 적용할 수 있는 포괄적인 칩 seq 워크플로 제시.
Introduction
포유류 게놈 (98-99%)의 대다수는 noncoding 시퀀스, 구성 그리고 알려진 유전자 발현 및 염색 질 조직1,2에 참여 하는 규제 요소를 포함 하는이 nocoding 지역. 정상 세포에서 게놈 DNA의 특정 어셈블리 압축된 chromatin 구조에이 공간 조직, 규정 및 다양 한 DNA 관련 된 프로세스3,,45의 정확한 타이밍에 대 한 중요 합니다. 그러나 암 세포에, chromatin 수정 후 성적인 탈 선 메커니즘에 의해 chromatin 구조, 규제 요소, 염색체 루핑 시스템 및 유전자 표현 패턴6에 대 한 액세스를 포함 하 여 부적절 한 조직에 발생할 수 있습니다. 7,8,,910.
최근 발전에도 불구 하 고 우리 후 변경 관련 된 종양의 진행 이나 치료 응답의 이해를 제한 했다. epigenome 수정, 히스톤 부호, DNA 메 틸 화, 총칭 impinges 유전자 식 네트워크와 유지에 대 한 중요 한 다른 프로세스는 동적 상태 (chromatin 상태 라고 함)를 형성 등의 구성 세포 id입니다. 최근, 강화 변경 H3K27Ac 프로필11공부 하 여 여러 악성 종양에 표시 되었습니다. 100 개 이상의 후 성적인 수정 확인 된12,13 그들의 생물 학적 역할의 명확한 이해 없이 되었습니다 이러한 연구 격리 후 성적인 부호의 상관 관계에 대 한 통찰력을 제공, 그리고 상호 의존입니다. 또한, 이러한 히스톤과 DNA 수정 가능한 조합 패턴의 더 큰 수가 있다 며 이러한 조합 패턴-개별 수정-epigenetic 국가14를 지정 하는. 따라서, 암 진행 이나 치료. 에 대 한 응답 하는 동안 이러한 chromatin 상태 변경 식별 엄청난 필요는 암에 epigenome 변경의 포괄적인 지식 기술 (예: 작은 양의 임상 자료/단일 셀에서 대규모 데이터의 발생)으로 인해 일부 후행 되었습니다 있다 및 분석 (예: 알고리즘을 정의 조합 국가) 도전. 따라서, 필요도 중요 한 임상 자료와 구현 하기 쉬운 전산 접근에서 히스톤 수정 표시의 많은 수를 프로 파일링에 대해 강력한 높은 처리량 방법 촉진 한다 조합 패턴 예측 epigenetic 상태 tumorigenesis 및 치료 저항의 다른 단계와 관련 된 결정. 최근 epigenome 프로 파일링 연구15,,1617,18,19,20,21에서 사용할 수 있는 추가, 데이터 정상 조직 및 세포에서 22,23 chromatin 프로필에 대 한 추가 epigenome 기여 종양 생물학에 종양의 통합 될 수 있다.
Chromatin 프로 파일링 다양 한 chromatin 수정15,24의 글로벌 바인딩 패턴을 식별 하기 위한 강력한 도구가 되고있다. 최근 몇 년 동안에 칩 seq 세계적인 규모25,,2627에 DNA 단백질 상호 작용 연구 "금 표준" 되고있다. 어떤 칩 seq 실험에 대 한 단계가 중요 한 성공, 조직 처리 및 연관 해제를 포함 하 여, 최적의 쥡니다 조건, 강 수, 도서관 준비에 대 한 최적의 항 체 농도 determing determing에 필요한 -시퀀싱 데이터 처리 및 다운스트림 분석입니다. 각이 단계 주요 품질 관리 검사점을 포함 하 고 함께 찍은 때 제대로 기능 유효성 검사에 대 한 잠재적인 대상을 식별 하는 데 중요 한 있다. 이 단계에서 혁신을 통해 여러 이전 연구에서 적은 양의 조직28,,2930,31,32 칩 또는 칩 Seq를 수행 하는 방법론 개발 . 또한, 일부 연구는 높은 처리량 칩 실험 뒤에 PCR 프로토콜 기반 정량33,34건의 했다. 마지막으로, 일부 공개적으로 사용 가능한 분석 플랫폼 칩 Seq 데이터에 대 한 Easeq35 등 은36사용할 수 지금 있습니다. 그러나, 하나의 마크 chromatin 상태 분석 수행을 계산 파이프라인 함께 높은 처리량 패션에 칩 Seq를 수행 하기 위한 통합된 플랫폼 부족 되었습니다.
이 프로토콜 설명 종양 조직에 셀 라인, chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 칩 seq 워크플로 쉽게 성공적인 실험에 필요한 단계를 모두 포괄 하는 지침에 따라. 이전 Blecher 고 넨 외. 에 의해 설명 하는 높은 처리량 방법을 채택 하 여 37이 프로토콜 병렬로 샘플의 수십에서 수행할 수 있습니다 그리고 암 세포 선 및 흑색 종, 전립선, 콜론과 세포종 님 같은 인간 종양에 성공적으로 적용 되었습니다. 6 코어 히스톤 수정 인간 흑색 종 세포 선 및 종양 샘플에 epigenetic 규제 프리의 주요 구성 요소를 나타내는 방법을 보여 줍니다. 이러한 수정 포함 H3K27ac (강화), H3K4me1 (활성 및 태세 강화), H3K4me3 (발기인), H3K79me2 (복사할 영역), H3K27me3 (polycomb 억압), 및 H3K9me3 (heterochromatic 억압). 이러한 표시 억압 및 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태를 식별 하기 위해 단독으로 또는 조합에서 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 임상 표본은 기관 검토 위원회의 지침에 따라 얻은 했다.
1. 버퍼 준비
- TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 10 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 8.0) 200 mL를 확인 합니다.
- STE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl) 200 mL를 확인 합니다.
- 2.0 M 글리신 (37.52 g 물 200 mL에 글리신의)의 200 mL 고 65 ° c 열
- 200 mL의 5% 나트륨 deoxycholate (DOC) 솔루션 물 200 mL에 DOC (10 g)을 확인 합니다.
- 500 mL 칩 수확 버퍼 (12 mM Tris-Cl, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), 6 mM EDTA, 0.5% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) x 0.1)을 확인 합니다.
- 칩 희석 버퍼의 500 mL 확인 (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0.1% 의사, 1% 트라이 톤-X, 1 mM EDTA).
- RIPA 워시 버퍼의 500 mL 확인 (인 트, 1% 트라이 톤 x-100, 0.1 %SDS, 0.1 %DOC).
- RIPA/500 워시 버퍼 (RIPA 버퍼 + 360 mM NaCl)의 500 mL를 확인 합니다.
- 500 mL LiCL 워시 버퍼의 확인 (테, 250mm LiCl, 0.5 %NP-40, 0.5 %DOC).
- 직접 차입 버퍼의 500 mL 확인: 10 mM Tris Cl pH 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0.5 %SDS.
- 항 체 바인딩/차단 버퍼 (PBS + 0.1% TWEEN 20 + 0.2 %IgG 무료 BSA) 50 mL를 확인 합니다.
2. 조직/셀 라인 처리 및 교차 연결
- 조직에 플래시 동결 경우 분리 전에 얼음에 dethaw.
- 2 mL의 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) 살 균 면도날을 사용 하 여 수동으로에서 조직 (히스톤 수정 항 체 당 ~ 8 밀리 그램)의 50 밀리 그램을 연결이 해제 됩니다. 메 마른 조직 문화 접시에 약 5 분 동안 3 ~ 4 m m 조각으로 조직을 말하다.
- Dissociator 튜브에 조직과 HBSS 솔루션 전송 및 HBSS의 또 다른 8 mL을 추가. 더 조직 무 균 때까지 dissociator를 사용 하 여 연결이 해제 됩니다.
- 흑색 종 종양에 대 한 튜브에는 dissociator 하 고 다음 주기 각각이 순서 대로 한 번 실행: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 및 m_heart_02.01.
- 매체의 10 mL에 긁어 21 × 106 셀 (히스톤 수정 및 입력; 당 ~ 3 × 106 희귀 인구에 대 한 마크 당 100000 셀에 낮출 수 있습니다) 표준 조직 문화에서 성장 접시와 15 mL 원뿔 튜브에 수집.
참고: 미디어 대표 흑색 종 세포 라인 WM115에 사용 되는 DMEM 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 5% 페니실린/스. - Crosslink 조직/세포 조직 (또는 셀에 대 한 매체의 3 mL) 3 mL HBBS 당 16% 포름알데히드의 200 µ L을 추가 하 여 1% 최종 포름알데히드 농도 사용 하 여. 37 ° c.에 정확히 10 분에 대 한 믹서를 사용 하 여 10 rpm에 혼합물을 흔들어
주의: 포름알데히드 독성 이며 적절 한 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. - 샘플의 3 mL 당 2.0 M 글리신의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 또 다른 5 분 동안 10 rpm에서 떨고 계속
참고: 글리신은 끄는 역할을 합니다. 신선한 글리신 솔루션 솔루션 시간이 지남에 경향이 pH pf로 매달 마다 확인 합니다. - 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 4 ° C에서 5 분 동안 934 x g에서 샘플을 회전 합니다. 제거는 상쾌한, 얼음 차가운 PBS의 5 mL, 934 x g에 다시 샘플 원심 더하고 제거는 상쾌한.
- 플래시 펠 릿을 동결 하 고 추가 처리를 위해-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
3. 조직 세포, 쥡니다, 그리고 항 체 준비
- 1 효소 억제제 태블릿 칩 수확 버퍼의 10 mL 당 분해.
- 조직의 50 밀리 그램 당 효소 억제제와 칩 수확 버퍼의 300 µ L을 추가 하 고 얼음에 세포의 30 분을 허용.
참고: 1 X 107 WM115 흑색 종 세포 선의 당 protease 억제제와 칩 수확 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다. - 셀 lysing는 하는 동안 설정 된 waterbath 방해 및 냉각 시스템 온도 4 ° c.를 도달 하 고 Waterbath 방해에 sonicator 튜브를 놓고 30에서 60 사이클에 대 한 흑색 종 조직 sonicate s에 30 s ~ 200-600의 기본적인 쌍 (bp)의 염색 질 조각을 얻기 위해 떨어져.
참고: 쥡니다 조직 유형 간에 다를 수 시간과 그에 따라 조정 되어야 한다. 이 중요 한 단계 이며 immunoprecipitation 진행 하기 전에 파일럿 실험에 최적화 되어야 합니다. - 쥡니다, 동안 세 번 사용 하 여 바인딩/차단 버퍼 (PBS + 0.1% TWEEN 20 + 0.2 %BSA)의 1000 µ L 샘플 당 항 체 당 단백질 G 자석 구슬의 20 µ L을 씻어.
- 흑색 종 조직의 ~ 8 mg, 100 µ L의 바인딩 / 튜브 리볼버를 사용 하 여 회전으로 4 ° C에서 2 시간에 대 한 버퍼를 차단에서 각 히스톤 항 체의 3 µ g를 품 어. 단일 항 체에 대 한 12 샘플 구슬의 240 µ L, 항 체의 36 µ g 및 바인딩/차단 버퍼의 1200 µ L를 포함 되어 있습니다.
참고: 3 × 106 셀에 대 한 각 항 체의 5 µ g 및 항 체 당 단백질 G 자석 구슬의 30 µ L 사용 합니다. 다른 양의 조직 사용 하는 경우 항 체 및 단백질 G 구슬 적정 한다. 그러나이 프로토콜 설명된 6 히스톤 수정 (자료 테이블)에 대 한 immunoprecipitation 조건에서는,, 항 체 농도 다른 수정 및 녹음 방송 요인에 대 한 최적화 되어야 합니다. - 조각 크기를 결정, sonciated chromatin 솔루션의 20 µ L를 제거 추가 차입 버퍼를 직접 차입의 44 µ L을 포함 하는 마스터의 믹스 (실내 온도) 버퍼, 1 µ L의 RNase (20 mg/mL), 및 샘플 당 5 µ L 성분 K (20 mg/mL). 50 ° c.에 적어도 2 시간에 대 한 PCR 열 cycler에서 샘플을 품 어 제조업체 지침에 따라 PCR 정화 키트를 사용 하 여 샘플을 정화.
- 염색 질은 3.6 단계를 진행 하기 전에 높은 감도 DNA electropherogram 악기를 사용 하 여 조각 크기를 결정 하 여 전단 충분히 있는지 확인 합니다. Electropherogram 악기를 켭니다.
- 8 잘 광학 튜브 스트립의 각 음에 높은 감도 버퍼 시 약의 2 µ L를 로드 합니다. 나머지 우물에서 순화 된 샘플의 첫 번째 잘 하 고 2 µ L에 높은 감도 사다리의 2 µ L를 로드 합니다.
- 광 튜브 캡 튜브 stips 소용돌이에 샘플 1 분 오픈 뚜껑에 대 한 2000 rpm에서 놓고 새로운 높은 감도 화면 테이프와 로드 팁의 상자를 삽입 합니다. 스트립 모자를 제거 하 고 electropherogram 악기에는 샘플을 로드.
- 분석 소프트웨어, 스크린 테이프에 처음 13 공간 강조 열고 오른쪽 하단에 시작 탭을 누릅니다. 염색 질 조각을 200 ~ 1000 bp 사이 칩에 적합 합니다.
- 무 균 튜브 sonicated 솔루션 전송 및 4 ° c.에 15 분 동안 탁상용 원심 분리기를 사용 하 여 21,130 x g에서 튜브를 회전 새로운 튜브는 상쾌한 전송.
- 결정은 상쾌한의 총 볼륨 입력 제어를 위한 전체 솔루션의 10%를 제거 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다
4. 염색 질 Immunoprecipitation
- 2 효소 억제제 태블릿 칩 희석 버퍼의 20 mL 당 분해.
- 쥡니다 희석 후 나머지 샘플 5 칩 희석 버퍼를 사용 하 여 아래로 0.1 %SDS 레벨을가지고 시간. 1350 µ L의 최종 전체 볼륨을 얻기 위해 칩 희석 버퍼의 1080 µ L와 나머지 상쾌한의 270 µ L를 희석.
- 항 체 및 단백질 G 자석 구슬의 부 화 완료, 튜브 자석에 놓고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 여전히 자석에 앉아 튜브, protease 억제제와 칩 희석 버퍼의 750 µ L을 추가 하 여 구슬을 한 번 씻어.
참고: 그것은 구슬 방해 또는이 단계 동안 튜브를 회전 시킬 수는 없습니다. - 희석 버퍼 세척 하 고 구슬 같은 칩 희석 버퍼의 240 µ L에 resuspend 칩을 제거 합니다. Aliquot 20 µ L 12 별도 튜브, 구슬의 각각 별도 조직 샘플에 사용 됩니다.
- 약 sonicated 자료 공중 제비 4 ° c.에 하룻밤 튜브 리볼버를 사용 하 여 특정 항 체와 단백질 G 구슬을 균등 하 게 수
5. 세탁기와 역 Immunoprecipitated DNA 단백질 복합물의 교차 결합 시키기
- 역방향 가교 후 다음날 아침 96 잘 접시에 항 체-단백질 해결책을 전송 하 고 마그네틱 스탠드에 배치. 적어도 30 s 및 제거에 대 한 준수를 구슬 수는 상쾌한.
- 워시 5 번과 150 µ L 다채널 피펫으로 사용 하 여 차가운 RIPA 워시 버퍼의 구슬. 세척 단계 동안 하지 피펫으로 구슬, 하지만 30 왼쪽 오른쪽에서 지속적으로 자석 이동 s 세척.
- 얼음 처럼 차가운 RIPA 500 워시 버퍼의 150 µ L로 두 번 샘플을 씻으십시오.
- 얼음 처럼 차가운 LiCl 워시 버퍼의 150 µ L로 두 번 샘플을 씻으십시오.
- 얼음 처럼 차가운 테 워시 버퍼의 150 µ L 한번 샘플을 세척 하 고 테 버퍼를 즉시 제거. 낮은 입력된 응용 프로그램에 대 한이 단계를 생략할 수 있습니다.
- 3.7 칩 DNA 샘플을 포함 하는 96 잘 접시의 신선한 우물에 단계에서 입력 컨트롤을 추가 합니다.
- 세척 단계 후 추가 차입 버퍼 마스터 믹스 (실내 온도)의 직접 차입 버퍼, RNase (20 mg/mL)의 1 µ L 및 역방향 가교에 대 한 칩 및 입력 샘플 당 5 µ L 성분 K (20 mg/mL) 44 µ L을 포함 하.
- 37 ° C, 50 ° C에서 65 ° c.에서 8-16 h h 4에서 4 h에 대 한 PCR 열 cycler를 사용 하 여 샘플을 품 어
6. 정화와 침전 된 DNA의 정량화
- 다음날 아침, 장소는 샘플 immunoprecipitated DNA를 포함 하는 새로운 96-잘 PCR 접시에 자석 표면에 뜨는 전송에 다시.
- 솔루션 (솔루션의 50 µ L에 대 한 115 µ L) 고 신중 하 게 25 번 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 위아래로 피펫으로 상자성 구슬 x 2.3을 추가 합니다. 솔루션은 동질적인 경우 제대로 혼합 될 것 이다.
- 4 분 샘플 자석에 다시 하 고 또 다른 4 분 삭제는 상쾌한에 대 한 실 온에서 품 어 장소에 대 한 자석에서 실내 온도에 솔루션을 품 어.
- 자석에는 샘플을 떠나, 하는 동안 70% 에탄올 (vol/vol)의 150 µ L을 추가 하 고 30에 대 한 실 온에서 품 어 구슬 방해 하지 않고 s.
- 에탄올을 제거 하 고 세척을 반복 합니다. 5 분에 대 한 자석에 상자성 구슬 공기 건조 수 있습니다.
참고: 나머지 에탄올에 방해가 됩니다 정화로 두 번째 세척 후 모든 에탄올을 제거 합니다. - 자석에서 샘플을 제거 하 고 10 mM Tris Cl pH 8.0의 30 µ L를 추가 합니다. 25 번 pipetting으로 혼합 하 고 4 분에 대 한 자석에서 실내 온도에 샘플을 품 어.
- 자석에 다시 샘플을 놓고 도서관 준비에 대 한 새로운 96 잘 접시에 각 샘플의 또 다른 4 분 전송 20 µ L에 대 한 실 온에서 품 어. 나머지 10 µ L 칩 DNA의 경우 문제는 라이브러리의 세대와 함께 저장 합니다.
- 이 단계에서 칩 DNA 도서관 준비 전에 계량. DNA 농도 고감도 DNA 시 약으로 측정 됩니다. 높은 감도 DNA electropherogram 악기 절차 단계로 7.1 사용 하 여 침전 된 DNA의 크기 분포를 결정 합니다.
7. 라이브러리 생성 NEBNext 울트라 II DNA 도서관 준비 키트를 사용 하 여
- NGS 시퀀싱 제조 업체에서 권장된 프로토콜에 따라 DNA 도서관 준비를 사용 하 여 라이브러리를 생성 합니다. 모든 반응 96 잘 접시에서 수행 되 고 외피 뚜껑 온도 설정 > 100 ° C와 50 µ L에서 설정 볼륨 PCR 열 cycler에서 수행 됩니다.
- 인덱스에 대 한 다중 Oligos NGS 플랫폼에 대 한 사용 됩니다. 다음 설정을 사용 하 여 PCR 증폭에 대 한 총 10 x 사이클 수행: 98 ° c 30에 대 한 초기 변성 s, 98 ° C 10에서 변성 s, 어 닐 링/30 위한 65 ° C에서 확장 s (10 x 주기), 최종 확장 65 ° C 5 분 및 4 ° c.에서 개최
주: 표 1 PCR 증폭에 사용 되는 뇌관을 포함 되어 있습니다. - PCR 확대 후 샘플을 제거 하 고 총 볼륨 nuclease 무료 물을 사용 하 여 100 µ L을가지고. 구슬의 첫 번째 추가 55 µ L에 의해 이중 면 상자성 크기 선택 (0.55x/0.8x)을 수행 하 고 25 번 pipetting으로 혼합. 4 분 동안 자석에서 실내 온도에 샘플을 품 어.
- 자석에 다시 샘플을 놓고 또 다른 4 분 동안 실 온에서 품 어. 이 단계는 시퀀싱에 적합 하지 않은 구슬에 큰 조각을 유지 하는 데 사용 됩니다.
- 새로운 96-잘 PCR 접시에는 상쾌한을 전송 합니다. 상쾌한이 부분적으로 순화 된 DNA 포함으로 버리지 마십시오.
- 상자성 구슬의 또 다른 25 µ L을 추가 하 고 25 번 pipetting으로 믹스 4 분 동안 자석에서 실 온에서 품 어.
- 자석에 다시 샘플을 배치 하 고 또 다른 4 분 동안 실 온에서 품 어는 상쾌한 삭제. 이 단계는 200 ~ 600의 파편을 유지 하는 데 사용 됩니다 사용 됩니다 혈압 라이브러리 확정.
- 자석에는 샘플을 떠나, 하는 동안 70%의 에탄올 (v/v)의 150 µ L을 추가 하 고 30 잠복기 수 구슬 (자석에 이동 하지 않습니다)를 방해 하지 않고 s. 에탄올을 제거 하 고 세척 두 번째 반복.
- 상자성 구슬 5 분에 대 한 자석에 건조 공기를 제거 모든 에탄올 두 번째 세척 후 남은 에탄올에 방해가 됩니다 정화 수 있습니다.
- 자석에서 샘플을 제거 하 고 10 mM Tris Cl pH 8.0의 25 µ L를 추가 합니다. 25 번 pipetting으로 혼합 하 고 4 분 샘플 자석에 다시 하 고 또 다른 4 분 동안 실 온에서 품 어 장소에 대 한 자석에서 실 온에서 품 어.
- 시퀀싱에 대 한 적합 한 크기를 보장 하기 위해 멀티플렉싱 하기 전에 높은 감도 DNA electropherogram 악기를 사용 하 여 라이브러리를 계량. 완성 된 라이브러리 200-600 bp 사이 고 모든 뇌관 이합체 없다.
참고: 필요한 경우 상자성 비드 정화 x 다른 0.7은 제거 하기 위해 수행 ~ 130에 존재 하는 원치 않는 뇌관 이합체 혈압. - 농도 따라 고유 인덱스 뇌관에 따라 정량된 DNA 수영장. 1 ng / µ L 6ng / µ L 사이 농도와 6 샘플을 포함 하는 풀에 대 한 분포 이며 낮은 샘플의 15 µ L 높은 샘플의 2.5 µ L. 이것은 읽기 수 흐름 셀의 각 레인에 균등 하 게 배포 될 것입니다 보장 하기 위해 이루어집니다.
8. 게시물 칩 seq 데이터 처리
- Snakemake38,39 에 따라 파이프라인에 사용 되는 프로세스는 다음의 모든 단계는 단일 명령에. 중요 한 것은, 각이 단계는 개별적으로 관련된 명령으로 설명 되어 있습니다.
- FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)를 사용 하 여 원시 fastq 연속 읽기의 품질 결정: 유닉스 터미널을 열고 디렉터리를 변경 (cd) 각 6 히스톤 수정에 대 한 원시 fastq 파일이 들어 있는 폴더에. 유닉스 터미널 종류, fastqc *fastq.gz 및 보도 [반환] 이 폴더의 모든 fastq 파일에 품질 관리 통계를 실행 됩니다.
- 품질 읽기 참조 게놈에 정렬 하 고 bam 파일을 압축 하기 전에 중복을 제거 합니다. 이 bowtie 버전 1.1.239, SAMBLASTER 버전 0.1.2140, SAMTOOLS 버전 1.3.141를 사용 하 여 수행 됩니다: 유닉스 터미널 종류 bowtie-m 1-n 1--최고의-지층-S-q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster-removeDups | samtools 볼-Sb-> histone1.bam 및 보도 [반환].
참고: path_to hg19 인간 게놈 어셈블리가 포함 된 폴더를 나타냅니다. 이것은 관심의 유기 체에 따라 변경 됩니다. - SAMTOOLS 다음 명령을 사용 하 여 bam 파일 정렬: 유닉스 터미널 유형을 samtools 정렬 histone1.bam-m 2 세대-@ 5-T histone1.temp-o histone1.sorted 및 보도 [반환].
- 색인 SAMTOOLS 다음 명령을 사용 하 여 bam 파일: 유닉스 터미널 유형을 samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai 색인에 [RETURN] 키를 누릅니다.
- 다음 명령을 SAMTOOLS flagstat를 사용 하 여 고유 하 게 매핑된 및 정렬 되지 않은 읽기 확인: 유닉스 터미널 종류, samtools flagstat histone1.sorted.bam에 보도 [반환].
- 다음 명령 사용 하 여 무작위 샘플링을 수행 하 여 bam 파일 당 읽기 수를 정상화: 유닉스 터미널 종류에서 sambamba-f bam 보기-서브-시드 3-s 0.X histone1.sorted.bam = | samtools 정렬-m 2 세대-@ 5-T histone1.downsample.temp-o histone1.downsample.sorted.bam 및 보도 [반환].
- 색인 다시 SAMTOOLS 다음 명령을 사용 하 여 bam 파일: 유닉스 터미널 유형을 samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai 색인에 [RETURN] 키를 누릅니다.
- (즉게놈 브라우저에 칩 seq 라이브러리를 시각화 하기 위해. UCSC 또는 IGV), kilobase 당 당 읽기에 bam 파일을 확장 하 여 deepTools 버전 2.4.040 을 사용 하 여 중요 파일 생성 백만 (RPKM). 이 다음 명령을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
- 표준 중요 파일에 대 한: 유닉스 터미널 종류, bamCoverage-b histone1. downsample.sorted.bam-normalizeUsingRPKM-binSize 30-smoothLength 300-extendReads 200-o histone1.bw 및 보도 {반환].
- 입력에 대해 중요 파일을 뺍니다: 유닉스 터미널 종류, bamCompare-bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam-bamfile2 input1.downsample.sorted.bam-normalizeUsingRPKM-비율 빼기-binSize 30-smoothLength 300-extendReads 200-o histone1.subtracted.bw 고 보도 [반환]입니다.
- 칩 seq (MAC) 버전 1.4.225,26 버전 2.1.0의 모델 기반 분석을 사용 하 여 "입력" 배경 위에 칩 seq 신호 농축을 식별 합니다. Macs1를 사용 하 여 "포인트 소스" 요인 macs2 및 H3K27ac, H3K4me1, H3K4me3 H3K79me2, H3K27me3 및 H3K9me3 "광범위 한 소스" 요소에 대 한 대 한. 이 다음 명령을 사용 하 여 수행 됩니다.
- 포인트 출처: 대 한 유닉스 터미널 종류, macs14-t histone1.downsample.sorted.bam-c input1.downsample.sorted.bam-g h s-f BAM-p 1e-5-nomodel-유지-dup에에서 모든-n histone1.file 및 보도 [반환].
- 광범위 한 출처: 대 한 유닉스 터미널 종류, macs2 callpeak-histone1.downsample.sorted.bam-c input1.downsample.sorted.bam-g hs tf BAM-p 1e-6--광범위 한 광범위 한 컷오프 1e-6-유지-dup 모든-nomodel-n histone1.file 및 보도 [반환].
- 사용 ChromHMM24 조합 chromatin 상태 패턴을 식별 하는 다음 명령을 사용 하 여 공부 하는 히스톤 수정에 따라:
- 유닉스 터미널에서 입력, cd/path_to/ChromHMM_folder 하 고 [RETURN] 키를 누릅니다.
- ChromHMM 디렉터리 형식에서 한 번 자바-mx2G-ChromHMM.jar BinarizeBam-b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output jar 및 [RETURN] 키를 누릅니다.
- 유형, 자바-mx2G-ChromHMM.jar LearnModel-b 1000/path_to/hg19 BinarizeBam/path_to/output_directory 15 병 고 [RETURN] 키를 누릅니다.
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Representative Results
이 프로토콜에는 냉동된 종양 조직 및 높은 처리량 방법 (그림 1A)를사용 하 여 병렬로 샘플의 수십에 수행할 수 있는 셀 라인에서 immunoprecipitation 수 있습니다. 염색 질 조각을 위한 최적의 immunoprecipitation ~ 200-1000 bps 사이 범위 해야 합니다. 우리는 같은 전단 길이 달성 하는 데 필요한 시간이 다른 조직 및 세포 유형에 대 한 다른 지적 했다. 적은 양의 조직에서 칩의 성공 특히 쥡니다 동안 항상 lysate 감기 유지에 따라 달라 집니다. 순화 칩 DN 사들이 도서관 준비 (그림 2A)를 진행 하기 전에 측정할 수 있습니다. 완성 된 라이브러리 멀티플렉싱 및 NGS 적합 해야 ~ 200-600 bp 사이 고 어떤 뇌관 이합체 없는 (그림 2B). -시퀀싱 시 맥 같은 파이프라인의 추가 단계를 진행 하기 전에 충족 해야 하는 많은 품질 관리 통계는 피크-전화 또는 ChromHMM 분석 (그림 3). 이러한 통계의 많은 FastQC 및 MultiQC 같은 프로그램을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 품질 fastq 읽기 한 불일치의 최대 ~ 50-80%의 비율로 인간 게놈에 정렬 됩니다. 권장된 시퀀싱 깊이 ~ 10-15 백만 고유 하 게 매핑된 "포인트 소스" 요소에 대 한 읽기 이며 ~ 20-30 백만 고유 하 게 매핑된 "광범위 한 소스" 요인27,41,,4243에 대 한 읽기. 정렬 된 인덱싱된 BAM 파일 IGV 등 UCSC 게놈 브라우저를 사용 하 여 시각 될 수 있는 중요 파일을 생성 하는 데 사용 됩니다. 칩 샘플 입력된 DNA를 통해 농축 해야 하 고 각 히스톤 수정 epigenetic 프리 (그림 4A)의 특정 구성 요소를 나타내는 고유한 프로필을 표시 한다. 그 어떤 조직에 있을 것입니다 칩 seq 신호를 어둡게 수 있는 배경 잡음의 높은 수준이 가능 하다. 이 경우, 입력된 뺀된 중요 파일을 생성 하 고 다시 게놈 브라우저에서 시각화 하는 것이 좋습니다. Chromatin 상태 프로필을 확인, 우리는 ChromHMM 알고리즘24를 이용 한다. ChromHMM는 가장 눈에 띄는 다시 발생 조합 식별 하기 위해 복수 숨겨진 마르코프 모델을 사용 하 고 공간 chromatin 패턴 히스톤 수정에 따라 공부 (그림 5). 이러한 6 수정을 사용 하 여 ChromHMM 식별 polycomb 억압 (상태 1) heterochromatic 억압 (주 5), 활성 전사 (주 8 및 9) 같이 억압 및 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태와 활성 증강 인자 (주 13와 14) ChromHMM에서 출력 추가 다운스트림 분석을 위해 사용 될 수 있는 각 상태에 대 한 세그먼트 침대 파일을 포함 합니다.
그림 1: 칩 모듈에 대 한 작업 흐름. Biopsied 종양 조직은 먼저 분리 하 고 단백질 DNA 상호 작용을 캡처 했더라도. 조직 염색 질 조각을 immunoprecipitation 적합을 얻기 위해 sonicated 다음은 고 히스톤 DNA 단지 6 표시 된 항 체를 사용 하 여 침전 된다. 샘플 세차, 크로스 링크 반대 하 고 칩-DNA 정제 및 정량. 라이브러리는 순화 된 DNA에서 생성 하 고 고유 인덱스에 따라 멀티플렉스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 순화 된 칩-DNA 및 완성 된 라이브러리의 Electropherogram 분석. (A) 대표 electropherogram 정화 칩-DNA 포함 chromatin에서 라이브러리 준비에 적합 ~ 200-600 bp 파편. (B) 대표 electropherogram 증폭 및 멀티플렉싱 및 NGS 적합 양면 상자성 크기 선택 후 완료 된 도서관에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 칩 seq 데이터 처리 모듈에 대 한 작업 흐름. 작업 흐름 표시 칩 seq 데이터 처리에 대 한 중요 한 단계 및 다운스트림 분석을 위한 준비. 그러나이 프로토콜에서 사용 하는 파이프라인 snakemake를 사용 하 여 생성 했다,, 각이 단계도 수행할 수 있습니다 설명 하는 대로 개별적으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 히스톤 수정 칩 seq 추적의 게놈 브라우저 보기. A) 칩 seq 트랙 NRAS 로커 스 대표 흑색 종 종양 샘플에서을 둘러싼 활발 하 고 억압 된 영역을 표시 하는 deeptools에 의해 생성 된. NRAS, CSDE1 같은 유전자는 SIKE1 모든 활성 히스톤 수정 (H3K27ac, H3K4me3 및 H3K4me1) 및 활성 전사 (H3K79me2)와 관련 된 측면에 서는 유전자 AMPD1, DENND2C, 및 SYCP1 polycomb 억압 적인 마크 H3K27me3를 포함 하 고 하지 않는 반면 활성 전송 포함 되어 있습니다. B) 칩 seq 트랙 흑색 종 종양 샘플 ZNF 유전자 대표에 걸쳐 태세 섬으로 표시 하는 deeptools에 의해 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 흑색 종 종양 샘플을 기반으로 ChromHMM 모델. 6 히스톤 수정에 따라 15-상태 LearnModel에서 방출 프로 파일을 공부 했다. ChromHMM 식별 polycomb 억압 (주 1), heterochromatic 억압 (주 5), 활성 전사 (주 8 및 9) 활성 증강 등 억압 및 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태 (State13 14 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 chromatin 주에서 인간의 종양 조직 및 세포의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 높은 처리량 칩 seq 모듈을 설명합니다. 어떤 칩 seq 프로토콜에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 특이성입니다. 여기,이 메서드는 설명된 6 히스톤 수정, 모두 칩 등급 및 이전에 우리와 다른 실험실42,,4445 에 검증에 대 한 immunoprecipitation 조건 설명 . 동일한 항 체 농도 다른 다양 한 종양 종류에 성공적으로 적용 된, 하는 동안 그것은 관심27의 다른 요소를 공부 하는 경우 항 체 특이성을 결정 하는 중요 한.
성공적인 실험에 대 한 또 다른 주요 측면 쥡니다 조건의 최적화를 포함 한다. 쥡니다 시간과 샘플 및 조직 유형 사이 둘 다 다를 수 있습니다 그에 따라 조정 될 수 있다. 적절 한 최적화에 대 한 재판 실행 쥡니다 시간을 점진적으로 증가 하 고 지속적으로 조각 크기를 검사 하 여 각 샘플에 대 한 수행 됩니다. 초기 칩 실험에 대 한 염색 질 조각을 해야 최적의 immunoprecipitation에 대 한 200 ~ 1000 bp 사이 고 정화 칩-DNA 도서관 준비를 진행 하기 전에 계량 한다. 최적의 생성 및 증폭 된 DNA의 보존을 보장 하는이 단편 크기 (200 ~ 600 bp)를 멀티플렉싱 및 NGS 사용 될 것 이다. 높은 처리량으로 이러한 실험을 수행 하는 경우 시퀀싱에 대 한 레인 당 ~ 8 샘플 수영장 다중화에 대 한 좋은 시작 지점이입니다. 이 양의 샘플 얕은 시퀀싱 깊이 생성 될 수 있습니다, 하는 동안 계속 하기 전에 항 체 품질을 테스트 하기 위한 유용 합니다. 여러 샘플 풀링 병목 게시물 시퀀싱 같지 않은 범위입니다. 그러나 일반적으로 fluoremetric 따라 정량은 사용 되는 방법,, 많은--번 아니다 각 도서관에서 시퀀싱 준비 분자에 해당. 라이브러리 DNA의 정량에 대 한 가장 좋은 방법은 정량 기준을 만든의 pre-determined 시퀀싱 준비 DNA 분자를 사용 하 여 활용 하는 것입니다.
칩 Seq 데이터 집합 분석에 또 다른 중요 한 단계는 데이터 처리를 시퀀싱 포스트는. 중요 한 것은, 다운스트림 분석의 어떤 양상 든 지에 진행 하기 전에 먼저 충족 해야 하는 다양 한 품질 관리 통계가 없습니다. FastQC 프로그램 패스의 형태에서 원시 fastq 연속 읽기의 품질에 대 한 정보를 제공 하거나 테스트 실패. Fastq 읽기 통계의 대부분을 통과 해야, 하는 동안 더 중요 한 테스트의 일부 시퀀스 기본 품질 시퀀스 품질 평가 점수, 그리고 어댑터 오염 당 당 기본 통계를 포함 합니다. FastQC 처리 읽기 인간 게놈에 정렬 되 고 한 불일치의 최대 ~ 50-80%의 비율로 한다. 가격 낮은 보다 50% 칩, 도서관 준비 또는 시퀀싱에에서 문제를 나타낼 수 있습니다 및 오염, 낮은 품질 칩-DNA 또는 PCR 동안 오버 증폭 포함 될 수 있습니다. 샘의 BAM 파일 변환, 동안 중복 읽기 먼저 표시 해야 하 고 이후 다운 샘플링을 진행 하기 전에 SAMBLASTER를 사용 하 여 제거. 어느 정도의 중복은 PCR 동안 정상, 복제의 높은 수준의 일반적으로 나타내는 낮은 품질 칩-DNA, 또는 도서관 준비에 문제가 있습니다. FastQC, bowtie, 및 samblaster (flagstat에 결합)에서 출력 수 모든 모든 품질 관리 결과의 완전 한 대화형 요약을 제공 하는 MultiQC로 전달 될. MultiQC는 fastqc, bowtie, 및 samblaster 기본 통계, 맞춤 비율, PCR 이중 요금에 관한 정보를 제공 하는 것은 각각의 출력 파일에서 품질 관리 통계를 표시 합니다.
다음 그리고 아마 가장 중요 한 단계 다운 샘플링 정규화 후 데이터 시각화 사용 하는 예: IGV 또는 UCSC 게놈 브라우저. 각 히스톤 수정 후 성적인 규정 풍경, H3K27ac를 포함 하 여의 주요 구성 요소를 나타냅니다 (강화), H3K4me1 (활성 및 태세 강화), H3K4me3 (발기인), H3K79me2 (복사할 영역), H3K27me3 (polycomb 억압), 그리고 H3K9me3 (heterochromatic 억압). 혼자 또는 조합에서 이러한 표시를 사용 하 여 이러한 히스톤 활성, 태세 또는 억압 된 강화 및 발기인, 뿐만 아니라 지역 코딩의 transcriptional 상태를 확인할 수 있습니다. 이 억압 하 고 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태 확인 되었다 ChromHMM를 사용 하 여 시연 했다. 이러한 상태는 활성 증강 (H3K4me1 및 H3K27ac) 처럼 조합 부호 뿐만 아니라 polycomb 억압 (H3K27me3), hetrochromatic (H3K9me3), 억압과 활성 전사 (H3K79me2) 처럼 단 수 부호에 의해 정의 되었고 변하게 강화 제 (H3K4me1, H3K27ac 및 H3K79me2)
제시 통합된 플랫폼은 히스톤 또는 조직 샘플에서 녹음 방송 요인의 인의 결정에 적합. 우리는 성공적으로 생 검-크기 흑색 종 샘플에서 상기 6 마크의 점령의 결정에 대 한이 프로토콜을 활용 하 고. 그러나, 우리는 여전히 결정 되지 때문에 depenedent는 조직 유형으로 사용할 수 있는 항 체에 성공적인 칩 Seq 응용 프로그램에 필요한 조직의 최저 금액. 또한, 비록 우리가 정기적으로이 냉동 신선한, 플래시에 프로토콜 및 샘플을 동결 하는 10 월 활용, 우리가 하지 FFPE 직물에 대 한이 프로토콜을 최적화 했습니다. 일부 최근 연구 프로토콜 같은 조직46,47 에 대 한 보고 하 고 거기에 제안 된 변경 사항을 제시 플랫폼 FFPE 직물에서 도움이 될 것입니다 여부를 테스트 하기 위해이 플랫폼의 프레임 워크에 통합 될 수 있다. 우리는이 임상 시험에서 환자에서 얻은 임상 자료에서 chromatin 상태 패턴의 결정에 매우 도움이 될 것입니다 믿습니다. 전반적으로,이 프로토콜 설명 인간의 종양 조직, chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 칩 seq 모듈 쉽게 성공적인 실험에 대 한 필요한 구성 요소를 모두 포괄 하는 지시를 따릅니다.
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Disclosures
저자 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 마커 스 코일, Curtis Gumbs, 시퀀싱 지원에 대 한 MDACC에서 SMF 핵심을 감사합니다. 이 문서에서 설명 하는 작업 SMF 코어 NIH 그랜트 (CA016672)에서 교부 금에 의해 지원 되었다와 NCI K. R. (1K99CA160578 및 R00CA160578) 수상
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma - Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA - IgG-free | Sigma - Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag - 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
References
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