Summary
Aquí, describimos un protocolo de secuencia de ChIP de alto rendimiento optimizado y tubería de análisis computacional para la determinación de patrones de estado de todo el genoma cromatina de líneas celulares y tejidos del tumor congelado.
Abstract
Modificaciones de las histonas constituyen un componente importante del epigenoma y desempeñan importantes funciones reguladoras para determinar el estado transcripcional de loci asociados. Además, la presencia de modificaciones específicas se ha utilizado para determinar la posición y elementos funcionales no codificante de identidad como potenciadores. En los últimos años, seguida por la secuencia de generación siguiente (ChIP-seq) de inmunoprecipitación de cromatina se ha convertido en una poderosa herramienta en la determinación de los perfiles de genoma de modificaciones de las histonas individuales. Sin embargo, se ha vuelto cada vez más claro que los patrones combinatorios de modificaciones de la cromatina, denominados Estados de cromatina, determinan la identidad y la naturaleza del locus genómico asociado. Por lo tanto, los flujos de trabajo de sólidas metodologías de (HT) de alto rendimiento para perfilar una serie de marcas de modificación de las histonas, así como tuberías de análisis computacional capaces de manejar miríadas de ChIP-Seq perfiles conjuntos de datos, son necesarios para determinación integral de epigenómica Estados en gran número de muestras. Flujo de trabajo de la HT-ChIP-Seq presentada consta de dos módulos: 1) un protocolo experimental para perfilar varias modificaciones de la histona de pequeñas cantidades de muestras tumorales y líneas celulares en un formato de 96 pozos; y 2) una tubería de análisis computacional de datos que combina las herramientas existentes para calcular combinatoria cromatina estado patrones y ocupación de cada marca. Juntos, estos dos módulos facilitan el fácil procesamiento de cientos de muestras de ChIP-Seq en forma rápida y eficiente. El flujo de trabajo que presentamos se utiliza para derivar patrones de cromatina estado de 6 perfiles de marca de las histonas en melanoma tumores y líneas celulares. En general, se presenta un flujo de trabajo de ChIP-seq integral que puede aplicarse a decenas de muestras de tumores humanos y líneas celulares de cáncer para determinar aberraciones epigenómicas en varias malignidades.
Introduction
La mayoría de los genomas mamíferos (98-99%) se compone de secuencia codifica, y estas regiones nocoding contienen elementos reguladores que participan en el control de la expresión génica y cromatina organización1,2. En una célula normal, el conjunto específico de la DNA genomic en estructura de la cromatina compactada es crítico para la organización espacial, la regulación y sincronización precisa de diversos procesos asociados de ADN3,4,5. En una célula cancerosa sin embargo, modificaciones de la cromatina por mecanismos epigenéticos aberrantes pueden llevar a la inadecuada organización de la estructura de la cromatina, incluido el acceso a elementos reguladores, sistemas de bucles cromosómicos y gene expresión patrones6, 7,8,9,10.
A pesar de los avances recientes, hemos limitado entendimiento de las alteraciones epigenéticas que se asocian a progresión del tumor o la respuesta terapéutica. El epigenoma consiste en una serie de modificaciones, incluyendo marcas de histonas y la metilación del ADN, que forman colectivamente un estado dinámico (denominado estado de cromatina) que inmiscuye en redes de expresión de genes y otros procesos críticos para el mantenimiento de identidad celular. Recientemente, alteraciones en potenciadores se han demostrado en múltiples neoplasias malignas mediante el estudio de perfiles de H3K27Ac11. Aunque tales estudios proporcionan la penetración en la correlación de las marcas epigenéticas aisladas, más de 100 modificaciones epigenéticas han sido identificados12,13 sin el claro entendimiento de sus papeles biológicos y interdependencia. Además, hay un número aún mayor de posibles patrones combinatorios de estas histonas y ADN modificaciones y es estos patrones combinatorios - modificaciones no individuales - que dictan Estados epigenéticos14. Por lo tanto, hay una tremenda necesidad de identificar alteraciones en estos Estados de cromatina durante la progresión del cáncer o la respuesta a la terapia. Amplio conocimiento de las alteraciones del epigenoma en cánceres ha sido rezagadas en parte debido a la técnica (por ejemplo, generación de datos a gran escala de pequeña cantidad de células solo material clínicas) y analíticos (por ejemplo, algoritmos para definir problemas de combinatoria de Estados). Por lo tanto, hay una necesidad crítica de métodos robustos de alto rendimiento para perfiles de gran número de marcas de modificación de las histonas de material clínico y fácil de implementar enfoques computacionales para predecir patrones combinatorios que facilitará determinación de Estados epigenéticos asociados a diferentes etapas de la tumorigénesis y resistencia a la terapéutica. Además, datos recientes epigenoma perfilado estudios15,16,17,18,19,20,21, 22,23 en tejidos normales y líneas celulares puede ser integrado con los perfiles de la cromatina de tumores para mayores revelaciones en el epigenoma contribución a la biología del tumor.
Cromatina de perfiles se ha convertido en una poderosa herramienta para la identificación de los patrones de enlace global de diferentes modificaciones de la cromatina15,24. En los últimos años, ChIP-seq se ha convertido en el "gold standard" para el estudio de las interacciones DNA-proteína en una escala global25,26,27. Para cualquier experimento de ChIP-seq, son pasos críticos necesarios para su éxito, incluyendo la disociación y el procesamiento de tejido, determinar condiciones óptimas de sonicación, determinar la concentración óptima del anticuerpo para precipitación, preparación de la biblioteca, la secuencia de procesamiento de datos y posteriores análisis. Cada uno de estos pasos contienen puntos clave de control de calidad y en conjunto, son crucial para correctamente identificar posibles objetivos para la validación funcional. A través de la innovación en estos pasos, varios estudios anteriores han desarrollado metodologías para realizar el ChIP o ChIP-Seq de pequeña cantidad de tejidos28,29,30,31,32 . Además, algunos estudios han sugerido protocolos para experimentos de ChIP de alto rendimiento seguidos de PCR basado en la cuantificación de33,34. Finalmente, algunas plataformas de análisis disponible públicamente para ChIP-Seq datos ahora están disponibles como Easeq35 y36de la galaxia. Sin embargo, ha faltado una plataforma integrada para realizar ChIP-Seq en un modo de alto rendimiento en combinación con una tubería computacional para realizar la sola marca así como el análisis del estado de cromatina.
Este protocolo describe un flujo completo e integral de ChIP-seq para el mapeo del genoma de Estados de la cromatina en los tejidos del tumor y líneas celulares, con fácil seguir las pautas que abarca todos los pasos necesarios para un exitoso experimento. Mediante la adopción de un método de alto rendimiento previamente descrito por Blecher-Gonen et al. 37, este protocolo puede realizarse en decenas de muestras en paralelo y se ha aplicado con éxito en líneas celulares de cáncer y tumores humanos como melanoma, colon, próstata y multiforme del glioblastoma. Se demuestra la metodología de seis modificaciones de las histonas del core que representan componentes claves del paisaje regulación epigenético en líneas celulares de melanoma humano y muestras tumorales. Estas modificaciones incluyen H3K27ac (potenciadores), H3K4me1 (potenciadores activos y listos), H3K4me3 (promotores), H3K79me2 (transcrito regiones), H3K27me3 (polycomb represión) y H3K9me3 (heterochromatic represión). Estas marcas pueden utilizarse solo o en combinación para identificar Estados de cromatina funcionalmente distintas que representan ámbitos represivos y activadas.
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Protocol
Todas las muestras clínicas se obtuvieron siguiendo las directrices de la Junta de revisión institucional.
1. preparación de buffer
- Hacer 200 mL de buffer TE (10 mM Tris-HCl, 10 mM etilendiaminotetracético (EDTA) el ácido pH 8.0).
- Hacer 200 mL de tampón de STE (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl).
- Hacer 200 mL de glicina de 2,0 M (37,52 g de glicina en 200 mL de agua) y calentar a 65 ° C.
- Hacer 200 mL de solución al 5% sodio desoxicolato (DOC) (10 g de DOC en 200 mL de agua).
- Tomar 500 mL de tampón de cosecha del ChIP (12 mM de Tris-Cl, 0.1 x tampón fosfato salino (PBS), EDTA, 0,5% sodio dodecil sulfato (SDS) de 6 mM).
- Tomar 500 mL de tampón de dilución de ChIP (10 mM Tris-Cl 140 mM NaCl, 0,1% DOC, 1% Triton-X, 1 mM EDTA).
- Tomar 500 mL de tampón de lavado RIPA (STE, 1% Tritón x-100, 0.1% SDS, 0.1% DOC).
- Tomar 500 mL de tampón de lavado RIPA/500 (almacenador intermediario RIPA + 360 mM NaCl).
- Tomar 500 mL de tampón de lavado LiCL (TE, 250 mM LiCl, 0.5% NP-40, 0.5% DOC).
- Tomar 500 mL de tampón de elución directo: 10 mM Tris-Cl de pH 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM de NaCl, 0.5% SDS.
- Tomar 50 mL de tampón de unión de anticuerpo/bloqueo (PBS + 0,1% TWEEN-20 + 0.2% IgG libre BSA).
2. tejido celular/línea de procesamiento y cross-linking
- Si el tejido es flash congelado, dethaw en el hielo antes de la disociación.
- Se desasoció manualmente en 2 mL de Hanks balanceada sal solución (HBSS) utilizando una hoja de afeitar estéril 50 mg de tejido (~ 8 mg por anticuerpos modificación de histonas). Moler el tejido en trozos de 3 a 4 milímetros aproximadamente 5 minutos en una placa de cultivo de tejido estéril.
- Transfiera la solución HBSS y tejido en un tubo de disociador y añadir otros 8 mL de HBSS. Más desasociar el tejido usando un disociador hasta homogeneizada.
- Para los tumores de melanoma, coloque los tubos en un disociador y ejecute los siguientes ciclos cada uno una vez en este orden: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 y m_heart_02.01.
- Rascado 21 × 106 células en 10 mL de medio (~ 3 × 106 por modificación de las histonas y entrada; puede ser bajada a 100.000 células por marca para poblaciones raras) crecido en una cultura de tejido estándar plato y recoger en un tubo cónico de 15 mL.
Nota: Los medios utilizados para la línea celular de melanoma representante WM115 son DMEM suplementado con 10% suero bovino Fetal y 5% de penicilina/estreptomicina. - Reticulación las células del tejido/usando una concentración de 1% de formaldehído final mediante la adición de 200 μL de formaldehído al 16% por 3 mL HBBS en tejido (o 3 mL de medio para las células). Agite la mezcla en 10 rpm, con un mezclador de exactamente 10 min a 37 ° C.
PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y debe manejarse en una campana de humos adecuada. - Añadir 200 μL de 2,0 M de glicina por cada 3 mL de muestra y continuar agitando a 10 rpm durante otros 5 minutos a 37 ° C.
Nota: Glicina actúa como un extintor. Hacer solución de glicina fresco cada mes como el pf del pH que la solución tiende con el tiempo. - Girar las muestras a 934 x g durante 5 min a 4 ° C utilizando una centrífuga de sobremesa. Quite el sobrenadante, agregar 5 mL de hielo frío PBS, centrifugar las muestras otra vez a 934 x g y quite el sobrenadante.
- Flash congelar la pelotilla y almacenar a-80 ° C para su posterior procesamiento.
3. tejido lisis, sonicación y anticuerpo
- Disolver 1 tableta de inhibidor de la proteasa por 10 mL de tampón de cosecha de ChIP.
- Añadir 300 μL de tampón de cosecha ChIP con inhibidores de la proteasa por 50 mg de tejido y dejar 30 min de lisis en hielo.
Nota: Agregar 300 μL de tampón de cosecha ChIP con inhibidores de la proteasa por 1 X 107 de WM115 líneas celulares de melanoma. - Mientras que las células son lisis, encender el el disruptor del baño de agua y sistema de enfriamiento asociado y permitir que la temperatura a 4 ° C. Colocar los tubos del sonicador en el interruptor del baño de agua y someter a ultrasonidos los tejidos de melanoma para 60 ciclos en 30 s s on y 30 para obtener fragmentos de cromatina de ~ 200-600 pares de bases (bp).
Nota: Tiempo de sonicación puede diferenciar entre el tipo de tejido y debe ajustarse en consecuencia. Esto es un paso crítico y debe ser optimizado en el experimento piloto antes de proceder a inmunoprecipitación. - Durante la sonicación, lavar 20 μl de bolas magnéticas de proteína G por anticuerpos por ejemplo tres veces con 1000 μl de tampón de Unión/bloqueo (PBS 0,1% TWEEN-20 + 0.2% BSA).
- De 8 mg de tejido de melanoma, incubar 3 μg de cada anticuerpo de histonas en 100 μl de la encuadernación / bloqueo de buffer por 2 h a 4 ° C con rotación con un revólver de tubo. 12 muestras para un anticuerpo singular contienen 240 μl de granos, 36 μg de anticuerpo y 1200 μl de tampón de Unión/bloqueo.
Nota: Para 3 x 106 células, utilice 5 μg de cada anticuerpo y 30 μl de granos magnéticos G de proteínas por anticuerpo. Anticuerpos y proteínas G perlas deben titularse si se usa diferente cantidad de tejido. Este protocolo ilustra las condiciones de la inmunoprecipitación de las descrito seis modificaciones de la histona (Tabla de materiales), sin embargo, las concentraciones de anticuerpos deben ser optimizadas para otras modificaciones y factores de transcripción. - Para determinar el tamaño del fragmento, quitar 20 μl de solución de cromatina sonciated y añadir un tampón de elución master mix (temperatura ambiente) que contiene 44 μl de elución directa tampón, 1 μl de Rnasa (20mg/mL) y 5 μl de proteinasa K (20mg/mL) por muestra. Incubar las muestras en un termociclador de PCR durante al menos 2 h a 50 ° C. Purificar la muestra usando un kit de purificación PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Asegúrese de cromatina es suficientemente cortada mediante la determinación del tamaño del fragmento utilizando un instrumento de electroferograma de ADN de alta sensibilidad antes de proceder al paso 3.6. Encienda el instrumento electroferograma.
- Cargar 2 μl del reactivo buffer de alta sensibilidad en cada pocillo de una tira de tubo óptico de 8 pozos. Cargar 2 μl de escalera de alta sensibilidad en el primer pozo y 2 μl de purificada muestras en los pozos restantes.
- Coloque los tapones de tubo óptico en stips del tubo y agitar las muestras a 2000 rpm durante 1 minuto, abra la tapa e inserte una nueva alta sensibilidad pantalla cinta y caja de puntas de carga. Retire los tapones de la tira y cargar las muestras en el electroferograma instrumento.
- Abra el software de análisis, destacar los trece primeros espacios en la cinta de la pantalla y pulse la ficha Inicio en la esquina inferior derecha. Fragmentos de cromatina entre ~ 200-1000 bp son convenientes para el ChIP.
- Transferir la solución sonicada a tubos estériles y centrifugar los tubos a 21.130 x g utilizando una centrífuga de mesa para 15 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a tubos nuevos.
- Determinar el volumen total del sobrenadante y eliminar el 10% de la solución total para control de entrada y almacenar a 4 ° C.
4. inmunoprecipitación de cromatina
- Disolver 2 pastillas de inhibidor de la proteasa por 20 mL de tampón de dilución de la viruta.
- Después de la sonicación diluir la muestra restante 5 veces usando el tampón de dilución de ChIP para llevar los niveles de SDS al 0.1%. Diluir 270 μl de sobrenadante restante con 1080 μl de tampón de dilución de viruta para obtener un volumen total final de 1350 μl.
- Cuando finaliza la incubación del anticuerpo y la proteína G de perlas magnéticas, coloque el tubo en un imán y eliminar el sobrenadante.
- Con el tubo todavía sentado en el imán, lavar los granos una vez añadiendo 750 μl de tampón de dilución de ChIP con inhibidores de la proteasa.
Nota: Es importante no molestar a los granos o rotar los tubos durante este paso. - Retire el ChIP de tampón de dilución de lavar y resuspender los granos en 240 μl del buffer de dilución de ChIP mismo. Alícuota 20 μl de granos en 12 tubos separados, cada uno de ellos se utiliza para una muestra de tejido separado.
- Alícuota del sonicado material uniformemente a granos de proteína G con el anticuerpo específico y secado con un revólver de tubo durante la noche a 4 ° C.
5. lavado y reversa reticulación de complejos DNA-proteína Immunoprecipitated
- A la mañana siguiente después de la reticulación inversa, transferir la solución de anticuerpo proteína a una placa de 96 pocillos y colóquelo en el soporte magnético. Permiten los granos a adherirse para por lo menos 30 s y eliminar el sobrenadante.
- Lavar los granos 5 veces con 150 μL de tampón de lavado RIPA helado utilizando una pipeta multicanal. Durante los pasos de lavado, do no pipetee los granos, pero el imán se mueven continuamente de derecha a izquierda para 30 s por lavado.
- Lavar las muestras dos veces con 150 μL de tampón de lavado RIPA-500 helado.
- Lavar las muestras dos veces con 150 μL de tampón de lavado LiCl helado.
- Lavar las muestras una vez con 150 μL de tampón de lavado TE helado y elimine el tampón TE inmediatamente. Este paso puede omitirse para aplicaciones de entrada baja.
- Añadir control de entrada de paso 3.7 en frescos pocillos de la placa de 96 pocillos que contienen las muestras de ADN de ChIP.
- Tras los pasos de lavado, añadir una elución búfer principal mezcla (temperatura ambiente) que contiene 44 μl de tampón de elución directa, 1 μl de Rnasa (20mg/mL) y 5 μl de proteinasa K (20mg/mL) por viruta y entrada de muestra para la reticulación inversa.
- Incubar las muestras utilizando a un termociclador PCR durante 4 h a 37 ° C, 4 h a 50 ° C y 8-16 h a 65 ° C.
6. purificación y cuantificación de ADN precipitado
- La mañana siguiente, lugar las muestras hacia el imán y transferencia flotante una nuevo placa de PCR de 96 pocillos que contiene immunoprecipitated ADN.
- Agregar 2.3 x granos paramagnéticos solución (115 μL para 50 μl de solución) y cuidadosamente pipetee arriba y abajo 25 veces usando una pipeta multicanal. La solución se volverá homogénea si se mezcla correctamente.
- Incubar la solución a temperatura ambiente fuera el imán durante 4 min lugar las muestras detrás en el imán e incuban a temperatura ambiente durante 4 minutos otro descarte el sobrenadante.
- Dejando las muestras en el imán, agregar 150 μL de etanol al 70% (vol/vol) e incubar a temperatura ambiente durante 30 s sin molestar a los granos.
- Eliminar el etanol y repetir el lavado. Seque los granos paramagnéticos al aire en el imán durante 5 minutos.
Nota: Retire el etanol después del segundo lavado como etanol restantes interferirán con la purificación. - Retirar las muestras del imán y añadir 30 μl de 10 mM de Tris-Cl de pH 8.0. Mezclar mediante pipeteo 25 veces e incubar las muestras a temperatura ambiente fuera el imán durante 4 minutos.
- Coloque las muestras en el imán e incubar a temperatura ambiente para otro 4 min. traslado 20 μl de cada muestra en una nueva placa de 96 pocillos para la preparación de la biblioteca. Tienda los restantes 10 μl de DNA ChIP en caso de cualquier problema potencial con la generación de las bibliotecas.
- En esta etapa, cuantificar los ChIP de ADN antes de la preparación de la biblioteca. La concentración de DNA se mide con reactivos de ADN de alta sensibilidad. Determinar la distribución del tamaño de ADN precipitado usando un procedimiento de instrumento de alta sensibilidad ADN electroferograma paso 7.1.
7. Biblioteca generación utilizando el NEBNext Ultra II biblioteca preparación Kit de DNA
- Generar bibliotecas para secuenciación de NGS con preparación de biblioteca de ADN siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Todas las reacciones se realizan en placas de 96 pocillos e incubaciones se llevan a cabo en un termociclador de PCR con la tapa temperatura > 100 º C y el volumen de 50 μl.
- Para los índices, se utilizan Oligos Multiplex para plataforma NGS. Realizar un total de 10 x ciclos para la amplificación de la polimerización en cadena con la siguiente configuración: desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s, desnaturalización a 98 ° C por 10 s, recocido y extensión a 65 ° C para 30 s (10 x ciclos), extensión final 65 ° C durante 5 minutos y mantener a 4° C.
Nota: La tabla 1 contiene los cebadores utilizados para la amplificación por PCR. - Después de la amplificación por PCR, retirar las muestras y volumen total a 100 μl con agua libre de nucleasa. Realizar selección de doble cara tamaño paramagnética (0.55x/0.8x) primera agregando 55 μl de granos y mezclar mediante pipeteo 25 veces. Incubar las muestras a temperatura ambiente fuera el imán durante 4 minutos.
- Coloque las muestras en un imán e incubar a temperatura ambiente durante otros 4 minutos. Este paso se utiliza para retener grandes fragmentos en las cuentas que no son adecuadas para la secuencia.
- Transferir el sobrenadante a una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Desechar el sobrenadante que contiene el ADN parcialmente purificado.
- Añadir otro 25 μl de perlas paramagnéticas y mezclar mediante pipeteo 25 veces e incubar a temperatura ambiente fuera el imán durante 4 minutos.
- Coloque las muestras en el imán e incubar a temperatura ambiente durante otros 4 minutos y descartar el sobrenadante. Este paso se utiliza para retener los fragmentos de ~ 200 a 600 bp que se utilizarán para finalizado de bibliotecas.
- Dejando las muestras en el imán, añadir 150 μL de etanol al 70% (v/v) y dejar incubando por 30 s sin molestar a los granos (no se mueven mientras que en el imán). Eliminar el etanol y repetir el lavado una segunda vez.
- Permiten que los granos paramagnéticos al aire seco en el imán para 5 minutos Retire todos etanol después del segundo lavado como etanol restantes interferirán con la purificación.
- Extraer las muestras del imán y añada 25 μl de 10 mM de Tris-Cl de pH 8.0. Mezclar mediante pipeteo 25 veces e incubar a temperatura ambiente fuera el imán durante 4 min lugar las muestras de nuevo el imán e incuban a temperatura ambiente durante otros 4 minutos.
- Cuantificar las bibliotecas usando un instrumento de alta sensibilidad ADN electroferograma antes de multiplexación para tamaños son adecuados para la secuencia. Bibliotecas completadas oscilan entre 200-600 bp y están desprovistos de los dimeros de primer.
Nota: Si es necesario, otro 0,7 x purificación grano paramagnético se realiza para eliminar dímeros de primer no deseados que están presentes en ~ 130 bp. - Piscina de la DNA cuantificada basada en primers de índice único según concentración. Para una piscina que contiene seis muestras con concentraciones entre 1 ng/μl y 6ng/μl, la distribución es 15 μl de la muestra menor y 2.5 μl de la muestra más alta. Esto se hace para asegurar leer cuentas se distribuirá uniformemente en cada carril de la célula de flujo.
8. post procesamiento de datos de ChIP-seq
- Una tubería basada en snakemake38,39 se utiliza para proceso de todos de los siguientes pasos en un solo comando. Lo importante, cada uno de estos pasos se discuten individualmente con comandos asociados.
- Determinar la calidad del crudo fastq secuenciación Lee usando FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): abrir el terminal de unix y cambie el directorio (cd) a la carpeta que contiene los archivos raw fastq para cada una de las seis modificaciones de histonas. En el tipo de terminal unix, fastqc *fastq.gz y pulse [volver]. Esto ejecuta mediciones de control de calidad en todos los archivos en la carpeta de la fastq.
- Calidad lee el genoma de referencia de alinear y eliminar duplicados antes de compresión para archivos de bam. Esto se realiza utilizando bowtie versión 1.1.239SAMBLASTER versión 0.1.2140y SAMTOOLS versión 1.3.141: en el unix tipo de terminal, bowtie -m 1 - n 1--mejor--estratos -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | samtools ve -Sb - > histone1.bam y pulse [volver].
Nota: ruta_destino indica la carpeta que contiene el conjunto de genoma humano hg19. Esto va a cambiar dependiendo del organismo de interés. - Ordenar archivos de bam con SAMTOOLS con el siguiente comando: en el tipo de terminal unix, samtools clase histone1.bam -m 2G-5 -T histone1.temp -o histone1.sorted y prensa [volver].
- Indexar archivos de bam con SAMTOOLS con el siguiente comando: en el tipo de terminal unix, samtools índice histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai y pulse [volver].
- Determinar únicamente asignado y no alineado Lee con SAMTOOLS flagstat con el siguiente comando: en el tipo de terminal unix, samtools flagstat histone1.sorted.bam y pulse [volver].
- Normalizar archivos de bam por leerlas cuentas realizando un muestreo aleatorio con el siguiente comando: en el tipo de terminal unix, sambamba ver -f bam-submuestreo-semilla = 3 histone1.sorted.bam 0.X -s | samtools tipo m - 2G-5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam y prensa [volver].
- Indizar los archivos de bam con SAMTOOLS con el siguiente comando: en el tipo de terminal unix, samtools índice histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai y pulse [volver].
- Visualizar bibliotecas ChIP-seq en un browser del genoma (es decir. UCSC o IGV), generar archivos de bigwig con deepTools versión 2.4.040 por escalar los archivos bam lecturas por kilobase por millones (RPKM). Esto puede realizarse utilizando los siguientes comandos:
- Archivos de bigwig estándar: en el tipo de terminal de unix, bamCoverage -b histone1. downsample.Sorted.BAM--normalizeUsingRPKM--binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o histone1.bw y oprima {vuelta].
- Para la entrada de sustraer archivos bigwig: en el tipo de terminal de unix, bamCompare--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam--bamfile2 input1.downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--cociente restar - binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW y pulse [volver].
- Identificar ChIP-seq enriquecimiento de señal sobre fondo de "Entrada" mediante el análisis de modelo de ChIP-seq (MACS) versión 1.4.225,26 y versión 2.1.0. Utilice macs1 para los factores de "fuente puntual" H3K4me3, H3K4me1 y H3K27ac y macs2 para los factores de "gran fuente" H3K79me2, H3K27me3 y H3K9me3. Esto se realiza utilizando los siguientes comandos:
- Para el punto de origen: En el tipo de terminal unix, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5--nomodel--keep-dup todos los histone1.file - n y prensa [volver].
- Origen de la amplio: En el tipo de terminal de unix, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs - BAM -p 1e-6-f--amplio--corte amplio 1e-6--keep-dup toda histone1.file - n - nomodel y pulse [volver].
- Uso ChromHMM24 para identificar patrones de estado de cromatina combinatoria basada en las modificaciones de las histonas estudiadas usando los siguientes comandos:
- En el terminal de unix tipo cd ruta_destino/ChromHMM_folder y pulse [volver].
- Una vez en el tipo de directorio de ChromHMM java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt ruta_destino/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/ruta_destino/BinarizeBam_output y presione [RETURN].
- Tipo, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000 ruta_destino/BinarizeBam/ruta_destino directorio_de_salida 15 hg19 y presione [RETURN].
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Representative Results
Este protocolo permite la inmunoprecipitación de los tejidos del tumor congelado y líneas celulares que se pueden realizar en decenas de muestras en paralelo utilizando un método de alto rendimiento (figura 1A). Fragmentos de cromatina deben estar comprendida entre ~ 200-1000 bps para la inmunoprecipitación óptima. Hemos observado que el tiempo necesario para alcanzar la misma longitud de corte es diferente para diferentes tejidos y tipos celulares. El éxito de la viruta de pequeñas cantidades de tejido depende de mantener el frío lisado en todo momento especialmente durante la sonicación. Purificada de ChIP-DN de debían cuantificarse antes de proceder a la preparación de la biblioteca (figura 2A). Bibliotecas completadas convenientes para multiplexación y NGS deben oscila entre ~ 200-600 bp y estar desprovisto de cualquier dímeros de primer (figura 2B). En la secuencia, hay muchos parámetros de control de calidad que deben cumplirse antes de proceder a otras medidas de la tubería, tales como Mac llamada de pico o ChromHMM análisis (figura 3). Muchos de estos indicadores se pueden determinar mediante programas como FastQC y MultiQC. Calidad fastq Lee está alineado con el genoma humano a una velocidad de 50-80% con un máximo de un desajuste. Una profundidad de secuenciación recomendada es 10 millones asignados únicamente Lee para los factores de "fuente puntual" y 20 millones asignados únicamente Lee por "gran fuente" factores27,41,42,43. Indexadas y ordenados BAM archivos se utilizan para generar archivos de pez gordo que pueden visualizarse mediante un navegador de genoma como el IGV o UCSC. Muestras de chIP deben ser enriquecidas sobre ADN de entrada y cada modificación de histonas debe mostrar un perfil distinto que representa a un componente específico del paisaje epigenético (Figura 4A). Es posible que en algunos tejidos se produzca mayores niveles de ruido de fondo que puede oscurecer la señal de ChIP-seq. Si esto ocurre, se recomienda para generar archivos de bigwig resta entrada y volver a visualizar en un navegador de genoma. Para determinar perfiles de estado de cromatina, utilizamos el algoritmo de ChromHMM24. ChromHMM utiliza un modelo de Markov ocultos multivariado para identificar el más prominente vuelva a ocurrir combinatoria y patrones de cromatina espacial basados en las modificaciones de las histonas estudiaron (figura 5). Utilizando estas seis modificaciones ChromHMM identifica Estados de cromatina funcionalmente distintas que representan dominios represivos y activados, como represión de polycomb (estado 1), represión heterochromatic (estado 5), transcripción activa (estado de 8 y 9) y activos potenciadores (estado 13 y 14). La salida de ChromHMM incluye archivos de cama segmentado para cada Estado que más puede utilizarse para análisis posteriores.
Figura 1: flujo de trabajo para el módulo de ChIP. Tejido hecho una biopsia del tumor es primero se desvincularon y reticulado para capturar las interacciones DNA proteína. Tejido es entonces sonicado para obtener fragmentos de cromatina convenientes para la inmunoprecipitación y complejos histona-ADN se precipitan mediante los seis anticuerpos indicados. Las muestras se lavan, se invierten enlaces cruzados y ChIP de ADN purificado y cuantificado. Las bibliotecas son generadas a partir de ADN purificado y multiplexadas según índices únicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Electroferograma análisis de ADN purificado de ChIP y preparación de la biblioteca completa. (A) electroferograma representante de purificado DNA ChIP que contiene la cromatina fragmentos de ~ 200-600 bp que es adecuado para la preparación de la biblioteca. (B) electroferograma el representante de una biblioteca completa después de la amplificación y doble cara paramagnético preselección que es conveniente para la multiplexación y NGS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Flujo de trabajo para el módulo de procesamiento de datos del ChIP-seq. Flujo de trabajo mostrando pasos críticos para procesamiento de datos del ChIP-seq y preparación para análisis posteriores. La tubería utilizada en el presente Protocolo se generó mediante snakemake, sin embargo, cada uno de estos pasos también se puede realizar individualmente como se describe. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Vista de explorador de genoma de modificación de histonas ChIP-seq pistas. A) ChIP-seq pistas generadas por deeptools mostrando regiones activas y reprimidas que rodean el lugar geométrico de las ANR en una muestra de tumor melanoma representante. Genes como ANR, CSDE1 son SIKE1 están asociadas con todas las modificaciones de las histonas activa (H3K27ac, H3K4me3 y H3K4me1) y transcripción activa (H3K79me2), mientras que flanqueando genes AMPD1, DENND2C y SYCP1 contienen polycomb represivo marca H3K27me3 y no contienen la transcripción activa. B) chIP-seq pistas generan por deeptools mostrando punto de heterocromatina en genes ZNF en representante muestra tumor de melanoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : ChromHMM el modelo basado en muestras tumorales de melanoma. Estudios de Perfil de la emisión de una LearnModel de 15 Estados basada en las seis modificaciones de histonas. ChromHMM identifica Estados de cromatina funcionalmente distintas que representan dominios represivos y activados, como represión de polycomb (estado 1), represión heterochromatic (estado 5), transcripción activa (estado de 8 y 9) y activos potenciadores (State13 y 14 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un módulo de ChIP-seq alto rendimiento completo e integral para la asignación de todo el genoma de Estados de cromatina en líneas celulares y tejidos del tumor humano. En cualquier protocolo de ChIP-seq, uno de los pasos más importantes es la especificidad del anticuerpo. Aquí, este método ilustra las condiciones de la inmunoprecipitación de las describe seis modificaciones de las histonas, las cuales son de ChIP-grado y han sido previamente validadas en nuestro y otros laboratorios42,44,45 . Las mismas concentraciones de anticuerpos se han aplicado con éxito a otros tipos de tumor, pero es importante para determinar la especificidad del anticuerpo si estudiando diversos factores de interés27.
Otro aspecto clave para un exitoso experimento incluye la optimización de las condiciones de sonicación. Tiempo de sonicación puede variar tanto entre el tipo de muestra y el tejido y debe ser ajustada en consecuencia. Para la correcta optimización, un funcionamiento de ensayo se realiza para cada muestra progresivamente aumentar el tiempo de sonicación y continuamente comprobando el tamaño del fragmento. Para el experimento inicial de ChIP fragmentos de cromatina deben estar comprendida entre ~ 200-1000 bp para la inmunoprecipitación óptima y ChIP-DNA purificado debe cuantificarse antes de proceder a la preparación de la biblioteca. Este tamaño de fragmento asegura óptima generación y retención de la DNA amplificada (~ 200 a 600 bp) que se utilizará para la multiplexación y NGS. Si realizar estos experimentos en un modo de alto rendimiento, un buen punto de partida para la multiplexación es ~ 8 muestras por carril para la secuencia de la piscina. Mientras que esta cantidad de muestras puede producir una profundidad superficial de la secuencia, es útil para probar la calidad de anticuerpos antes de proceder. Uno de los cuellos de botella de la agrupación de varias muestras es desigual cobertura post secuencia. Generalmente un método de fluoremetric en base de la cuantificación se utiliza, sin embargo, muchos a veces no es equivalente a moléculas de secuenciación-listo en cada biblioteca. El mejor método para la cuantificación de ADN de la biblioteca es utilizar qPCR utilizando normas hecho de determinado secuenciación listo para moléculas de ADN.
Otro paso crítico en el análisis de conjunto de datos del ChIP-Seq es post-secuenciación procesamiento de datos. Lo importante, antes de proceder a cualquier aspecto de análisis aguas abajo hay varios indicadores de control de calidad que deben cumplir la primera. Programas como FastQC se proporciona información sobre la calidad de crudo fastq secuenciación lee en forma de pase o no pruebas. Mientras la Lee fastq debe pasar la mayoría de las métricas, algunas de las pruebas más importantes incluyen estadísticas básicas, por la calidad base de la secuencia, por puntuaciones de calidad de secuencia y adaptador de contaminación. Lee FastQC-procesado se alinea con el genoma humano y debe asignar a un ritmo de 50-80% con un máximo de un desajuste. Tarifas inferiores a 50% puede indicar problemas en el ChIP, preparación de biblioteca o de secuencia y pueden incluir contaminación, baja calidad de ChIP de ADN o excesiva amplificación en PCR. Durante la conversión de SAM a los archivos de BAM, Lee duplicado primero debe estar marcado y entonces posteriormente quitarse SAMBLASTER antes de proceder a toma de muestras. Aunque es normal cierto nivel de duplicación durante la PCR, altos niveles de duplicación son generalmente indicativos de ChIP de ADN de baja calidad, o posiblemente un problema con la preparación de la biblioteca. Las salidas de FastQC, corbatín y samblaster (combinado en flagstat) pueden ser conducidas en MultiQC que proporciona un completo Resumen interactivo de todos los resultados de control de calidad. MultiQC muestra indicadores de control de calidad de los archivos de salida de fastqc, corbatín y samblaster informando acerca de estadísticas básicas, porcentajes de alineación y las tasas de duplicación de PCR respectivamente.
Después de la normalización de muestreo inferior, el paso siguiente y probablemente más importante, es visualización de datos usando un navegador de genoma como el IGV o UCSC. Cada modificación de histonas representa un componente clave del paisaje regulación epigenético, incluyendo H3K27ac (potenciadores), H3K4me1 (potenciadores activos y listos), H3K4me3 (promotores), H3K79me2 (transcrito regiones), H3K27me3 (polycomb represión), y H3K9me3 (heterochromatic represión). Mediante el uso de estas marcas ya sea solo o en combinación, estas histonas pueden identificar reforzadores activos, preparados o reprimidos y promotores, así como el estado transcripcional de las regiones de codificación. Esto quedó demostrado con ChromHMM, en el cual se identificaron cromatina funcionalmente distintos Estados que representan ámbitos represivos y activadas. Estos Estados fueron definidos por marcas singulares, tales como represión de polycomb (H3K27me3), hetrochromatic represión (H3K9me3) y transcripción activa (H3K79me2), así como marcas de combinatorias, como activos potenciadores (H3K4me1 y H3K27ac) y transcritas potenciadores (H3K4me1, H3K27ac y H3K79me2).
La plataforma integrada presentada es adecuada para la determinación de la ocupación de las histonas o factores de la transcripción de muestras de tejidos. Con éxito hemos utilizado este protocolo para la determinación de la ocupación de las mencionados seis marcas de muestras tamaño de biopsia melanoma. Sin embargo, hemos todavía no determinado la menor cantidad de tejido necesario para aplicaciones de ChIP-Seq exitosas porque es dependientes en el tipo de tejido así como anticuerpos disponibles. Además, aunque habitualmente utilizamos este protocolo en fresco, flash congelado y OCT congeladas las muestras, no hemos optimizado este protocolo para tejidos FFPE. Algunos estudios recientes han reportado protocolos para estos tejidos46,47 y los cambios propuestos se pueden incorporar en el marco de esta plataforma para comprobar si la plataforma presentada servirá de tejidos FFPE. Creemos que esto será muy útil en la determinación de patrones de estado de cromatina del material clínico Obtenido de pacientes en ensayos clínicos. En general, este protocolo describe un módulo de ChIP-seq completo e integral para el mapeo del genoma de Estados de la cromatina en los tejidos tumorales humanas, con fácil seguir instrucciones que abarca todos los componentes necesarios para un exitoso experimento.
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Disclosures
Autores no declaran conflictos.
Acknowledgments
Agradecemos a Marcus Coyle, Curtis Gumbs, núcleo de SMF en el MDACC para apoyo de la secuencia. El trabajo descrito en este artículo fue apoyado por subvenciones de la subvención del NIH (CA016672) a base de SMF y NCI premios (1K99CA160578 y R00CA160578) para K. R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma - Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA - IgG-free | Sigma - Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag - 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
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