Summary
ここでは、最適化された高スループット チップ シーケンス プロトコルと冷凍腫瘍組織や細胞からゲノム クロマチン状態パターンの定量計算解析パイプラインについて述べる。
Abstract
ヒストン修飾は、エピゲノムの主要なコンポーネントを構成して、関連する遺伝子の転写のステータスを決定する上で重要な規制の役割を果たします。さらに、特定の変更の有無は位置とエンハンサーなどの id 以外のコーディング機能要素を決定するために使用されています。近年、次世代シーケンシング (チップ seq) 続いてクロマチン免疫沈降個々 のヒストンの修正のゲノム全体のプロファイルを決定する上で強力なツールとなっています。ただし、クロマチン状態と呼ばれる、クロマチン修飾の組み合わせパターンが id と関連付けられた genomic 位置の性質を決定することがますます明らかになった。したがって、ヒストン修飾としてできる計算解析パイプラインの数をプロファイリングのしっかりした高スループット (HT) 方法論から成るワークフロー処理チップ Seq の無数のデータセットをプロファイリングのために必要な多くのサンプル数でエピゲノム状態の包括的な決定は。ここに提示、HT チップ Seq ワークフローは 2 つのモジュールで構成されています: 1) 少量の腫瘍のサンプルや 96 ウェル フォーマットで細胞からいくつかのヒストンの修正をプロファイリングのための実験プロトコル・ 2) 個々 のマークの占有と組合せクロマチン状態パターンの両方を計算するための既存のツールを組み合わせた計算データ解析パイプライン。一緒に、これら 2 つのモジュールは、簡単チップ Seq サンプルの何百もの高速かつ効率的に処理を促進します。ここに示すワークフローを使用して、黒色腫の細胞株 6 ヒストン マークのプロファイルからクロマチン状態パターンを派生します。全体的にみて、人間の腫瘍のサンプルと様々 な悪性腫瘍におけるエピゲノム異常を決定するがん細胞の数十に適用できる包括的なチップ seq ワークフローを提案します。
Introduction
哺乳類のゲノム (98-99%) の大半は非コード シーケンスから成るとこれらの nocoding 地域制御遺伝子の発現とクロマチン組織1,2に参加する知られている規制要素を。正常な細胞に最適化されたクロマチン構造にゲノム DNA の特定のアセンブリは空間的な組織、規制、様々 な DNA 関連プロセス3,4、5の精密なタイミングにとって重要です。癌細胞のしかし、クロマチン修飾におけるエピジェネティックな異常のメカニズムによってにつながる規制要素、染色体のループ システム、および遺伝子発現パターン6へのアクセスを含む、クロマチン構造の不適切な組織 7,8,9,10。
最近の進歩にもかかわらず、我々 は腫瘍の進行や治療の応答に関連付けられているエピジェネティックな変化の理解を限られています。エピゲノムは、ヒストンと DNA メチル化遺伝子発現ネットワークとその他のプロセスを維持するための重要な時に入射する (クロマチンの状態と呼ばれる) 動的状態を総称して形成を含む変更の配列で構成されています携帯電話の id です。最近、エンハンサーの変化は、H3K27Ac プロファイル11を研究することによって複数の悪性腫瘍で示されています。このような研究は、分離のエピゲノムの相関性への洞察力を提供する、以上 100 エピジェネティック修飾はその生物学的役割を明確に理解することがなく識別された12,13をされていると相互依存関係。さらに、これらのヒストンと DNA の変更の組合せパターンのさらに大きな数があるし、それはこれら組み合わせパターンの個々 の変更 - エピジェネティックな状態14を指示します。したがって、癌の進行や治療.への応答時にこれらのクロマチンの状態の変化を識別するために途方もない必要性があります。技術 (臨床材料/単一セルの少量から大規模なデータ生成など) の一部に遅れている癌のエピゲノム変化の包括的な知識と分析 (例えばアルゴリズムを定義するには組合せ状態) の課題。したがって、容易にする組合せのパターンを予測する臨床材料と簡単に実装できる計算のアプローチからヒストン修正マークの数が多いをプロファイリングのための堅牢な高スループット方法の重要な必要性があります。腫瘍と治療抵抗性のさまざまな段階に関連付けられているエピジェネティクスの状態の決定。さらに、データ最近エピゲノム プロファイリング研究15,16,17,18,19,20,21から利用できます。 22,23の正常組織および細胞は腫瘍の腫瘍生物学へのエピゲノム貢献のさらなる洞察のクロマチン プロファイルに統合できます。
クロマチンのプロファイリングを様々 なクロマチン変更15,24の大域結合パターンを識別するための強力なツールとなりました。近年、チップ seq を地球規模25,26,27DNA 蛋白質の相互作用を研究するための「ゴールド スタンダード」となりました。任意のチップ seq 実験のためティッシュの処理および脱退を含め、最適な超音波処理条件、沈殿物、ライブラリの準備のための最適な抗体濃度を決定を決定、その成功のために必要な重要なステップがあります。ポスト シーケンス データの処理、および下流の分析。これらの各手順キーの品質管理のチェックポイントが含まれて、一緒に撮影するとき正しく機能検証のための潜在的なターゲットを識別するために重要です。次の手順でイノベーションにより、いくつかの先行研究が組織28,29,30,31,32 の少量からチップやチップ Seq を実行する手法を開発しました。.さらに、いくつかの研究は、PCR によって続いた高スループット チップ実験用プロトコルによる定量33,34を示唆しています。最後に、チップ Seq データのいくつかの公に利用可能な解析プラットフォームは、Easeq35銀河36などできます。ただし、クロマチン状態分析と同様に、ひとつのマークを実行する計算パイプラインとの組み合わせで高スループット方法でチップ Seq を実行するための統合プラットフォームを欠いてきた。
このプロトコルと腫瘍組織および培養細胞におけるクロマチン状態のゲノム マッピングのための完全かつ包括的なチップ seq ワークフローを成功した実験のために必要な手順のすべてを包み込むガイドラインに従う簡単な記述します。Blecher ゴネンらに記載された高スループット方法を採用することにより37, このプロトコル並列でサンプルの数十に実行でき、癌細胞、悪性黒色腫、大腸、前立腺、膠芽腫多形性など人間の腫瘍に正常に適用されています。ひと悪性黒色腫細胞と腫瘍サンプルのエピジェネティックな規制環境の主要なコンポーネントを表す六つのコアのヒストンの修正の方法を示す.これらの変更は、H3K27ac (エンハンサー)、H3K4me1 (アクティブと態勢を整えてエンハンサー) H3K4me3 (プロモーター) H3K79me2 (転写領域)、H3K27me3 (ポリコーム抑制) と H3K9me3 (多色抑圧)。これらのマークは、抑圧的なアクティブなドメインを表す機能的に異なるクロマチンの状態を識別するために単独でまたは組み合わせて使用できます。
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Protocol
制度検討委員会のガイドラインに従うすべての臨床検体が得られました。
1. バッファー準備
- 200 mL の TE バッファー (10 mM 10 mM エチレンジアミン四酸 (EDTA) pH 8.0 トリス-HCl) を確認します。
- 200 mL の STE バッファー (10 mM 10 mM EDTA pH 8.0、140 mM の NaCl トリス-HCl) を確認します。
- 2.0 M のグリシン (37.52 g 水 200 mL にグリシンの) の 200 mL と 65 ° C まで熱する
- 200 mL の 5% ナトリウム デオキシ コール酸 (DOC) 溶液 (DOC の 200 mL の水に 10 g) を確認します。
- 500 mL のチップ収穫バッファー (12 mM トリス-塩素、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、6 ミリメートルの EDTA、0.5% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) × 0.1) を確認します。
- 希釈バッファー内蔵の 500 ml ペットボトル (10 mM トリス-Cl 140 mM NaCl 0.1 %doc、1% トリトン X 1 mM EDTA)。
- RIPA 洗浄バッファーの 500 ml ペットボトル (1% トリトン x-100, 0.1% 0.1% SDS STE DOC)。
- 500 mL のリッパ/500 洗浄バッファー (RIPA バッファー + 360 mM NaCl) を確認します。
- 500 mL の LiCL 洗浄バッファーを作る (テ、250 mM LiCl、0.5% 0.5%、NP 40 DOC)。
- 直接溶出バッファーの 500 ml ペットボトル: 10 mM Tris Cl pH 8.0、5 ミリメートルの EDTA、300 mM, 塩化ナトリウム 0.5 %sds。
- 50 mL の抗体結合/ブロック バッファー (PBS + 0.1 %igg 無料トゥイーン 20 + 0.2 %bsa) を確認します。
2. 組織/細胞ラインの処理および架橋
- 組織がフラッシュ凍結の場合は、解離の前に氷の上 dethaw します。
- 組織 (ヒストン修飾抗体 1 〜 8 mg) 50 mg を 2 mL のハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) 滅菌かみそりの刃を使用して手動で解除します。無菌培養皿で約 5 分の 3 〜 4 mm の部分にティッシュをミンチします。
- 分解管に組織と HBSS ソリューションを転送し、HBSS の別 8 mL を追加します。さらに均質になるまで発生器を使用して組織の関連付けを解除します。
- 黒色腫の分解にチューブを配置し、次のサイクルそれぞれをこの順序で 1 つの時間を実行: h_tumor_01.01、h_tumor_02.01、h_tumor_03.01、m_heart_02.01。
- 10 mL の培地にこすり 21 × 106セル (ヒストン修飾と入力あたり 〜 3 × 106特殊な集団のマークあたり 100,000 セルに下げることができる) 標準ティッシュ文化で育つ料理し、15 mL の円錐管にそれらを収集します。
注: 代表的な悪性黒色腫細胞株 WM115 で使用されるメディアは 10% 牛胎児血清と 5% ペニシリン/ストレプトマイシンを DMEM。 - クロスリンク 3 mL HBBS 組織 (または細胞用培地 3 mL) あたり 16% のホルムアルデヒドの 200 μ L を追加することによって 1% 最終的なホルムアルデヒド濃度を用いた細胞。10 rpm の 37 ° C で正確 10 分のミキサーを使用して混合物を振る
注意: ホルムアルデヒドは毒性があり適切なドラフトで処理する必要があります。 - サンプル 3 mL あたり 2.0 M のグリシンを 200 μ l 添加し、37 ° C で 5 分間別 10 rpm で揺れ続ける
注: グリシンは逆として機能します。ソリューションは、時間をかけて傾向がある pH pf として毎月新鮮な液を作る。 - ベンチトップ遠心分離機を使用して 4 ° C で 5 分間 934 x g でサンプルをスピンします。上澄みを除去、5 mL の氷冷 PBS を追加、934 x g で再度サンプルを遠心し、上清を除去します。
- フラッシュは、ペレットを凍結し、さらに処理するため-80 ° C で保存します。
3. 組織溶解、超音波処理、および抗体作製
- チップ収穫バッファー 10 mL あたり 1 プロテアーゼ阻害剤タブレットを溶解します。
- 組織の 50 mg 当たりプロテアーゼ阻害剤収穫バッファー内蔵の 300 μ L を追加し、氷の上の溶解の 30 分します。
注: は、300 μ L あたり 1 X 10 の7 WM115 悪性黒色腫細胞のプロテアーゼ阻害剤収穫バッファー内蔵を追加します。 - オンにセルが溶解しながら、機能を内蔵したかく乱化学物質と関連付けられている冷却システム温度 4 ° C に到達して洗浄器ホルモンの超音波発生装置管を置き、30 で 60 サイクルの黒色腫組織を超音波 s と 30 s 200 〜 600 塩基対 (bp) のクロマチンのフラグメントを取得するオフ。
注: 超音波処理時間は組織の種類によって異なります、それに応じて調整する必要があります。これは重要なステップを免疫沈降法に進む前に予備実験で最適化する必要があります。 - 超音波処理、中に 3 回使用バインディング/ブロック バッファー (PBS + 0.1 のトゥイーン 20% + 0.2 %bsa) の 1000 μ L サンプルあたり抗体あたりプロテイン G 磁気ビーズの 20 μ L を洗ってください。
- 悪性黒色腫の組織の 〜 8 mg、バインド/チューブのリボルバーを使用する回転と 4 ° C で 2 時間バッファーをブロックの 100 μ L の各ヒストン抗体の 3 μ g を孵化させなさい。特異抗体の 12 例には、ビーズの 240 μ L、36 μ g の抗体と結合/ブロック バッファーの 1200 μ L が含まれます。
注: 3 × 106セル、各抗体の 5 μ g と抗体/タンパク質 G 磁気ビーズの 30 μ L を使用します。組織の異なる量を使用している場合、抗体および蛋白質 G ビーズを滴必要があります。他の変更と転写因子の抗体濃度を最適化必要がありますただし、このプロトコルが記述されている六つのヒストンの修正 (材料表) の免疫沈降の条件を示しています。 - マスター ミックス (室温) 直接溶出 44 μ L を含むバッファー フラグメント サイズを決定、sonciated クロマチン溶液 20 μ L を削除および溶出バッファーを追加、RNase (20 mg/mL) の 1 μ L、5 μ L プロティナーゼ K (20 mg/mL) サンプルあたり。50 ° C で 2 時間、少なくとも PCR サーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。メーカーの指示に従って PCR 精製キットを使用してサンプルを浄化します。
- クロマチン、3.6 の手順に進む前に高感度 DNA 一塩器具を使用してのフラグメント サイズを決定することにより十分に剪断を確認します。レーザービーム機器を入れます。
- 8 まあ鏡筒ストリップの各ウェルに感度の高いバッファー試薬の 2 μ L をロードします。残りの井戸で精製サンプルの最初と 2 μ L に感度の高いはしごの 2 μ L をロードします。
- 2000 rpm 1 分蓋をあけるのためにサンプル管 stips と渦光チューブ キャップを置き、新しい高感度スクリーン テープと読み込みヒント ボックスを挿入します。ストリップ キャップをはずし、レーザービームの器にサンプルをロードします。
- 解析ソフトウェアを開く、画面テープに最初の 13 のスペースをハイライトし、右下隅の [スタート] タブを押します。200 〜 1000 bp までクロマチン フラグメントは、チップに適しています。
- 生殖不能の管に超音波破砕した溶液を移および 4 ° C で 15 分間テーブル トップ遠心分離機を使用して 21,130 x g でチューブをスピン上清を新しいチューブに転送します。
- 上澄みの総量を決定して入力コントロールのトータル ソリューションの 10% を削除、4 ° C で保存
4. クロマチン免疫沈降
- 希釈バッファー内蔵の 20 mL あたり 2 プロテアーゼ阻害剤の錠剤を溶解します。
- 超音波希釈後、残りのサンプル 5 回 0.1 %sds レベルをもたらすチップ希釈バッファーを使用します。1080 μ L 1350 μ L の最終容量を得るためにチップ希釈バッファーの残りの上清の 270 μ L を希釈します。
- 抗体および蛋白質 G 磁気ビーズの孵化が完了すると、磁石にチューブを置き、上澄みを除去します。
- 磁石の上に座ってまだチューブ、プロテアーゼ阻害剤希釈バッファー内蔵 750 μ L を追加することによってビーズを一度洗ってください。
注: それはビーズを妨げるか、またはこの手順中にチューブを回転することが重要です。 - 希釈バッファーを洗浄し、同じチップ希釈バッファーの 240 μ L でビーズを再懸濁しますチップを削除します。分注 20 μ L の 12 の別々 のチューブ ビーズそれぞれを別組織サンプルの使用です。
- 因数特異抗体とタンブル 4 ° C で一晩チューブ リボルバーを使用して蛋白質 G ビーズに均等に超音波破砕した材料
5. 洗浄と逆の架橋において DNA-タンパク質複合体の
- 逆の架橋後次の朝は、96 ウェル プレートに抗体タンパク質溶液を転送し、マグネット スタンドの上に置きます。少なくとも 30 s と削除の従うにビーズを許可する上清。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して冷たい RIPA 洗浄バッファーの 150 μ L にビードを 5 回洗浄しなさい。洗浄手順の中にはないピペット、ビーズが、右から左へ 30 から継続的に磁石を移動洗浄あたり s。
- 150 μ L の氷冷 RIPA 500 洗浄バッファーで 2 回サンプルを洗います。
- 150 μ L の冷たい LiCl 洗浄バッファーで 2 回サンプルを洗います。
- 冷たいテ洗浄バッファーの 150 μ L で一度サンプルを洗ってすぐに TE バッファーを削除します。低入力用は、この手順を省略できます。
- チップの DNA サンプルを含む 96 ウェル プレートの新鮮な井戸にステップ 3.7 から入力コントロールを追加します。
- 洗濯の手順の後、溶出バッファー マスター ミックス (室温) 直接溶出バッファー、RNase (20 mg/mL) の 1 μ L、5 μ L プロティナーゼ K (20 mg/mL) 逆架橋のチップと入力サンプルごとの 44 μ L を含むを追加します。
- 37 ° c、4 h で 50 ° C から 65 ° C で 8-16 h 4 h の PCR サーマルサイクラーを使用してサンプルをインキュベートします。
6. 精製と沈殿した DNA の定量化
- 次の朝、場所サンプルは沈澱 DNA が含まれている新しい 96 ウェル PCR プレート マグネット、転送上清に戻ってください。
- ソリューション (ソリューションの 50 μ L の 115 μ L)、慎重にピペット マルチ チャンネル ピペットを使用して 25 回上下に常磁性ビーズ × 2.3 を追加します。ソリューションは適切に混合する場合は同種になります。
- ソリューション 4 分サンプル磁石上のバックアップし、別 4 分破棄上清の室温で孵化させなさい場所のための磁石を室温で孵化させなさい。
- 磁石のサンプルを残しながら 70% エタノール (巻/巻) の 150 μ L を追加し、30 室温で孵化させなさい s ビーズを乱すことがなく。
- エタノールを削除し、洗浄を繰り返します。5 分のための磁石に常磁性ビーズを空気乾燥を許可します。
注: は、残りのエタノールが精製を妨げる第 2 洗浄後すべてのエタノールを削除します。 - 磁石からサンプルを削除し、10 mM Tris Cl pH 8.0 の 30 μ L を追加します。25 回のピペッティングで混ぜるし、4 分のための磁石を室温でサンプルをインキュベートします。
- 磁石にサンプルを置き、各サンプル ライブラリの準備のための新しい 96 ウェル プレートを別 4 分転送 20 μ の室温で孵化させなさい。ストア、残り 10 μ L チップ DNA の任意の潜在的な問題の場合ライブラリの生成。
- この段階では、ライブラリの準備する前に DNA チップを定量化します。DNA 濃度の測定高感度 DNA 試薬で。手順 7.1 に高感度 DNA 一塩楽器進むを使用して沈殿した DNA のサイズ分布を決定します。
7. ライブラリ生成 NEBNext ウルトラ II DNA ライブラリの準備キットを使用して
- メーカーから推奨されるプロトコルを次の DNA ライブラリの準備を使用して NGS 配列用のライブラリを生成します。すべての反応が 96 ウェル プレートで実行され、孵化、PCR サーマルサイクラーふた温度セット > 100 ° C と 50 μ L を設定ボリュームで実行されます。
- インデックス、NGS プラットフォーム用多重 Oligos を使用します。次の設定を使用して PCR 増幅のため 10 x サイクルの合計を実行: 30 98 ° C で初期変性 s、10 98 ° C で変性 s、30 65 ° C で熱処理/拡張子 s (10 x サイクル)、最終的な拡張 65 ° C、4 ° C で 5 分押し
注意: 表 1 には、pcr 用プライマーが含まれています。 - PCR 増幅後サンプルを削除し、ヌクレアーゼ フリー水を使用して 100 μ L に容量をもたらします。最初ビーズ追加 55 μ L による常磁性サイズの両面の選択 (0.55x/0.8x) を行い、25 回のピペッティングで混ぜます。サンプル 4 分のための磁石を室温で孵化させなさい。
- 磁石にサンプルを置き、別の 4 分間室温でインキュベートします。この手順を使用して、シーケンスに適しているビーズの大きな断片を保持します。
- 上清を新しい 96 ウェル PCR プレートに転送します。これは部分的に浄化された DNA を含んでいる上澄みを廃棄しないでください。
- 常磁性ビーズの別の 25 μ L を追加し、25 回のピペッティングで混ぜる 4 分のための磁石を室温で孵化させなさい。
- 磁石に戻るサンプルを配置別 4 分間室温でインキュベートし、上澄みを廃棄します。600 〜 200 のフラグメントを保持するこの手順を使用に使用される bp 確定ライブラリ。
- 磁石のサンプルを残しながらエタノール 70% (v/v) の 150 μ l 添加し 30 インキュベートを許可 (磁石の中には移動しない) ビーズを乱すことがなく s。エタノールを削除し、もう一度洗浄を繰り返します。
- 5 分のための磁石に乾燥空気に常磁性ビーズは、残りのエタノールが精製を妨げる第 2 洗浄後すべてエタノールを削除を許可します。
- 磁石からサンプルを削除し、10 mM Tris Cl pH 8.0 の 25 μ L を追加します。25 回のピペッティングで混ぜるし、4 分サンプル磁石のバックアップし、別の 4 分間室温でインキュベートの場所のための磁石を室温で孵化させなさい。
- サイズは配列のために適していることを確認する多重化前に高感度 DNA 一塩楽器を使用してライブラリを定量化します。完成したライブラリは 200-600 bp 間の範囲し、すべてプライマー二量体を欠いています。
メモ: 必要に応じて、常磁性ビーズ浄化 x 別の 0.7 は実行されます 〜 130 に存在する不要なプライマー二量体を削除する bp。 - 濃度に応じてプライマーを一意なインデックスに基づく定量化された DNA をプールします。濃度 1 ng/μ L と 6ng/μ L の間で六つのサンプルを含むプール、分布は低いサンプルを 15 μ l 添加し最高のサンプルの 2.5 μ L。これは、カウントはフロー ・ セルの各レーンに均等に配布される読み取りを確保するため行われます。
8. チップ seq データを後処理します。
- Snakemake38,39に基づくパイプラインが使用する単一のコマンドで次のすべてのプロセスのステップします。重要なは、これらの各手順、関連するコマンドを説明個別にします。
- FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) を使用して raw fastq 配列読み取りの品質を決定する: unix ターミナルを開き、ディレクトリ (cd) をそれぞれ六つのヒストンの修正のため raw fastq ファイルを含むフォルダーに変更します。Unix の端末タイプ、fastqc *fastq.gz、[RETURN] を押して。フォルダー内のすべての fastq ファイルで品質管理基準が実行されます。
- 参照ゲノムに品質の読み取りを合わせ、bam ファイルに圧縮する前に重複を削除します。これはボウタイ バージョン 1.1.239、SAMBLASTER バージョン 0.1.2140、SAMTOOLS バージョン 1.3.141を使用して実行されます: unix 端末の種類、ボウタイ -m 1 - n 1 - ベスト - 地層 -S-q/path_to/hg19 histone1.fastq.gz で |samblaster removeDups |samtools 表示 -アンチモン - > histone1.bam、[RETURN] を押して。
注: path_to を置き換える hg19 人間のゲノムのアセンブリを含むフォルダーを表します。これは興味の有機物によって変わります。 - 以下のコマンドで SAMTOOLS を使用して bam ファイルを並べ替える: unix のターミナル タイプの samtools ソート histone1.bam m 2 G-@ 5 T histone1.temp -o histone1.sorted とプレス [戻る]。
- 以下のコマンドで SAMTOOLS を使用して bam ファイルをインデックス: unix のターミナル タイプの samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai のインデックス、[RETURN] キーを押します。
- 以下のコマンドで SAMTOOLS flagstat を使用して一意に割り当ておよびアライメントされていない読み取りを決定: unix 端末の種類、samtools flagstat histone1.sorted.bam、[RETURN] を押して。
- 読み取り数ごとに bam ファイルを次のコマンドでランダム サンプリングを実行することによって正規化: unix のターミナル タイプの sambamba 表示 -f bam-サブサンプリング-種子 = 3 s 0.X histone1.sorted.bam |samtools ソート -m 2 G-@ 5 T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam とプレス [戻る]。
- 以下のコマンドで SAMTOOLS を使用して bam ファイルのインデックス: unix のターミナル タイプの samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai のインデックス、[RETURN] キーを押します。
- ゲノムのブラウザー (すなわち上のチップ seq ライブラリを可視化します。UCSC または IGV) あたりプラスミドあたり読み取り bam ファイルのスケーリングによって deepTools バージョン 2.4.040を使って大物ファイルを生成百万 (RPKM)。これは、次のコマンドを使用して実行できます。
- 標準的な大物ファイル: unix 端末の種類、bamCoverage b histone1 で。downsample.sorted.bam - normalizeUsingRPKM-binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 -o histone1.bw 押し {戻る]。
- 入力の大物ファイルを減算: unix ターミナル タイプ、bamCompare - bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam - bamfile2 input1.downsample.sorted.bam - normalizeUsingRPKM - 率減算 - binSize 30 - smoothLength 300 - extendReads 200 ohistone1.subtracted.bw プレス [戻る].
- チップ seq (MAC) バージョン 1.4.225,26バージョン 2.1.0 のモデル解析「入力」背景にチップ seq 信号濃縮を識別します。「点光源」要因 H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac、macs2 H3K79me2 H3K27me3 H3K9me3 の「広範なソース」要因のために macs1 を使用します。これは、次のコマンドを使用して実行されます。
- 点源: unix 端末タイプ、macs14 t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM-p 1e-5-nomodel - 維持 dup のすべての-n histone1.file とプレス [戻る]。
- 広範なソース: macs2 callpeak t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM-p 1e-6--unix 端末タイプの広い ― ― 広いカットオフ 1e-6--維持 dup すべての-nomodel-n histone1.file とプレス [戻る]。
- 組合せクロマチン状態のパターンを識別するために使用 ChromHMM24は次のコマンドを用いてヒストン修飾に基づきます。
- Unix の端末で入力、cd/path_to を置き換える/ChromHMM_folder、[RETURN] キーを押します。
- ChromHMM ディレクトリ型で一度 java-mx2G-ChromHMM.jar BinarizeBam-b 1000 hg19.txt/path_to を置き換える/bam_directory/path_to/CellMarkFile.txt/path_to を置き換える/BinarizeBam_output の jar し、[RETURN] キーを押します。
- 型、java-mx2G-ChromHMM.jar LearnModel-b 1000/path_to を置き換える/BinarizeBam/path_to を置き換える/output_directory 15 hg19 jar し、[RETURN] キーを押します。
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Representative Results
このプロトコルでは、冷凍腫瘍組織および高スループット方法(図 1 a)を使用して並列にサンプルの数十に実行できる培養細胞から免疫沈降をことができます。最適な免疫沈降の 200 〜 1000 bps の間クロマチン フラグメントの範囲。我々 は、異なる組織や細胞の種類の異なる同じ剪断長さを達成するために必要な時間を指摘しています。組織量が少ないからチップの成功は、特に超音波処理中にすべての回でライセートの寒さを維持するのに依存します。浄化チップ DN Ashould は、ライブラリの準備 (図 2 a) に進む前に定量化します。完成したライブラリ多重 NGS に適してする必要があります 〜 200-600 bp 間の範囲し、任意プライマー二量体の欠けている(図 2 b).後のシーケンスには、MAC など、パイプラインのこれ以降の手順に進む前に満たされる必要があります多くの品質管理基準ピーク呼び出しまたは ChromHMM 分析(図 3)。これらの基準の多くは、FastQC や MultiQC などのプログラムを使用して確認できます。品質 fastq 読み取りは、最大 1 つの不一致の 50 ~ 80% の割合で人間のゲノムに配置されます。推奨されるシーケンスの深さは 1000 万一意に「ポイント源」の要因を読み取り、マップ 2000 万一意に「広範なソース」要因27,41,42,43の読み取り。並べ替えとインデックスの BAM ファイルは IGV など UCSC のゲノムのブラウザーを使用して視覚化することができます大物ファイルを生成する使用されます。チップのサンプルは入力の DNA を濃縮する必要があります、各ヒストン修飾は、エピジェネティックな風景(図 4 a)の特定のコンポーネントを表す異なるプロファイルを表示する必要があります。いくつかの組織のバック グラウンド ノイズをチップ seq 信号を隠すことがより高いレベルなる可能性です。このような場合は、入力減算大物ファイルを生成し、再のゲノムのブラウザーを視覚化することをお勧めします。クロマチン状態のプロファイルを確認するのには、ChromHMM アルゴリズムの24を利用します。ChromHMM、最も顕著な再発生する組合せを識別する多変量の隠れマルコフ モデルを使用してヒストン修飾に基づく空間クロマチン パターン(図 5)を検討しました。これらの六つの修正を使用して ChromHMM は、ポリコーム抑制 (状態 1)、多色抑圧 (状態 5)、アクティブな転写 (8 および 9 の状態) など、抑圧とアクティブの両方のドメインを表す機能的に異なるクロマチン状態を識別してアクティブなエンハンサー (13 と 14 の状態)。ChromHMM からの出力には、さらに下流の分析に使用することができます各状態のセグメント化されたベッド ファイルが含まれています。
図 1: チップ モジュールの作業フローします。腫瘍組織はまず解除、架橋蛋白質 DNA の相互作用をキャプチャします。組織は、免疫沈降法に適したクロマチン フラグメントを取得する超音波処理し、六つの示された抗体を用いたヒストン-DNA 複合体を沈殿します。サンプルを洗浄、クロスリンクが逆、チップ DNA を精製し、定量化します。ライブラリが浄化された DNA から生成され、一意のインデックスによると多重します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 精製 DNA チップ完成したライブラリ等の簡便解析します。(A) 代表簡便精製 DNA チップ含むクロマチンからライブラリの準備のために適している 200 〜 600 bp を断片します。(B) 代表一塩増幅と多重と NGS に適した両面常磁性サイズ選択後完成したライブラリから。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: チップ seq データ処理モジュールの作業フローします。表示チップ seq データ処理のための重要なステップと下流解析のための準備の仕事の流れ。このプロトコルで使用するパイプラインは、 snakemakeを使用して生成された、しかし、それぞれの手順も実行できます個別に説明されているようです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: チップ seq 追跡ヒストン修飾のゲノムのブラウザー ビュー。A)アクティブおよび抑圧された地域周辺の代表的な悪性黒色腫腫瘍サンプルの nras 登録で軌跡を表示する deeptools によって生成されたチップ seq トラック。Nras 登録で、CSDE1 などの遺伝子が並ぶ遺伝子 AMPD1、DENND2C、および SYCP1 ポリコーム マーク H3K27me3 が含まれてしていないに対し SIKE1 は、すべてのアクティブなヒストン修飾 (H3K27ac、H3K4me3 と H3K4me1) とアクティブな転写 (H3K79me2) に関連付けられているがアクティブな転写を含みます。代表的な悪性黒色腫腫瘍サンプルの ZNF 遺伝子間で態勢を整えてヘテロクロマチンを表示する deeptools によって生成された B) チップ seq を追跡します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ChromHMM モデル黒色腫瘍のサンプルに基づいています。六つのヒストン修飾に基づく 15 状態 LearnModel から発光分布を検討しました。ChromHMM はポリコーム抑制 (状態 1)、多色抑圧 (状態 5)、アクティブな転写 (8 および 9 の状態)、アクティブなエンハンサーなどの抑圧的なアクティブなドメインを表す機能的に異なるクロマチン状態を識別する (State13 と 14).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、ひと腫瘍組織および培養細胞におけるクロマチン状態のゲノム マッピングの完全かつ包括的な高スループット チップ seq モジュールについて説明します。最も重要な手順の 1 つは、任意のチップ seq プロトコル抗体特異性です。ここでは、このメソッドにより、チップ グレード、以前私たちと他研究所42,44,45で検証されてきたすべての記述の 6 ヒストン修飾の免疫沈降条件.同じ抗体濃度は、他の腫瘍タイプに正常に適用されている、利息27の異なる要因を勉強して場合、抗体の特異性を決めることが大事です。
成功した実験を別の重要な側面には、超音波処理条件の最適化が含まれています。超音波処理時間は、それに応じて調整するサンプルと組織型との間の両方を変えることができます。適切な最適化、試運転は超音波処理時間を段階的に増加し、フラグメントのサイズを継続的にチェックして各サンプルに対して実行されます。最適な免疫沈降の 200 〜 1000 bp の間初期チップ実験のクロマチン フラグメントの範囲し、ライブラリの準備に進む前に精製した DNA チップを定量化する必要があります。このフラグメントのサイズにより、最適な世代と増幅された DNA の保存 (~ 200 に 600 bp) 多重と NGS のため使用されます。高スループット方法でこれらの実験を実行する、多重化のための良い出発点はプールのシーケンスのための車線あたりのサンプル数 8 〜 することです。この量のサンプルでは、シーケンスの浅い深さを作り出す可能性があります、続行する前に抗体の品質をテストするために便利です。複数のサンプルをプーリングのボトルネックの 1 つはポスト シーケンス不平等の範囲です。通常ベースの定量が使用されているただし、fluoremetric メソッド多くの倍は同等ではありません各ライブラリ シーケンス対応分子に。ライブラリ DNA の定量のための最良の方法は、基準作ったのあらかじめ決められたシーケンス準備 DNA 分子を用いた qPCR を利用します。
チップ Seq データセットの分析の別の重要なステップは、データ処理をシーケンス後です。重要なは、下流解析のあらゆる側面に進む前に、まず満たすべき様々 な品質管理指標があります。FastQC などのプログラムがパスの形で生 fastq 配列読み取りの品質に関する情報を提供またはテストを失敗します。Fastq 読み取りは、メトリックのほとんどを渡す必要があります、いくつかのより重要なテスト シーケンスの基本品質、シーケンスの品質スコア、およびアダプター汚染あたりにつき基本的な統計情報を含めます。FastQC 処理の読み取りは人間のゲノムに揃えられ、最大 1 つの不一致の 50 ~ 80% の割合でマップする必要があります。レートを下げるよりも 50% 可能性がありますチップ、ライブラリの準備やシーケンスの問題、汚染、低質チップ DNA または PCR の間に過大に増幅を含めることができます。サムの BAM ファイルへの変換、中に重複読み取り最初フラグを設定する必要があり、ダウン サンプリングする前に、の SAMBLASTER を使用して、後で削除します。PCR の間に重複のいくつかのレベルは通常、重複の高レベル、低品質のチップ-DNA、あるいはライブラリの準備に問題が存在しています。すべての品質管理の結果の完全な対話の概要を提供する MultiQC に samblaster (flagstat に結合した)、ネクタイは、FastQC からの出力をすべてパイプできます。MultiQC には、fastqc、ボウタイ、それぞれ基本統計、配置割合及び PCR 重複率に関する情報を提供する samblaster の出力ファイルから品質管理のメトリックが表示されます。
ダウン サンプリング正規化、次のおそらく最も重要なステップの後はデータの可視化 IGV など UCSC のゲノムのブラウザーを使用します。各ヒストン修飾は H3K27ac を含む、エピジェネティックな規制環境の重要なコンポーネントを表します (エンハンサー)、H3K4me1 (アクティブと態勢を整えてエンハンサー) H3K4me3 (プロモーター)、H3K79me2 (転写領域)、H3K27me3 (ポリコーム抑制) とH3K9me3 (多色抑圧)。単独で、または組み合わせて、これらのマークを使用して、これらのヒストンはアクティブな構えや抑圧されたエンハンサー、プロモーターとコード領域の転写のステータスを識別できます。これは、抑圧的なアクティブなドメインを表す機能的に異なるクロマチン状態が識別された ChromHMM を使用して実証されました。これらの状態がアクティブなエンハンサー (H3K4me1 および H3K27ac) などの組合せ記号だけでなく、ポリコーム抑制 (H3K27me3)、hetrochromatic の抑圧 (H3K9me3)、アクティブな転写 (H3K79me2) などの特異なマーク定義され、転写エンハンサー (H3K4me1、H3K27ac、H3K79me2)。
提示の統合プラットフォームは、組織サンプルからの転写因子やヒストンの占有率の定量に適しては。我々 は正常に生検サイズ黒色サンプルから前述 6 マークの占有率の定量のためのこのプロトコルを活用しています。しかし、私たちがまだ決まらない組織組織型と同様に使用可能な抗体の depenedent だから成功したチップ Seq アプリケーションに必要な最低の量。さらに、我々 は日常的にこの冷凍新鮮なフラッシュのプロトコルと 10 月凍結試料を利用、私たちは FFPE 組織のこのプロトコルを最適化していません。いくつかの最近の研究は、このような組織46,47プロトコルを報告しているし、提示されたプラットフォームは FFPE 組織から役に立つかどうかをテストするこのプラットフォームの枠組みの中そこに提案された変更を組み込むことができます。我々 は、これは臨床試験の下で患者から得られた臨床材料からのクロマチン状態パターンの決定に非常に有用なだろうと信じます。全体的にみて、このプロトコルについて説明します, ひと腫瘍組織におけるクロマチン状態のゲノム マッピングのための完全かつ包括的なチップ seq モジュールと簡単すべて成功した実験に必要なコンポーネントの包括的な指示に従うこと。
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Disclosures
著者は競合を宣言しません。
Acknowledgments
マーカス ・ コイル、カーティス ・ ガムス SMF コア MDACC シーケンスのサポートに感謝いたします。この資料で説明する作業は、SMF のコアに NIH グラント (CA016672) からの助成金によって支えられた、NCI は、k. r. に (1K99CA160578 および R00CA160578) に賞を受賞
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma - Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA - IgG-free | Sigma - Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag - 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
References
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