ट्यूमर के ऊतकों में उच्च प्रवाह चिप-अनुक्रमण का उपयोग कर क्रोमेटिन राज्यों के जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए एक एकीकृत मंच
Summary
यहाँ, हम जमे हुए ट्यूमर ऊतकों और सेल लाइनों से जीनोम चौड़ा क्रोमेटिन राज्य पैटर्न के निर्धारण के लिए एक अनुकूलित उच्च प्रवाह चिप अनुक्रमण प्रोटोकॉल और गणनात्मक विश्लेषण पाइपलाइन का वर्णन ।
Abstract
हिस्टोन संशोधनों का epigenome के एक प्रमुख घटक का गठन और संबद्ध loci की transcriptional स्थिति का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण विनियामक भूमिकाएं निभाते हैं । इसके अलावा, विशिष्ट संशोधनों की उपस्थिति की स्थिति और पहचान गैर कोडिंग कार्यात्मक तत्वों ऐसे बढ़ाने के रूप में निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हाल के वर्षों में, क्रोमेटिन immunoprecipitation अगली पीढ़ी sequencing (चिप-seq) के बाद व्यक्तिगत हिस्टोन संशोधनों के जीनोम चौड़ा प्रोफाइल का निर्धारण करने में एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है । तथापि, यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि क्रोमेटिन संशोधनों के मिश्रित पैटर्न, क्रोमेटिन राज्यों के रूप में भेजा, पहचान और संबद्ध जीनोमिक लोकस की प्रकृति का निर्धारण । इसलिए, कार्यप्रवाह हिस्टोन संशोधन चिह्नों की एक संख्या की रूपरेखा के लिए मजबूत उच्च प्रवाह (एचटी) के तरीके से मिलकर, साथ ही गणनात्मक विश्लेषण पाइपलाइनों चिप के असंख्य Seq रूपरेखा डेटासेट से निपटने में सक्षम, के लिए आवश्यक हैं नमूनों की बड़ी संख्या में epigenomic राज्यों का व्यापक निर्धारण. एचटी-चिप-Seq कार्यप्रवाह यहाँ प्रस्तुत दो मॉड्यूल के होते हैं: 1) एक 96-अच्छी तरह से प्रारूप में ट्यूमर के नमूनों और सेल लाइनों की छोटी मात्रा से कई हिस्टोन संशोधनों की रूपरेखा के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल; और 2) एक गणना डेटा विश्लेषण पाइपलाइन कि मौजूदा उपकरणों को जोड़ती है दोनों व्यक्तिगत निशान अधिभोग और मिश्रित क्रोमेटिन राज्य पैटर्न गणना । एक साथ, इन दो मॉड्यूल एक तेज और कुशल तरीके से चिप Seq नमूनों के सैकड़ों के आसान प्रसंस्करण की सुविधा । यहां प्रस्तुत कार्यप्रवाह मेलेनोमा ट्यूमर और सेल लाइनों में 6 हिस्टोन मार्क प्रोफाइल से क्रोमेटिन राज्य पैटर्न प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कुल मिलाकर, हम एक व्यापक चिप seq कार्यप्रवाह है कि मानव ट्यूमर के नमूनों और कैंसर सेल लाइनों के दर्जनों के लिए लागू किया जा सकता है वर्तमान विभिंन द्रोह में epigenomic विचलन निर्धारित करते हैं ।
Introduction
स्तनधारी जीनोम के बहुमत (98-99%) गैर कोडिंग अनुक्रम के शामिल हैं, और इन nocoding क्षेत्रों में नियामक जीन अभिव्यक्ति और क्रोमेटिन संगठन1को नियंत्रित करने में भाग लेने के ज्ञात तत्व होते हैं,2। एक सामांय कोशिका में, जीनोमिक डीएनए के विशिष्ट विधानसभा संकुचित क्रोमेटिन संरचना में स्थानिक संगठन, विनियमन और विभिंन डीएनए के सटीक समय के लिए महत्वपूर्ण है-संबद्ध प्रक्रियाओं3,4,5। एक कैंसर कोशिका तथापि, ंयायपालिका epigenetic तंत्र द्वारा क्रोमेटिन संशोधनों में क्रोमेटिन संरचना के अनुचित संगठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, विनियामक तत्वों के लिए उपयोग सहित, गुणसूत्र लूप सिस्टम, और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न6, 7,8,9,10.
हाल के अग्रिमों के बावजूद, हम epigenetic परिवर्तन है कि ट्यूमर प्रगति या चिकित्सीय प्रतिक्रिया के साथ जुड़े रहे है की समझ सीमित है । epigenome संशोधनों की एक सरणी के होते हैं, हिस्टोन के निशान और डीएनए मिथाइल, जो सामूहिक रूप से एक गतिशील राज्य फार्म (क्रोमेटिन राज्य के रूप में निर्दिष्ट) है कि जीन अभिव्यक्ति नेटवर्क और अंय को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं पर पिंग्स सहित सेलुलर पहचान । हाल ही में, बढ़ाने में परिवर्तन H3K27Ac प्रोफाइल11का अध्ययन करके कई द्रोहियों में दिखाया गया है । हालांकि ऐसे अध्ययनों अलग epigenetic के निशान के संबंध में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, 100 से अधिक epigenetic संशोधनों की पहचान की गई है12,13 उनकी जैविक भूमिकाओं की स्पष्ट समझ के बिना और निर्भरता. इसके अलावा, वहां इन हिस्टोन और डीएनए संशोधनों के संभव मिश्रित पैटर्न की एक भी बड़ी संख्या में हैं, और यह इन मिश्रित पैटर्न-नहीं व्यक्तिगत संशोधनों है-कि epigenetic राज्यों14हुक्म । इसलिए, वहां जबरदस्त कैंसर प्रगति या चिकित्सा के लिए प्रतिक्रियाओं के दौरान इन क्रोमेटिन राज्यों में परिवर्तन की पहचान की जरूरत है। epigenome के कैंसर में परिवर्तन का व्यापक ज्ञान तकनीकी (जैसे नैदानिक सामग्री की छोटी राशि से बड़े पैमाने पर डेटा की पीढ़ी के कारण भाग में ठंड गया है/एकल कोशिकाओं) और विश्लेषणात्मक (उदाहरण के लिए परिभाषित एल्गोरिदम मिश्रित स्टेट्स) चुनौतियां । इसलिए, नैदानिक सामग्री से हिस्टोन संशोधन के निशान की बड़ी संख्या की रूपरेखा और मिश्रित पैटर्न जो सुविधा होगी की भविष्यवाणी करने के लिए आसान गणना दृष्टिकोण को लागू करने के लिए मजबूत उच्च प्रवाह तरीकों के लिए महत्वपूर्ण जरूरत है tumorigenesis और उपचारात्मक प्रतिरोध के विभिंन चरणों के साथ जुड़े epigenetic राज्यों का निर्धारण । इसके अलावा, हाल ही में epigenome profile अध्ययनों से उपलब्ध डेटा15,16,17,18,19,20,21, 22,23 सामांय ऊतकों में और सेल लाइनों ट्यूमर जीव विज्ञान के लिए epigenome योगदान में आगे अंतर्दृष्टि के लिए ट्यूमर के क्रोमेटिन प्रोफाइल के साथ एकीकृत किया जा सकता है ।
क्रोमेटिन विभिंन क्रोमेटिन संशोधनों के वैश्विक बाध्यकारी पैटर्न की पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है15,24। हाल के वर्षों में, चिप seq एक वैश्विक स्तर पर25,26,27पर डीएनए-प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए “स्वर्ण मानक” बन गया है । किसी भी चिप-seq प्रयोग के लिए, इसकी सफलता के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कदम हैं, जिसमें टिशू प्रोसेसिंग और संबद्धता, इष्टतम sonication की स्थिति को शामिल करना, तेज वर्षा के लिए इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता, पुस्तकालय की तैयारी, पोस्ट अनुक्रमण डेटा प्रोसेसिंग, और बहाव विश्लेषण । इन कदमों में से प्रत्येक मुख्य गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों होते हैं, और जब एक साथ लिया, ठीक कार्यात्मक सत्यापन के लिए संभावित लक्ष्यों की पहचान के लिए महत्वपूर्ण हैं । इन चरणों में नवाचार के माध्यम से, कई पूर्व अध्ययनों के तरीकों के ऊतकों की छोटी राशि से चिप या चिप Seq प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया है28,29,30,31,32 . इसके अलावा, कुछ अध्ययनों से अधिक के लिए प्रोटोकॉल का सुझाव दिया है-प्रवाह चिप प्रयोग के बाद पीसीआर आधारित quantitation33,34। अंत में, चिप के लिए कुछ सार्वजनिक रूप से उपलब्ध विश्लेषण प्लेटफार्मों-Seq डेटा Easeq35 और आकाशगंगा36के रूप में अब उपलब्ध हैं । हालांकि, चिप के प्रदर्शन के लिए एक एकीकृत मंच-Seq एक अभिकलन पाइप लाइन के साथ संयोजन में एक उच्च प्रवाह फैशन में एकल चिह्न प्रदर्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्रोमेटिन राज्य विश्लेषण के अभाव रहा है ।
इस प्रोटोकॉल ट्यूमर ऊतकों और सेल लाइनों में क्रोमेटिन राज्यों की जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए एक पूर्ण और व्यापक चिप seq कार्यप्रवाह का वर्णन, आसान दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए एक सफल प्रयोग के लिए आवश्यक कदम के सभी शामिल । पहले Blecher-Gonen एट अल द्वारा वर्णित एक उच्च प्रवाह पद्धति अपनाने से । 37, इस प्रोटोकॉल समानांतर में नमूनों के दर्जनों पर प्रदर्शन किया जा सकता है और कैंसर सेल लाइनों और मेलेनोमा, बृहदांत्र, प्रोस्टेट, और ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी के रूप में मानव ट्यूमर पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है । हम छह कोर हिस्टोन संशोधनों कि मानव मेलेनोमा सेल लाइनों और ट्यूमर के नमूनों में epigenetic विनियामक परिदृश्य के प्रमुख घटकों का प्रतिनिधित्व करने के लिए पद्धति का प्रदर्शन । इन संशोधनों में H3K27ac (बढ़ाने वाले), H3K4me1 (सक्रिय और अग्रसर बढ़ाने वाले), H3K4me3 (प्रवर्तक), H3K79me2 (प्रतिलिखित क्षेत्र), H3K27me3 (polycomb दमन), और H3K9me3 (heterochromatic दमन) शामिल हैं । ये निशान या तो अकेले या संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है कार्यात्मक अलग क्रोमेटिन दोनों दमित और सक्रिय डोमेन का प्रतिनिधित्व राज्यों की पहचान ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल मानव ट्यूमर ऊतकों और सेल लाइनों में क्रोमेटिन राज्यों के जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए एक पूर्ण और व्यापक उच्च प्रवाह चिप-seq मॉड्यूल का वर्णन । किसी भी चिप-seq प्रोटोकॉल में, सबसे महत्वपूर्ण ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अनुक्रमण समर्थन के लिए MDACC में मार्कस Coyle, कर्टिस Gumbs, SMF कोर धंयवाद । इस लेख में वर्णित कार्य NIH अनुदान (CA016672) से अनुदान द्वारा समर्थित SMF कोर और NCI पुरस्कारों (1K99CA160578 और R00CA160578) के लिए के. आर.
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
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