여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.
히스톤 수정은 epigenome의 주요 구성 요소를 구성 하며 중요 한 역할을 규제 관련된 loci의 transcriptional 상태를 결정 합니다. 또한, 특정 수정의 존재 위치와 강화 등 비 코딩 기능 요소 정체성을 결정 하 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, chromatin immunoprecipitation 다음 세대 시퀀싱 (칩 seq) 다음 개별 히스톤 수정의 게놈 넓은 프로필 결정에 강력한 도구가 되고있다. 그러나, 그것은 점점 더 분명 chromatin 수정, Chromatin 상태 라고의 조합 패턴 정체성과 관련 된 genomic 소재 시의 결정 되고있다. 따라서, 다양 한 전산 분석 파이프라인 수 뿐만 아니라 히스톤 수정 표시를 프로 파일링에 대 한 강력한 높은 처리량 (HT) 방법론의 구성 된 워크플로 처리 칩 Seq의 무수의 프로 파일링 데이터 집합에 필요한 샘플의 많은 수에 있는 epigenomic 국가의 포괄적인 결정. 여기는 HT 칩 Seq 워크플로 두 개의 모듈로 구성: 1) 적은 양의 종양 샘플 및 96-잘 형식; 셀 라인에서 여러 히스톤 수정 프로 파일링 실험 프로토콜 그리고 2) 개별 마크 인 및 조합 chromatin 상태 패턴을 계산 하는 기존 도구를 결합 하 여 전산 데이터 분석 파이프라인. 함께,이 두 가지 모듈 쉽게 처리 칩 Seq 샘플의 수백의 신속 하 고 효율적인 방식으로 촉진 한다. 여기에 제시 된 워크플로 chromatin 상태 패턴 흑색 종 종양 세포에서 6 히스톤 마크 프로필에서 파생 하는 데 사용 됩니다. 전반적으로, 우리는 인간의 종양 샘플 및 다양 한 악성 종양에 epigenomic 착오를 결정 하기 위해 암 세포 라인에 적용할 수 있는 포괄적인 칩 seq 워크플로 제시.
포유류 게놈 (98-99%)의 대다수는 noncoding 시퀀스, 구성 그리고 알려진 유전자 발현 및 염색 질 조직1,2에 참여 하는 규제 요소를 포함 하는이 nocoding 지역. 정상 세포에서 게놈 DNA의 특정 어셈블리 압축된 chromatin 구조에이 공간 조직, 규정 및 다양 한 DNA 관련 된 프로세스3,,45의 정확한 타이밍에 대 한 중요 합니다. 그러나 암 세포에, chromatin 수정 후 성적인 탈 선 메커니즘에 의해 chromatin 구조, 규제 요소, 염색체 루핑 시스템 및 유전자 표현 패턴6에 대 한 액세스를 포함 하 여 부적절 한 조직에 발생할 수 있습니다. 7,8,,910.
최근 발전에도 불구 하 고 우리 후 변경 관련 된 종양의 진행 이나 치료 응답의 이해를 제한 했다. epigenome 수정, 히스톤 부호, DNA 메 틸 화, 총칭 impinges 유전자 식 네트워크와 유지에 대 한 중요 한 다른 프로세스는 동적 상태 (chromatin 상태 라고 함)를 형성 등의 구성 세포 id입니다. 최근, 강화 변경 H3K27Ac 프로필11공부 하 여 여러 악성 종양에 표시 되었습니다. 100 개 이상의 후 성적인 수정 확인 된12,13 그들의 생물 학적 역할의 명확한 이해 없이 되었습니다 이러한 연구 격리 후 성적인 부호의 상관 관계에 대 한 통찰력을 제공, 그리고 상호 의존입니다. 또한, 이러한 히스톤과 DNA 수정 가능한 조합 패턴의 더 큰 수가 있다 며 이러한 조합 패턴-개별 수정-epigenetic 국가14를 지정 하는. 따라서, 암 진행 이나 치료. 에 대 한 응답 하는 동안 이러한 chromatin 상태 변경 식별 엄청난 필요는 암에 epigenome 변경의 포괄적인 지식 기술 (예: 작은 양의 임상 자료/단일 셀에서 대규모 데이터의 발생)으로 인해 일부 후행 되었습니다 있다 및 분석 (예: 알고리즘을 정의 조합 국가) 도전. 따라서, 필요도 중요 한 임상 자료와 구현 하기 쉬운 전산 접근에서 히스톤 수정 표시의 많은 수를 프로 파일링에 대해 강력한 높은 처리량 방법 촉진 한다 조합 패턴 예측 epigenetic 상태 tumorigenesis 및 치료 저항의 다른 단계와 관련 된 결정. 최근 epigenome 프로 파일링 연구15,,1617,18,19,20,21에서 사용할 수 있는 추가, 데이터 정상 조직 및 세포에서 22,23 chromatin 프로필에 대 한 추가 epigenome 기여 종양 생물학에 종양의 통합 될 수 있다.
Chromatin 프로 파일링 다양 한 chromatin 수정15,24의 글로벌 바인딩 패턴을 식별 하기 위한 강력한 도구가 되고있다. 최근 몇 년 동안에 칩 seq 세계적인 규모25,,2627에 DNA 단백질 상호 작용 연구 “금 표준” 되고있다. 어떤 칩 seq 실험에 대 한 단계가 중요 한 성공, 조직 처리 및 연관 해제를 포함 하 여, 최적의 쥡니다 조건, 강 수, 도서관 준비에 대 한 최적의 항 체 농도 determing determing에 필요한 -시퀀싱 데이터 처리 및 다운스트림 분석입니다. 각이 단계 주요 품질 관리 검사점을 포함 하 고 함께 찍은 때 제대로 기능 유효성 검사에 대 한 잠재적인 대상을 식별 하는 데 중요 한 있다. 이 단계에서 혁신을 통해 여러 이전 연구에서 적은 양의 조직28,,2930,31,32 칩 또는 칩 Seq를 수행 하는 방법론 개발 . 또한, 일부 연구는 높은 처리량 칩 실험 뒤에 PCR 프로토콜 기반 정량33,34건의 했다. 마지막으로, 일부 공개적으로 사용 가능한 분석 플랫폼 칩 Seq 데이터에 대 한 Easeq35 등 은36사용할 수 지금 있습니다. 그러나, 하나의 마크 chromatin 상태 분석 수행을 계산 파이프라인 함께 높은 처리량 패션에 칩 Seq를 수행 하기 위한 통합된 플랫폼 부족 되었습니다.
이 프로토콜 설명 종양 조직에 셀 라인, chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 칩 seq 워크플로 쉽게 성공적인 실험에 필요한 단계를 모두 포괄 하는 지침에 따라. 이전 Blecher 고 넨 외. 에 의해 설명 하는 높은 처리량 방법을 채택 하 여 37이 프로토콜 병렬로 샘플의 수십에서 수행할 수 있습니다 그리고 암 세포 선 및 흑색 종, 전립선, 콜론과 세포종 님 같은 인간 종양에 성공적으로 적용 되었습니다. 6 코어 히스톤 수정 인간 흑색 종 세포 선 및 종양 샘플에 epigenetic 규제 프리의 주요 구성 요소를 나타내는 방법을 보여 줍니다. 이러한 수정 포함 H3K27ac (강화), H3K4me1 (활성 및 태세 강화), H3K4me3 (발기인), H3K79me2 (복사할 영역), H3K27me3 (polycomb 억압), 및 H3K9me3 (heterochromatic 억압). 이러한 표시 억압 및 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태를 식별 하기 위해 단독으로 또는 조합에서 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜 chromatin 주에서 인간의 종양 조직 및 세포의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 높은 처리량 칩 seq 모듈을 설명합니다. 어떤 칩 seq 프로토콜에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 특이성입니다. 여기,이 메서드는 설명된 6 히스톤 수정, 모두 칩 등급 및 이전에 우리와 다른 실험실42,,4445 에 검증에 대 한 immun…
The authors have nothing to disclose.
우리는 마커 스 코일, Curtis Gumbs, 시퀀싱 지원에 대 한 MDACC에서 SMF 핵심을 감사합니다. 이 문서에서 설명 하는 작업 SMF 코어 NIH 그랜트 (CA016672)에서 교부 금에 의해 지원 되었다와 NCI K. R. (1K99CA160578 및 R00CA160578) 수상
ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
HBSS | Gibo | 14025092 | |
GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
TE buffer | Promega | V6231 | |
RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
Mixer | Nutator | 421105 | |
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |