Summary
Det här protokollet beskriver en beteendevetenskaplig analys, baserat på Barnes labyrint test, för att studera hur instinktiva defensiva åtgärder modifieras av kunskap om fysisk miljö.
Abstract
Evolutionen har valt ut en repertoar av defensiva beteenden som är nödvändig för överlevnad över alla djurarter. Dessa beteenden är ofta stereotypa åtgärder framkallade svar på medfödd aversiva sensoriska stimuli, men deras framgång kräver tillräckligt med flexibilitet för att anpassa till olika rumsliga miljöer, som kan förändras snabbt. Här beskriver vi en beteendevetenskaplig analys för att utvärdera inverkan av lärda rumslig kunskap på defensiva beteenden hos möss. Vi har anpassat den Barnes labyrint rumsliga minne analysen som används för att undersöka hur möss navigera till ett skyddsrum under flykten Svaren till medfödd aversiva sensoriska stimuli i en ny miljö, och hur de anpassar sig till akuta förändringar i miljön. Denna nya analys är en etologiska paradigm som inte kräver utbildning och utnyttjar de naturliga prospektering mönster och navigering strategier hos möss. Vi föreslår att uppsättningen protokoll som beskrivs här är ett kraftfullt medel för att studera målinriktat beteenden och stimulans-utlöst navigering, vilket bör vara av intresse för båda områdena instinktiva beteenden och rumsliga minne.
Introduction
Instinktiv defensiva beteenden är till stor del anses vara hårdkodade stimulus-respons, såsom C-start rörlighet i fiskar och groddjur, som flyttar djuret från en hot källa1. Defensiva beteenden kan dock vara mer adaptiv om de flexibelt ta hänsyn till information lärt sig om den aktuella miljön. Ett exempel på sådan flexibilitet är växeln från escape för att frysa bilden av gnagare när inför hot, beroende på förkunskaper om närvaron eller frånvaron av en kvinnojour i den miljö2,3. Andra exempel på flexibilitet i medfödda beteenden inkluderar anpassa flygningen inledande tröskeln eller fly hastighet beroende på avståndet mellan ett byte och dess skydd4, avstånd till hot5,6, och tidigare erfarenhet 11 , 12, samt välja olika defensiva strategier beroende på sensoriska egenskaper av aversivt stimulus7, eller ens undertrycka defensiva beteende gentemot konkurrerande motiv såsom hunger8, 9,10. Beroendet av åtgärd val på förvärvade kunskaper om rumsliga funktioner i miljön gör instinktiva defensiva beteenden hos möss en kraftfull modell för att studera mål urval, rumsliga minne och navigering. Här beskriver vi anpassningen av en vanliga beteendemässiga uppgift, Barnes labyrint (BM) spatiala minnet assay13, att fastställa påverkan av den rumsliga miljön på defensiva åtgärder urval i möss, och deras navigering strategier när flyr mot ett härbärge.
Standard Barnes labyrinten för att studera lärande och rumsliga minne i möss består av en cirkulär ~ 90 cm diameter plattform med 20 jämnt fördelade hål, varav 19 är stängda, och leder till en underjordisk shelter som möss söker undvika öppna-fältet miljön av plattformen. Ofta används svaga aversiva stimuli (Summer, starkt ljus, fläkt) kontinuerligt under hela analysen att göra miljön aversiva och därmed främja trätt i shelter14. I den vanligaste analys15,16har djuret en tillvänjning rättegång där det styrs till skyddsrummet manuellt av experimenter omedelbart efter placeras på plattformen. Detta följs av en 4-dagars förvärv period, där varje dag som musen är tillåtet att navigera fritt i labyrinten för 3 min, varefter den igen manuellt styrs till skydd om det inte når det under perioden utforskning. Det sista steget i analysen är en sond rättegång på den 5: e dagen (även om en långsiktigt sju dagars minne prov utförs också vanligen) När djuret utforskar labyrinten med alla hål stängda. Lärande och långsiktigt minne kvantifieras genom den tid det tar att hitta skydd och Petar i fel hål under perioden förvärv och den tid som tillbringas nära sluten kvinnojour hålet i sonden rättegången. Typiska resultat visar en minskning av antalet fel och latens att nå skyddsrummet under förvärv och en ovan-chans andel av tiden i den kvadranten som innehåller stängd målet hål i sonden rättegång15.
Medan flera varianter av BM analysen har varit tidigare beskrivna17,18,har19, det paradigm som vi beskriver här tre grundläggande förändringar från standard-analysen. Första djuret är kvar att utforska labyrinten och hitta skydd på egen hand, och testning görs i samma session, strax efter det att skydd har hittats, under perioder där djuret bedriver undersökande beteende. Även om denna inställning inte test långtidsminne av platsen shelter, är den avsedd att vara en naturalistisk scenario som härmar utforskandet av romanen territorium, under hot av predation. Det kan dessutom test av hur djuren anpassar sig till akuta förändringar i miljön, såsom plötsliga förändringar i landskapet. Det andra är en viktig aspekt av vår analys att experimenter aldrig tvingar djuret i eller ur skyddsrummet, vilket kan förvirra djuret och utesluta sökvägen integration20 som en livskraftig navigering strategi21. Sökvägen integration är en navigering strategi som använder egen rörelse ledtrådar, såsom proprioceptiva och vestibulära ledtrådar, som härrör från integrationen av motor utflöde, att uppdatera den aktuella positionen för djuret och navigera mot ett mål, vilket inte är möjligt om den djur är passivt rörd av försöksledaren. Det tredje använda vi medfödd aversiva visuella22 och auditiv23 stimuli för att framkalla fly till skydd, som är lätt urskiljas från pågående födosökande beteende och tillåter bedömning och kvantifiering av specifika navigering strategier som används under försvar från överhängande hot. Vi föreslår att denna analys kommer att vara användbart för dissekera rollen av rumsliga minne i urvalet och genomförandet av defensiva beteenden, och mer allmänt till det bredare studera målinriktat navigering och rumsliga korttidsminne. De protokoll som beskrivs här infördes genom Vale et al. 2017, som vi hänvisar läsarna mer i djup diskussion av den logiska grunden för experiment och resultat.
Protocol
Alla experimenten utfördes enligt UK djur (vetenskapliga förfaranden) Act 1986 (PPL 70/7652) efter lokala etiska godkännande.
1. ställa in beteendemässiga apparaten
Obs: Den viktigaste komponenten i behavioral apparaten är en variant av Barnes labyrint13 bestående av en vit akryl cirkulär plattform (92 cm i diameter) med 20 ekvidistanta, 5 cm i diameter, runda hål, ligger radiellt, 5 cm från kanten av plattformen . 19 av dessa kommer att vara stängd med svart plast plugg (5 mm djup), medan återstående hålet leder till en svart plexiglas skydd (mått 15 x 5,8 x 4,7 cm) som möss kan enkelt ange och avsluta. Den centrala delen av arenan består av en fast cirkulär plattform (22 cm i diameter) och periferin är monterad på en ram som tillåter rotation över 360 grader genom en datorstyrd stegmotor. Plattformen är förhöjda 45 cm från golvet för att hindra möss från att klättra. Se Schematisk ritning i figur 1.
- Fästa visual ledtrådar till periferin av plattformen (2D eller 3D symboler med olika former, färger och mönster), minst 2 cm från kanten att förhindra möss från att nå dem.
Obs: Exempel på Värdeindikatorer är plain blå fyrkanter av 262 cm2eller cirklar (diameter 15,5 cm) fylld med diagonala lila ränder. - Tillsätt ~ 2 g sängkläder från musens hem-bur till insidan av skydd till fungera som en lokal olfactory cue. Du kan också placera en lysdiod (LED) vid infarten till skyddsrummet att ge en visuell landmärke cue.
- För att isolera musen från externa, montera distala visuella ledtrådar, en åttakantig eller cylindriska väggen, sträcker sig 40 cm ovanför och 15 cm under plattform ytan runt arenan, placerade 10 cm från kanten av plattformen.
- Placera en ultraljud högtalare 50 cm ovanför centrum av plattformen, att leverera aversiva auditiva stimuli.
- Placera en genomskinlig duk 64 cm ovanför arenan till baksidan-project overhead aversiva visuella stimuli med en projektor.
- Den lampan som tillhandahålls av projektorn tänds beteendemässiga apparaten; kalibrera den så att det finns 5-10 lx i mitten av yta. Placera IR lampor och en infraröd kamera ovanför plattformen, med en lång-pass filter (> 700 nm) att förhindra projektorn flimmer i förvärvade videon.
- Spåra positionen av musen online, med hjälp av kommersiellt tillgängliga program eller en lämplig algoritm. För att spåra svarta möss på en vit arena, är en enkel tröskelvärde operation följt av beräkningen av den mask centroiden lämpligt.
- Idealiskt, placera den beteendemässiga apparaten inuti en ljud - och ljus-proof låda, att förhindra att externa signaler påverkar experimentet.
2. att leverera medfödd aversiva Stimuli
Obs: De stimuli som beskrivs nedan kan genereras med ett brett utbud av olika mjukvarupaket, inklusive LabVIEW och Matlab.
- Visuell stimulans
- Projektet stimuli på skärmen placerad 64 cm ovanför arenan. Stimulansen består av en linjärt expanderande mörka cirkel på en grå bakgrund22 (Weber kontrast =-0.98, luminans = 7,95 cd/m2).
Obs: Standard cirkeln bör helst vara centrerad direkt ovanför positionen för musen, subtending en visuell vinkel 2,6 ° vid insättande och expanderar linjärt på 224 ° /s över 200 ms till 47,4 °, där det återstår för 250 ms innan offset. - När levererar visuell stimulans, centrera det ovanför musen. Detta kan uppnås antingen genom att vänta tills musen passerar genom en fördefinierade region i arenan, eller genom att spåra musposition online och med hjälp av spårning koordinater för att definiera mitten av cirkeln.
Obs: Även om vi föreslår att projicera den visuella stimulansen direkt ovanför musen, defensiva beteenden kan också utlösas om samma stimulus projiceras framför musen (medan fortfarande parallellt med golvet). Vår erfarenhet är detta fallet åtminstone tills 30 cm framför musens position.
- Projektet stimuli på skärmen placerad 64 cm ovanför arenan. Stimulansen består av en linjärt expanderande mörka cirkel på en grå bakgrund22 (Weber kontrast =-0.98, luminans = 7,95 cd/m2).
- Auditiv stimulans
- Utlösa ett stimulus som består av ett tåg med tre frequency-modulated upp-sveper från 17 till 20 kHz23 över 3 s, varar 9 s totalt. Ljudtrycksnivån (SPL), mätt på den plattform nivån, bör i ett intervall mellan 73 och 78 dB.
- Anslut ett ljudkort och en förstärkare till ultraljud högtalare placerad ovanför arenan att leverera den auditiva stimulansen.
3. djur:
- Använda manliga eller kvinnliga C57BL/6J möss, mellan 6 och 24 veckor gamla. Behålla djuren på 12 h ljus cykel med fri tillgång till chow och vatten.
- Säkerställa att möss är enda inrymt minst 72 h före beteendevetenskaplig analys och test dem under ljus-fasen av ljuset cykel.
Obs: Finner vi att baslinjen undersökande beteende singel-inrymt möss är mer jämförbar över djur än hela gruppen-inrymt möss. Dessutom djur med kirurgiska implantat för neural aktivitet inspelning eller manipulation ofta behöver vara enda inrymt, och det kan därför vara fördelaktigt att ha kontroll datamängder i samma inhysa villkorar.
4. standard Behavioral Assay:
- Minutiöst rengöra ytan på plattformen med 70% etanol eller ättiksyra att ta bort oönskad lukt ledtrådar. Skölj skyddsrummet med vatten och tvätta det med 70% etanol, varefter den bör sköljas med vatten igen för att minska etanol lukt.
- Torka både plattformen och kvinnojouren grundligt, som musen kan slippa ange skydd om det är vått.
- Randomize platsen för skydd i plattformen för varje prövning av roterande plattformen innan experimentet. Skydd kommer att förankras i arenan, men roteras i förhållande till beteendevetenskaplig apparater inneslutningen.
- Föra musen till experiment rummet i sin hem-bur och placera buren på testning-plattformen under en 10 min acklimatisering.
- Ta bort musen från sin hem-bur och undvika hämtar i svansen: antingen cup den eller låta den klättra upp på ett berikande objekt som kan lyftas. Plocka möss i svansen har varit visar för att öka ångest nivåer och därmed kan påverka beteendemässiga reaktioner på hot24.
- Försiktigt placera musen i mitten av arenan och starta video-förvärvet.
- Möjliggöra en 7 min tillvänjning period, under vilken ingen aversivt stimulus presenteras. Kontrollera att musen har tillräckligt med tid att hitta och ange skyddsrummet minst en gång. Betrakta det som en post om alla fyra extremiteterna är inne i härbärget. 7 min bör vara tillräckligt för de flesta möss att hitta och ange skyddet, men om detta inte sker, förlänga tillvänjning av ytterligare perioder av 5 min tills minst en entré har verifierats.
- Utlösa leveransen av den aversivt stimulansen (auditivt eller visuellt) antingen manuellt genom att observera levande video foder, eller automatiskt genom att spåra placeringen av djuret online och pre definiera en region av intresse i arenan för att utlösa stimulus-leverans När djuret når det. Den visuella stimulansen levereras oftast direkt ovanför djuret med hjälp av online video spårning koordinater.
- För att framkalla mer än en flykt reaktion i samma session, låt musen frivilligt lämna skyddsrummet. Om musen inte lyckats undgå till skyddsrummet vid den sista aversivt stimulansen, vänta minst 60 s innan den presenterar en annan stimulans.
- När analysen är klar, tillbaka djuret till sin hem-bur. Om ytterligare tester med samma mus krävs, vänta minst 48 h innan omanalys.
- Ren plattformen och skydd som beskrivs i steg 4.1 och 4.2 före testning nästa djuret.
Obs: Steg 5, 6 och 7 finns oberoende varianter av standard behavioral analysen och alla kan utföras individuellt.
5. ' navigering strategi' beteende analys:
Obs: Syftet med denna analys är att avgöra vilken cues möss använder att vägleda flykt beteende. I denna analys roteras den rörliga yttre delen av plattformen medan musen är på fasta arena center, som radiellt förflyttar skyddsrummet, lukt ledtrådar ligger innanför vindskyddet och de proximala Värdeindikatorer kopplade till plattformen. Om musen är efter någon av ledtrådar som har roterats för att navigera till vindskyddet, det korrekt kommer att fly till den nya platsen för skydd, men om man använder några andra ledtrådar som har legat på plats, det kommer att gå till föregående skydd plats.
- Utför steg 4.1 till 4.8 i standard behavioral analysen ovan, framkalla minst en flykt svar som ska användas som utgångsvärde.
- Låt musen aktivt lämna skyddsrummet och vänta på att navigera till den centrala delen av plattformen. Placera en liten skål med sängkläder i mitten att uppmuntra utforskning och hålla djuret i den centrala plattformen tillräckligt lång att rotationen av den yttre delen av plattformen. Lägga till skålen och sängkläder medan musen är inuti skydd och efter en lyckad flykt som föregår rotation av plattformen. Om musen inte ange skyddsrummet under flykten svaret, vänta på att frivilligt ange skyddsrummet och sedan lägga till skålen och sängkläder.
- Använd stegmotor att rotera plattform minst 36 grader (2 hål) och sedan omedelbart använda en sinnesretning för att framkalla en flykt reaktion. Det är möjligt att rotation utlöser en skrämsel och även initierar ett fly-svar.
Obs: Från vår erfarenhet, ~ 55% av mössen kommer att köra utanför centrala (icke-roterande)-plattformen medan den yttre delen fortfarande roterar, och dessa prövningar bör undantas från analysen. - Rengör den plattform och husrum och återgå musen till sin hem-bur som beskrivs i steg 4.10 och 4.11.
6 ' dynamisk miljö' beteende analys:
Obs: Denna analys är utformad för att utvärdera hur möss anpassa sina defensiva beteenden till plötsliga förändringar i miljön. Placeringen av skyddsrummet ändras i dessa experiment, efter framkalla minst en flykt reaktion, och musen är tillåtet att besöka det en gång innan en efterföljande flykt reaktion utlöses. Om musen perfekt uppdateras den nya platsen för skydd och beräknar avsaknad av skydd i dess tidigare läge, ska det fly till den nya platsen. Annars antingen det inte har memorerat den nya platsen för skydd eller det har memorerat båda platserna men föredrar att fly till den gamla.
- Utföra denna analys efter steg 4.1 till 4.8 ovan, framkalla minst en flygning reaktion som en kontroll.
- När musen lämnar frivilligt skydd, ta bort vindskyddet och placera det i ett nytt hål på den motsatta änden av plattformen.
- Låt musen för att utforska miljön tills det går in i skydd på sin nya plats.
- När musen frivilligt kommer ur skyddsrummet, finns det med ett aversivt stimulus och observera dess reaktion.
- Använd den auditiva stimulansen för detta experiment på grund av dess längre varaktighet, som under långvarig hot, djur kan utföra ytterligare undkomma Svaren till andra platser om de misslyckas med att hitta skydd först.
- Rengör plattform och skydd och återgå musen till sin hem-bur som beskrivs i steg 4.10 och 4.11.
7 ' inget skydd' beteende analys:
Obs: Syftet med denna analys är att förstå hur avsaknaden av en kvinnojour i miljön påverkar uttrycket av defensiva beteenden.
- Anslut alla 20 hål. I detta experiment finns det inget skydd i arenan.
- Efter rengöring och torkning plattformen (steg 4.1 och 4.2), utför steg 4,4-4,6.
- Tillåta en 7 min tillvänjning period.
- Presentera den visuella stimulansen och observera den defensiva reaktionen. Avsaknaden av en kvinnojour främjar frysning beteende, vanligtvis varar under hela den visuella stimulansen. Använda en långsamt växande plats (t.ex. en cirkel som spänner över en visuell vinkel 2,6 ° vid insättande och expanderar linjärt på 11,2 ° /s över 4 s till 47,4 °, där det återstår för 1 s innan offset) att underlätta observation av frysning svaren.
- Om fler än ett svar per mus krävs, Använd ett mellan stimulus intervall på minst 60 s.
- Efter att erhålla erforderligt antal svar i avsaknad av skydd, införa skydd under ett av hålen och låt musen utforska miljön för minst 5 min. kommer att 5 min vara tillräckligt med tid för de flesta möss att hitta och ange den nyinförda skyddet , men om detta inte sker, förlänga denna tidsfrist med ytterligare 5 min block tills minst en post verifieras.
- Upprepa steg 4.8 och 4.9 och observera undkomma Svaren utförs i närvaro av en kvinnojour i miljön.
- Rengör plattform och skydd och återgå musen till sin hem-bur som beskrivs i steg 4.10 och 4.11.
8. dataanalys:
Obs: Varje följande data analys steg kan utföras självständigt.
- Undkomma Svaren kan lätt identifieras som en plötslig acceleration efter presentationen av ett aversivt stimulus. Kvantifiera svarstiden fly som tiden mellan stimulus presentation och i början av en huvud rotation rörelse riktad mot målet på flykten eller början av accelerationen rörelsen, vilket som kommer först.
- Frysa Svaren kan karakteriseras av total orörlighet av djur utom andas rörelser25, varaktig minst 0,5 s7. Mäta latensen att frysa som tiden mellan början av perioden orörlighet och presentationen av de aversivt stimulansen.
- För varje flykt svar, kvantifiera Linjäriteten av flygbanan genom beräkning av förhållandet mellan avståndet mellan musen och skydd och den faktiska förskjutningen under flygningen.
- För varje flykt svar, beräkna riktigheten genom att mäta avståndet mellan hålet där djuret riktade dess flyg till och i hålet som leder till skyddsrummet. Eftersom det finns 20 hål, varje hål från målet representerar ett dekrement 10% i noggrannhet (t.ex., 2 hål från målet kan uttryckas som 80% noggrannhet)
- För 'navigering strategi' beteende analysen, kvantifiera noggrannheten av svar i förhållande till shelter platsen innan plattform rotation. En genomsnittlig noggrannhet som inte avsevärt skiljer sig från före rotation noggrannhet anger att djuret inte använder någon av de sensoriska signaler som var roteras för att navigera till målet fly.
- För 'dynamisk miljö' beteende analysen, klassificera varje flykt respons som framkallas som riktas mot den nya eller den gamla shelter-platsen eller att ingen av dem. Utvärdera hur mönstret utvecklas längs iterationerna av framkallade defensiva beteenden.
- För 'inget skydd' beteende analysen, jämföra musens hastighet efter presentationen av aversiva visuell stimulans i närvaro och frånvaro av ett härbärge och beräkna svarstiden på inledandet av det defensiva svaren. Dessutom beräkna sannolikheten för att utlösa en frysning svar i svar på stimulans för varje situation.
Representative Results
Möss som utsätts för auditiv eller visuella stimuli inledde snabbt fly svaren med kort fördröjning mellan uppkomsten av stimulering och inledandet av flygning. Den genomsnittliga svarstiden att fly från den visuella stimulansen var 202 ± 16 ms (n = 51 Svaren från 26 djur) och signifikant längre för auditiv stimulering: 510 ± 61 ms (n = 36 Svaren från 15 djur, p< 0,0001 t-test mellan visuella och auditiva stimulering; Figur 2A) (steg 8,1). Undkomma Svaren var exakt riktade till skydd (menar noggrannhet för visuell stimulans: 97,2 ± 1,4% och 95,0 ± 1,4% för auditivt stimulus, inte skiljer mellan två typer av stimuli, p = 0.1655 t-test; Figur 2B) (steg 8,4), och flyg-banor var nära en rät linje (genomsnittlig kvot av förskjutning avståndet till skydd för visuell stimulans 107,3 ± 1,3% och 113,9 ± 1,5% för auditiv stimulans; Figur 2 c) (steg 8,3). Att iaktta en kort latens från stimulans är viktigt att skilja stimulus-framkallat beteende från målsökande körningar, och hög linearitet flyg banan visar att fly svaret har som mål att nå skydd, och inte bara flytta bort från stimulansen.
Stimulus presentation efter rotationen av den utvändiga delen av labyrinten medan musen var stillastående i center-plattformen (intervall = 36° - 90°, menar 56°) framgångsrikt framkallade undkomma svaren (steg 5). Alla möss flydde mot den tidigare platsen för skydd, med ingen minskning av noggrannhet eller linjäritet flyg bana i jämförelse med prövningarna innan rotation. Genomsnittlig noggrannhet, mätt med hänvisning till den ursprungliga shelter positionen, var 96,3 ± 1,3% innan rotation (n = 25 Svaren från 8 möss) och även något högre efter rotation (100 ± 0%, p = 0,009 t-test mellan pre och post rotation). Den genomsnittliga Linjäriteten i förhållande till den ursprungliga platsen för skydd var 109,4 ± 5,0% före rotation (25 svar från 8 möss) och 109,1 ± 2,1%, efter rotation (n = 8 Svaren från 8 möss), p = 0.957 t-test mellan före och efter rotation, figur 3A och B). Dessa resultat visar att proximala Värdeindikatorer inte används att vägleda flyg till skyddsrummet (steg 8,3-8,5).
Ändra placeringen av skydd efter framkalla en lyckad flykt reaktion (steg 6) resulterade i möss som besöker den nya skydd platsen strax efter ändringen (genomsnittlig tid till besöka den ny skydd = 33,1 s, intervall = 4-82 s). Efterföljande sekventiell prövningar av ljud stimulering produceras en gradvis ökning av sannolikheten för att fly till den nya platsen (44,4% på den första rättegången), att nå 100% över alla djur av femte rättegången (n = 9 djur, figur 3 c). Dessa experiment probe dynamiken i Uppdatera skydd läge minnet att anpassa sig till förändringar i miljön (steg 8,6).
Efter en 7 min acklimatisering period kan labyrinten med inget skydd (steg 7), presentationen av en 5 s lång visuell stimulans produceras frysning beteende istället för att fly (frysning sannolikheten = 95,2%, medelvärde frysning tid = 7,9 ± 2,7 s, n = 7 djur). Efterföljande införandet av en kvinnojour i samma session och presentationen av den långa visuell stimulans som framkallas undkomma Svaren tillförlitligt, visar att möss flexibelt kan växla defensiva strategier beroende på närvaron av fristad (figur 3D) ( steg 8,1 och 8.7).
Figur 1: Schematisk av beteendemässiga arenan. Ritning av de viktigaste komponenterna i den beteendemässiga arena tittade på (höger) uppifrån och från sidan (vänster). En stor del av plattformen kan roteras, inklusive skydd och bifogade synintrycken. Mörka ringar i ovanifrån är de hålen som skyddsrummet kan fästas, som är alla identiska (ett exempel skydd läge indikeras). Hela arenan är innesluten i ett ljud-dämpning skåp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Escape svar är snabb och korrekt målinriktade beteenden. (A) svarstid till fly debut från uppkomsten av visuell eller auditiv stimulering. (B) noggrannhet av navigering till skyddsrummet under flykt, mätt så att värdet är 100% om musen kör direkt till skyddsrummet och 10% mindre för varje hål från skyddsrummet (t.ex. 80% om hålet nådde först var två hål ifrån rätta). C förflyttning av musen under flykt plottas mot det linjära avståndet mellan djurets ursprungliga ståndpunkt och målplatsen, visar att flyg är nära linjär. Box och morrhår visar data från 10-90: e percentilen och återstående datapunkterna visas som cirklar. Röd färg tomter är data från auditiv stimulering (n = 36 Svaren från 15 djur) och svart från visuell stimulans (n = 51 Svaren från 26 djur). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: möss inte använder proximala Värdeindikatorer eller skydd-relaterade signaler för att vägleda undkomma svaren. (A) förskjutning tomt som i figur 2 c, för svaren före och efter rotationen av plattformen. B riktigheten i navigering under flykten i före och efter rotation villkor. Efter rotation noggrannhet mäts med hänvisning till den ursprungliga platsen för skydd, och visar att möss navigera tillbaka till den ursprungliga platsen för skydd i stället den nya positionen. (C) bråkdel av undkomma Svaren riktad mot den nya skydd platsen plottas mot stimulering nummer. Efter 5th presentationen av stimulans, alla djuren fly direkt mot den nya skydd-platsen (n = 9 djur). (D) menar hastighet över djuren som svar på visuell stimulering med skydd tillgängliga (röd) eller frånvarande (blå), visar fly och frysning svaren, respektive. Hastighet har varit normaliserad till baslinjen och anpassas till reaktionstid (definierat som antingen i början av en flygning eller frysning svar, streckad linje). Skuggade områden visar SEM. (n = 7 djur). Visar data från 10-90: e percentilen för 2A och 2B, box och morrhår och återstående datapunkterna visas som cirklar. Röd färg tomter är data från auditiv stimulering före plattform rotation (n = 25 Svaren från 8 djur) och blå är från svaren efter roterande plattformen (n = 8 Svaren från 8 djur). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De analyser som vi beskriver här är tekniskt enkel att utföra, och med undantag av plattformen rotation experiment, lätt kan genomföras i en standard Barnes labyrint. Dock några komplikationer kan uppstå: å ena musen kan tyckas vara rädd för att ange skydd, som inte kan på grund av skydd är tillräckligt rengjorda eller torkade. Däremot, kan musen stanna inne skyddsrummet under mycket lång tid. Det är avgörande för dessa experiment att djuren aldrig avlägsnas från tak manuellt, eftersom detta kan störa sökvägen integration samt nöd djuren och deras reaktion på hotet. Vi föreslår att avsluta experimentet efter 90 min och omanalys efter 48 h vid behov. Ett annat relevant praktisk övervägande är att när musen undersöker kanten av plattformen, inte kan den detektera en visuella stimuli om dess huvud är vinklat över kanten, och således rekommenderar vi undanhålla stimuli i sådana situationer. Dessutom kan möss hoppa ner från plattformen vid sällsynta tillfällen. Vi föreslår att avsluta experimentet och omanalys efter 48 h. möss som aktivt lämnar plattformen en gång är sannolikt att göra det igen i framtiden och kan behöva exkluderas från studien. Slutligen, från vår erfarenhet, de flesta möss svarar på visuell stimulans (34/36 möss). Dock om mössen inte visar någon typ av svar på visuell stimulans (antingen en skrämsel, en flygning eller en frysning svar), bör de undantas från studien.
En viktig punkt att överväga är att kontroll av sensoriska signaler är vanligtvis ett problem i rumsliga minne analyser, som ofta är det svårt att eliminera alla former av kontaminerande ledtrådar. Våra experiment minskar yttre visuella referenser av omgivande labyrint med en vägg, och den är placerad inuti en ljud-dämpning skåp för ljudisolering. För att minimera lukt ledtrådar, rekommenderar vi grundlig rengöring set-up med 70% etanol eller ättiksyra mellan experiment.
Vårt beteende analys lägger till föregående metoder för att studera spatial navigering26 med hjälp av instinktiva defensiva beteenden sond rumsliga minne och med fokus på etologiska scenarier. En avgörande skillnad mellan de förfaranden som beskrivs här och standard BM analysen är bristen på träningspassen. I våra analyser säkerställer perioden tillvänjning att musen besöker kvinnojouren minst en gång och ofta många fler gånger, vilket vi har tidigare visat sig vara tillräckligt för att memorera det skydd läge2. Vi tror att en viktig anledning till den hög framgång och noggrannhet att hitta skydd trots bristen på utbildning aldrig passivt undantränger djuret under experimentet, vilket gör sökvägen integration en livskraftig navigering strategi. Vi noterar emellertid att vår analys behandlar minne bildas och utvärderas under en session, och att vi inte har testat för långtidsminnet skydd läge, som vanligtvis är syftet med standard BM experiment. Slutligen, med diskret medfödd aversiva stimuli snarare än den vanliga fläkt eller buzz under hela sessionen, vår analys ger mycket god experimentell kontroll över två beteenden som kanske använder olika navigering strategier: födosök och skydd-regisserad fly. Vi anser att användningen av dessa analyser i kombination med modern neurovetenskap tekniker för inspelning och manipulera neural aktivitet kan ge viktiga insikter i hur neurala kretsar beräkna beteende.
Disclosures
De flesta av de uppgifter som ingår i resultatavsnittet är en delmängd av de data som presenteras i Vale et. al 2017.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av en Wellcome Trust/Royal Society Henry Dale Fellowship (098400/Z/12/Z), en medicinsk forskning rådet (MRC) bevilja MC-UP-1201/1, Wellcome Trust och Gatsby Charitable Foundation SWC gemenskap (till T.B.), MRC doktorandtjänst (D.E. och R.V) och ett Boehringer Ingelheim Fonds PhD stipendium (till R.V). Vi tackar Kostas Betsios för programmering data förvärv programvaran, de LMB mekaniska och elektriska Workshops för att bygga den experimentella arenan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared iluminators TV6700 | Abus | - | |
| DLP projector Infocus IN3126 | Infocus | 0001740992-00000001 | |
| Ultrasound speaker Pettersson L60 | Pettersson Elektronik | - | |
| Amplifier QTX PRO240 | QTX | - | |
| Soundcard Xonar D2 | Asus | 90-YAA021-1UAN00Z | |
| HP Z840 desktop | HP | F5G73AV | |
| 100 micron drafting film | Xerox | 3R98145 | |
| Near infrared camera: Basler acA1300-60gmNIR | Basler | 106202 | |
| National Instruments BNC-2110 | National instruments | 777643-01 | |
| LabVIEW 2015 64-bit | National instruments | - | |
| Custom made Barnes maze | MRC Laboratory of Molecular Biology mechanical workshop | - |
References
- Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The Mauthner-initiated startle response in teleost fish. J Exp Biol. 66 (1), 65-81 (1977).
- Vale, R., Evans, D. A., Branco, T. Rapid Spatial Learning Controls Instinctive Defensive Behavior in Mice. Curr Biol. 27 (9), 1342-1349 (2017).
- Blanchard, R. J., Flannelly, K. J., Blanchard, D. C. Defensive behavior of laboratory and wild Rattus norvegicus. J Comp Psychol. 100 (2), 101-107 (1986).
- Dill, L. M., Houtman, R. The influence of distance to refuge on flight initiation distance in the gray squirrel (Sciurus carolinensis). Canadian Journal of Zoology. 67 (1), 233-235 (1989).
- Blanchard, R. J., Blanchard, D. C., Rodgers, J., Weiss, S. M. The characterization and modelling of antipredator defensive behavior. Neurosci Biobehav Rev. 14 (4), 463-472 (1990).
- Fanselow, M. S., Lester, L. S. A functional behavioristic approach to aversively motivated behavior: Predatory imminence as a determinant of the topography of defensive behavior. Evolution and learning. , (1988).
- De Franceschi, G., Vivattanasarn, T., Saleem, A. B., Solomon, S. G. Vision Guides Selection of Freeze or Flight Defense Strategies in Mice. Curr Biol. 26 (16), 2150-2154 (2016).
- Bräcker, L. B., et al. Essential role of the mushroom body in context-dependent CO 2 avoidance in Drosophila. Current Biology. 23 (13), 1228-1234 (2013).
- Ghosh, D. D., et al. Neural architecture of hunger-dependent multisensory decision making in C. elegans. Neuron. 92 (5), 1049-1062 (2016).
- Bellman, K. L., Krasne, F. B. Adaptive complexity of interactions between feeding and escape in crayfish. Science. 221 (4612), 779-781 (1983).
- Rodgers, W., Melzack, R., Segal, J. "Tail flip response" in goldfish. Journal of comparative and physiological psychology. 56 (5), 917 (1963).
- Dill, L. M. The escape response of the zebra danio (Brachydanio rerio) II. The effect of experience. Animal Behaviour. 22 (3), 723-730 (1974).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Physiol Psychol. 93 (1), 74-104 (1979).
- Pompl, P. N., Mullan, M. J., Bjugstad, K., Arendash, G. W. Adaptation of the circular platform spatial memory task for mice: use in detecting cognitive impairment in the APP(SW) transgenic mouse model for Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 87 (1), 87-95 (1999).
- Patil, S. S., Sunyer, B., Höger, H., Lubec, G. Evaluation of spatial memory of C57BL/6J and CD1 mice in the Barnes maze, the Multiple T-maze and in the Morris water maze. Behavioural Brain Research. 198 (1), 58-68 (2009).
- Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Protocol Exchange. , (2007).
- Attar, A., et al. A shortened Barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 8 (11), e80355 (2013).
- Harrison, F. E., Reiserer, R. S., Tomarken, A. J., McDonald, M. P. Spatial and nonspatial escape strategies in the Barnes maze. Learn Mem. 13 (6), 809-819 (2006).
- Leary, T. P., Brown, R. E. The effects of apparatus design and test procedure on learning and memory performance of C57BL/6J mice on the Barnes maze. J Neurosci Methods. 203 (2), 315-324 (2012).
- Mittelstaedt, M. -L., Mittelstaedt, H. Homing by path integration in a mammal. Naturwissenschaften. 67 (11), 566-567 (1980).
- Stackman, R. W., Golob, E. J., Bassett, J. P., Taube, J. S. Passive transport disrupts directional path integration by rat head direction cells. J Neurophysiol. 90 (5), 2862-2874 (2003).
- Yilmaz, M., Meister, M. Rapid innate defensive responses of mice to looming visual stimuli. Curr Biol. 23 (20), 2011-2015 (2013).
- Mongeau, R., Miller, G. A., Chiang, E., Anderson, D. J. Neural correlates of competing fear behaviors evoked by an innately aversive stimulus. J Neurosci. 23 (9), 3855-3868 (2003).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Paylor, R., Tracy, R., Wehner, J., Rudy, J. W. DBA/2 and C57BL/6 mice differ in contextual fear but not auditory fear conditioning. Behavioral neuroscience. 108 (4), 810 (1994).
- Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents. Behav Brain Res. 203 (2), 151-164 (2009).
