Visualisatie van corticale Modules in afgeplatte zoogdieren Cortices
Summary
Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het verkrijgen van afgevlakte tangentiële secties van zoogdieren afkomstig cortices en visualiseren van corticale modules met behulp van histochemische en immunohistochemische methoden.
Abstract
De cortex van de hersenen van zoogdieren is parcellated in verschillende substructuren of modules. Corticale modules meestal parallel aan de corticale blad liggen, en kunnen worden afgebakend door bepaalde histochemische en immunohistochemische methoden. In deze studie markeren we een methode om te isoleren van de cortex van de hersenen van zoogdieren en hen om te verkrijgen van secties parallel aan de corticale blad plat. We verder hoogtepunt geselecteerd histochemische en immunohistochemische methoden voor het verwerken van deze afgeplatte tangentiële secties om te visualiseren corticale modules. Wij voeren in de Somatosensorische cortex van verschillende zoogdieren, cytochrome oxidase histochemie te onthullen lichaam kaarten of corticale modules vertegenwoordigen verschillende delen van het kadaver van het dier. In de mediale Entorinale cortex, een gebied waar raster cellen worden gegenereerd, maken we gebruik van immunohistochemical methoden om te markeren van modules van genetisch bepaalde neuronen die zijn gerangschikt in een rasterpatroon in de corticale blad over verschillende soorten. Wij bieden over het algemeen een kader te isoleren en te bereiden layer-wise afgevlakt corticale secties, en visualiseren van corticale modules met behulp van histochemische en immunohistochemische methoden in een breed scala van zoogdieren hersenen.
Introduction
Enkele van de belangrijkste veranderingen in de hersenstructuur over fylogenie kunnen worden waargenomen in de hersenschors. Ondanks aanzienlijke verschillen, de cortex van de dieren volgt een gemeenschappelijk patroon en kan grofweg worden verdeeld in twee verschillende manieren, door lagen en gebieden1. Corticale lagen liggen evenwijdig aan het oppervlak van de hersenen en variëren in getal van 3 lagen in reptiel cortices2 tot 6 lagen in zoogdieren cortices1. Corticale gebieden aan de andere kant zijn verschillende regio’s van de cortex, die grotendeels overeenkomen met verschillende functies, bijvoorbeeld, de Somatosensorische cortex is betrokken bij het gevoel van aanraking of de visuele cortex bij de verwerking van visuele ingangen. Deze corticale gebieden kunnen vaak worden onderverdeeld in patches of modules3, die regelmatig anatomische structuren herhalen, in wezen gevonden parallel aan het pial oppervlak van de hersenen. Corticale modules kunnen worden beperkt tot een bepaalde laag4of uitbreiden over meerdere lagen5.
Standaard vectorafbeeldingsbestanden methodes van de hersenen omvatten secties loodrecht op het glasoppervlak van de hersenen, zoals coronale of Sagittaal. Terwijl deze methoden kunnen worden gebruikt om te visualiseren corticale modules, kan een veelheid van interessante eigenschappen worden onthuld wanneer de corticale modules worden gevisualiseerd tangentieel, in een vlak evenwijdig aan het oppervlak van de hersenen. Bijvoorbeeld, somatosensorische modules in de knaagdier hersenen vertegenwoordigen snorharen, worden weergegeven als vaten wanneer gevisualiseerd loodrecht op het glasoppervlak van de hersenen, en dus de regio’s de naam vat cortex ontlenen. Echter, op het visualiseren van de vaten in de stand van een tangentiële, onthullen ze een Bakkebaard-kaart, met de vaten wordt vastgelegd in een topografische oriëntatie spiegeling van de exacte indeling van de snorharen op het oppervlak van de externe instantie. In bepaalde gevallen, modulaire regeling is zelfs ontsnapt aan de detectie voor een aanzienlijke periode, wanneer gevisualiseerd op een niet-tangentiële wijze. De mediale Entorinale cortex, staat bekend om de aanwezigheid van cellen van de grid, neuronen die brand in een regelmatige zeshoekig patroon wanneer een dier is het doorlopen van een omgeving. Hoewel het is een zwaar onderzochte gebied, tot onlangs, de aanwezigheid van patches of modules van cellen in de mediale Entorinale cortex, die fysiek zijn neergelegd in een zeshoekig patroon6, was ontsnapt aan detectie. De aanwezigheid en de opstelling van deze modules, in de rat hersenen, werd vergemakkelijkt door het maken van tangentiële secties van de mediale Entorinale cortex en de cytoarchitecture op een layer-wise wijze te onderzoeken.
Na het segmenteren, kan het specifieke aspect van visualisatie van corticale modules ook worden gerealiseerd op meerdere manieren. Klassiek, hebben studies afgebakend modules gebaseerd op cel dichtheid of glasvezel lay-out1. Een andere populaire benadering is het gebruik van cytochroom oxidase histochemie, die gebieden van hogere activiteit8 onthult. Nieuwere benaderingen omvatten kijken naar genetisch bepaalde celtypen, onderscheiden op grond van hun eiwit expressie profielen6,8.
In deze studie markeren we methoden voor het isoleren van de cortex van de hersenen van zoogdieren, verkrijgen van afgevlakte tangentiële secties, en visualiseren van corticale modules op basis van cytochroom oxidase histochemie en immunohistochemistry van celtype specifieke proteïnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modulariteit in de hersenschors heeft geïdentificeerd met behulp van een verscheidenheid van technieken. De vroegste corticale modules van de studies die normaal gesproken aangeduid door beide visualiseren cel dichte regio’s, of een gebrek aan vezels1. Volgende methoden hebben gebruikt de aanwezigheid van dendritische bundels24, afferents van een bepaalde regio25, of de verrijking van neurotransmitters26. Wij tonen hier twee …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Humboldt-Universität zu Berlin, de Bernstein-Center for Computational Neuroscience Berlijn, het Duitse centrum voor neurodegeneratieve ziekten (DZNE), het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek (goedgekeurd, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure, en de Gottfried Wilhelm Leibniz prize van de DFG. Wij danken Shimpei Ishiyama voor uitstekende grafische vormgeving en Juliane Diederichs voor uitstekende technische bijstand.
Materials
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps – Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps – Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps – Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears – 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. . Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- . Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- . Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of “barrels” in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?. Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal’schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. . Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. . Map projections–A working manual (Vol. 1395). , (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
