Denna artikel beskriver en detaljerad metod för att erhålla tillplattade tangentiella snitt från däggdjur cortices och visualisera kortikala moduler med histochemical och immunohistokemiska metoder.
Cortex i däggdjurs hjärnor är parcellated in i distinkta underordnade strukturer eller moduler. Kortikala moduler vanligtvis lieparallell till kortikala blad och kan avgränsas av vissa histochemical och immunohistokemiska metoder. I denna studie belyser vi en metod för att isolera cortex från däggdjurs hjärnor och platta till dem för att få avsnitt parallell till kortikala blad. Vi ytterligare höjdpunkt utvalda histochemical och immunohistokemiska metoder att bearbeta dessa tillplattade tangentiella sektioner för att visualisera kortikala moduler. I somatosensoriska cortex av olika däggdjur utför vi cytokrom oxidas histokemi avslöja kropp kartor eller kortikal moduler som representerar olika delar av kroppen av djuret. I mediala entorhinal cortex, ett område där rutnätsceller genereras, använder vi immunohistokemiska metoder för att markera moduler av genetiskt betingade nervceller som är ordnade i ett rutnät-mönster i bladet kortikala över flera arter. Sammantaget ger vi en ram för att isolera och förbereda layer-wise tillplattad kortikala sektioner och visualisera kortikala moduler med histochemical och immunohistokemiska metoder i en mängd olika däggdjurs hjärnor.
Några av de mest betydande förändringarna i hjärnans struktur över fylogeni kan observeras i hjärnbarken. Trots betydande skillnader, cortex av djur följer ett gemensamt mönster och kan delas på två olika sätt, genom lager och områden1. Kortikala skikt ligga parallellt med ytan av hjärnan och varierar i antal från 3 lager i reptils cortices2 till 6 lager i däggdjur cortices1. Kortikala områden är däremot distinkta områden av hjärnbarken som till stor del motsvarar distinkta funktioner, t.ex., somatosensoriska cortex är involverat i känslan av beröring eller syncentrum i bearbetning visuella ingångar. Dessa kortikala områden kan ofta delas in i fläckar eller moduler3, som regelbundet återkommande anatomiska strukturer, i huvudsak hittade parallell till pial ytan av hjärnan. Kortikala moduler kan begränsas till en viss lager4, eller sträcker sig över flera lager5.
Snittningen standardmetoder i hjärnan innebär sektioner normala till ytan av hjärnan, som koronalt eller sagittal. Medan dessa metoder kan användas för att visualisera kortikala moduler, kan en mängd intressanta funktioner avslöjas när modulerna kortikala visualiseras tangentiellt, i ett plan parallellt med ytan av hjärnan. Exempelvis somatosensoriska moduler i gnagare hjärnan som representerar morrhår, visas som fat när visualiseras normalt att hjärnan ytan, och därmed regionerna härleda namnet fat cortex. Dock på visualisera fat i en tangentiell riktning, avslöjar de en morrhår-karta, med tunnorna placeras i en topografisk orientering spegling exakta layouten på morrhåren på yttre kroppsytan. I vissa fall moduluppställning även har undgått upptäckt för betydande perioder, när visualiseras på ett icke-tangentiella sätt. Den mediala entorhinal cortexen, är känd för förekomsten av rutnätsceller, nervceller som eld i ett regelbundet hexagonala mönster när ett djur korsar en miljö. Även om det är ett tungt undersökta område, tills nyligen, förekomsten av fläckar eller moduler av celler i mediala entorhinal cortex, hade som fysiskt är lagda i ett hexagonalt mönster6, undgått upptäckt. Närvaro och arrangemang av dessa moduler, i råtthjärna, underlättades av att göra tangentiella sektioner av mediala entorhinal cortex och utreda cytoarchitecture på ett sätt som konstruktionsdata.
Efter snittning, kan den särskilda aspekten av visualisering av kortikala moduler också realiseras på flera sätt. Studier har klassiskt, avgränsad moduler baserade på cell densiteten eller fiber layout1. En annan populär metod är användningen av cytokrom oxidas histokemi, som avslöjar områden av högre aktivitet8. Nyare metoder inkluderar tittar på genetiskt bestämd celltyper, distingerad på grundval av deras protein uttryck profiler6,8.
I denna studie belyser vi metoder för att isolera cortex från däggdjurs hjärnor, få tillplattade tangentiella snitt och visualisera kortikala moduler baserade på cytokrom oxidas histokemi och immunohistokemi av celltyp specifika proteiner.
Modularitet i hjärnbarken har identifierats med hjälp av olika tekniker. De tidigaste studier vanligtvis identifieras kortikala modulerna genom att antingen visualisera cell tät regioner, eller avsaknad av fibrer1. Efterföljande metoder har utnyttjat förekomsten av dendritiska buntarna24, afferenter från en viss region25eller anrikning av signalsubstanser26. Här visar vi två tekniker, a cytokrom oxidas histokemi och (i…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Humboldt-Universität zu Berlin, Bernstein Center for Computational neurovetenskap Berlin, den tyska Center för neurodegenerativa sjukdomar (DZNE), den tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure och Gottfried Wilhelm Leibniz pris av DFGEN. Vi tackar Shimpei Ishiyama för utmärkt grafisk design och Juliane Diederichs för utmärkt teknisk assistans.
Cytochrome oxidase staining | |||
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antigen retrieval | |||
Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemistry | |||
Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mounting or freezing media | |||
Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alcohol dehydration | |||
Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Devices/tools | |||
Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
Dumont #55 Forceps – Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5 Forceps – Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
Dumont #5SF Forceps – Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Bone Shears – 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
Surgical Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |