Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג הכדאיות גבוהה, תשואה גבוהה של hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal של הכבד. זו מושגת על ידי פרפוזיה הכבד עם פתרון collagenase IV סוג דרך וריד שער הכבד, ואחריו דיפרנציאלית צנטריפוגה כדי להשיג hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal.
Abstract
פרוטוקול זה מדגים שיטה להשגת תשואה גבוהה ועל יכולת הקיום hepatocytes העכבר, תאי אנדותל sinusoidal (שניות) מתאימה culturing או להשגת תא lysates. ב פרוטוקול זה, וריד שער הכבד משמש כאתר צנתור, יותר מאשר את הווריד הנבוב, כמו זה מגביל זיהום של סוגי תאים אפשריים אחרים בהכנת הכבד הסופי. מכשור מיוחד לא נדרש לכל אורך ההליך. אמבט מים משמש כמקור חום כדי לשמור על הטמפרטורה של כל מאגרי ואת פתרונות. משאבה סחרור סטנדרטי משמש כדי להסיע את הנוזלים, צנטריפוגה שולחני בקירור נדרש עבור ההליכים צנטריפוגה. המגבלה היחידה של טכניקה זו הוא המיקום של הצנתר בתוך וריד שער הכבד, אשר הוא מאתגר על חלק העכברים בטווח גודל 18-25 גרם. יתרון שיטה זו הוא ווריד אחד בלבד הוא מנוצל עבור זלוף הגישה הווריד היא מהירה, אשר ממזער איסכמיה, פגיעה reperfusion של הכבד, מפחיתה את תאי הכבד הכדאיות. יתרון נוסף פרוטוקול זה היא שזה קל להבחין חי בין hepatocytes מת. על ידי מאור בשל ההבדל בצפיפות הסלולר במהלך השלבים צנטריפוגה. תאים של פרוטוקול זה עשוי להיות בשימוש תרבית תאים עבור כל יישום במורד הזרם כמו גם מעובד עבור כל הערכה הביוכימי.
Introduction
זלוף collagenase של הכבד, כדי להשיג hepatocytes בוצעה מאז שנות ה-50, שופר ללא הרף על1,2,3,4. סקירה יפה של רבים של מתודולוגיות, שיטות, ריאגנטים המשמשים לטיהור הכבד תא נאסף מאייר ואח5. השגת תשואה משביעת רצון של hepatocytes מאוד מעשית, שניות הוא מאתגר מבחינה טכנית. כוחות מכני להפרדת התאים כולל את האיכות של collagenase הם חלק המשתנים קשים לשליטה. בשל רגישות hepatocyte לכוחות מכני, הכדאיות שלהם פוחת במידה ניכרת בתנאים תת אופטימלית, המבקשת את הצורך פרוטוקול המתאר תנאים אופטימליים עבור בידוד. שניות להיראות לא רגישים כמו חיתוך מכני. זלוף בחיי עיר collagenase עיכול הוא ללא ספק השיטה הטובה ביותר כדי לשבש את צמתי תא-תא להשיג תכשירים תא בודד של הכבד ואיברים אחרים כגון המעי וה טחול6. פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה ידביקו זלוף מאגר וריד שער הכבד באמצעות צנתר פלסטיק נשלף מאשר בחתך שעלולה לגרום וריד שער הכבד לכווץ, כמתואר ב- Smedsrød et al7.
המטרה של כתב יד זה היא להדגים את השלבים הקריטיים ביותר הנדרשים להצלחה במסגרת ההליך שמלבלב הכבד. השלבים הבאים כוללים מיקום הצנתר, זרימה של נוזלים זלוף, וכן טיפול של הרקמה לאחר עיכול. זרימה תעריפי מנוכי עונתיות מעל הקצב הטבעי של זרימת הדם, אבל מספיק נמוך כדי לשמור הכמוסה של גליסון ללא שינוי. לאחר הכבד מתעכלת כראוי, תאים מופרדים בתמיסה, תא טיהור היא פשוטה יחסית אם זה מבוצע על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, אדהזיה צלחת, או חרוז מגנטית טיהור. Hepatocytes בשידור חי יש צפיפות גבוהה יותר, וגופם מטוהר בקלות תאים nonparenchymal (NPCs), hepatocytes מת עם מהירות איטית צנטריפוגה. עבור מרבית היישומים, צלחת אדהזיה הפרדת Kupffer תאים (kcs ב), שניות היא נפוצה השיטה8, אך ישנם דיווחים כי זה אינו מייצר את טוהר שניות9הטוב ביותר. Kcs ב יש לך נטייה לדבוק מוצק משטחים קשיחים במהירות והם פטרי (פוליסטירן סטנדרטי) החומר הנפוץ ביותר עבור הליך זה. טיהור שניה או KC עם השימוש של נוגדן מצומדת beads מגנטי הוא ללא ספק השיטה הטובה ביותר לטיהור משמעותית של תאים אלה, למרות ההליך מוסיף עוד 3-4 h על גבי פרוטוקול זה התשואה הכוללת הוא ירד9. דו ח זה מדגים באופן מפורט תהליך זלוף הכבד אופטימלית המניבה בדרך כלל מספר גבוה של התאים קיימא.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים המתוארות ב פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) ב אוניברסיטת לינקולן - נברסקה תחת פרוטוקול #1435.
1. הכנה
- אופן ההכנה של פתרונות ומדיה תרבות
- להכין את כל מאגר לפי הטבלה של חומריםומדיה תרבות.
- הכנת כלי נגינה
- להגדיר באמבט מים (> 10 L)-42 ° C, משאבה סחרור עם מהירות משתנה, אבזמי מחזיק מבחנות. להכין מספריים מעוגלים מלקחיים (איור 1).
- או בסמוך לאמבט מים, להגדיר את גיליון האפייה (בערך 38 x 26 ס"מ) עם כרית קלקר (50 מ ל חרוט ארון תקשורת), ועליהן. underpad ספיגה לחתוך חתיכה 20 x 20 ס מ (איור 1).
- מניחים חתיכת המסיכה קלטת (5-8 ס מ) בקרבת מקום. במקום חוט תפירה פוליאסטר 20 ס מ בקרבת מקום זה גזור ומוכן לשימוש. להשיג צנתר פלסטיק עם מחט לשליפה (7 מ מ x 19 מ מ, איור 1).
- הכנת כלי זכוכית
- באמצעות מלחציים, מקום, לשתק בקבוקון 1 ליטר באמבט מים המכיל 200 מ של PBS x 1 עם פקק בעל שני פיפטות של 1 מ"ל נכנס הפתרון. פקק גומי מחורץ כדי לאפשר recirculation של נוזל במעגל סגור.
- עם מלקחיים, במקום בקבוקון 125 מ ל המכיל 45 מ של מאגר 2 יחד עם פקק בעל 2 פיפטות של 1 מ"ל, שאחת מהן היא בתוך הנוזל ליד החלק התחתון של הבקבוק והשני אשר נשאר מעל הנוזל ומפוצץ חמצן לתוך הבקבוק.
הערה: כל פיפטה, פקקים יהיה מהיר נתק את מתאם המצורפת לקצה עבור החלפה של הצנרת. חמצן זורמים בעדינות לתוך שתי מבחנות דרך פיפטה של פקק זה לא שקועה בתוך הנוזל. - להפריש שתי מנות התגבשות סטרילי.
2. שגרת חיים
- לחמם את הפתרונות PBS ו- 2 מאגר 42 ° C באמבט מים, הפיצו PBS לפחות 20 mL/min בהצנרת במעגל סגור כדי לחמם את הקווים נוזלי. לטבול כל צינורות עודף באמבט מים להישאר קרוב ככל האפשר ל 42 º C. מרוקנים את הסוף זכר של הצנרת לתוך PBS המכיל הבקבוקון 1 ליטר.
- במקום כדור צמר גפן על underpad סופג ולהוסיף בערך 2 מ ל 30% איזופלוריין (המורכב ב פוליאתילן גליקול 200 אשר מפחית את קצב אידוי של איזופלוריין) על הכדור כותנה באמצעות פיפטה של העברה.
- הרם את העכבר בזנבו, למקם אותו באחד הכלים crystallizing, ואז להפוך את המנה על כדור צמר גפן במהירות כך העכבר יש רווח קטן שבו לשאוף ההרדמה. לבחון את קצב הנשימה של העכבר ולהבטיח שהעכבר הוא יעיל תחת הרדמה.
הערה: קצב הנשימה צריכה להיות איטית ועמוקה, הזנב רפוי, את כפות רגליו מצבו במבחן קמצוץ בהרדמה; ראה הנחיות IACUC לפרטים נוספים. - בזמן העכבר נמצא תחת הרדמה (זה לוקח 1-2 דקות), הכן הקנה של מזרק 10 מ"ל על ידי הוצאת הבוכנה והכנסת כדור צמר גפן קטנים. להוסיף 1-2 מ ל 30% איזופלוריין עם פיפטה העברת הכדור כותנה בתוך החבית ולמקם החבית open-end למטה על השולחן בעת המתנה העכבר כדי להפוך ללא הכרה.
- מהר להוריד את המנה crystallizing, הפוך את העכבר על גבו ולמקם החבית המזרק מעל האף שלה. שח כפול קצב הנשימה, קמצוץ הבוהן, וזנב רפוי. תגובות על הבוהן קמצוץ וזנב רפוי מציין כי העכבר אינו מלא תחת הרדמה. לשמור את הקנה המזרק מעל החוטם כדי לשמור על חוסר הכרה.
- המקום האגודל tacks דרך כפות רגליו של העכבר, עם הגפיים מתוחות במצב פרקדן. הרטב את הבטן ואת הצלעות עם אלכוהול איזופרופיל 70% או אתנול.
- עם המלקחיים ישר ביד אחת, מרים את העור ליד הבסיס של הבטן. עם מספריים ביד אחרים, לחתוך את העור והפופולרית, הצפק. החתך צריך להיות אופקי או על פני הבסיס של העור והפופולרית. יש להקפיד לחתוך דרך כל השכבות של העור, צפק כדי לקבל גישה אל הבטן. חותכים רוחבית סביב הבטן עד הצלעות משני הצדדים ללא חותך את כל האיברים.
- לחתוך את פיסת עור על ידי חיתוך לרוחב הצלעות התחתון. להזיז את המעיים מימין עם האחורי של המלקחיים לחשוף את וריד שער הכבד.
הערה: דימום מהחיה צריך להיות מינימלי; צריך החיה עדיין לנשום תחת הרדמה עמוקה. - המקום סגור המלקחיים מעוקל מתחת וריד שער הכבד בין הכבד pancreaticoduodenal מעולה וריד (איור 3 חץ).
- פתח את המלקחיים בזמן מתחת וריד שער הכבד. החוט ומשוך בזהירות כך ממורכזת מתחת וריד שער הכבד. לקשור קשר בוהן סביב וריד שער הכבד בלי cinching זה למטה.
- מקום המלקחיים מעוקל תחת וריד שער הכבד, משוך אותו בעדינות לכיוון הזנב של העכבר כדי לסדר את הווריד (איור 4א).
- עם הצנתר וביד השנייה, הניחו השיקוע של המחט, פנים כלפי מעלה ואת מקבילים עם החלק התחתון של וריד שער הכבד ליד המלקחיים (איור 4B).
- לנקב את הווריד בעדינות עם המחט (איור 4C). ודא שהשיקוע של המחט נמצא לומן של הווריד. . משכי את המחט הקופצני, להמשיך לדחוף את הצנתר פולימר דרך הווריד של עד השיקוע ליד אזור מסועף ורידים. . זה בתוך הכבד. אם הצנתר ממוקם כראוי, הגב-נזילת דם יהיה גלוי. (איור 4D).
- להדק את קשר בוהן, למשוך את זה מה שיעזור לייצב אותו. מיד להנמיך את שער משאבת בין 20 mL/min 4 mL/min וחותכים עוד כלי דם גדולים ניקוז. חותכים את abdominalis העורקים לקבלת תוצאות אופטימליות.
- מקום לסוף זכר הצנרת עד הסוף הנשי של הקטטר (איור 5א). ודא כי ישנם אין בועות אוויר בתוך הקו. להיזהר כי הצנתר אינה גם דחפה את הכבד או את הווריד. השמה של החוט אינה חיונית, אם כי היא מסייעת למנוע זרימה חזרה החוצה הווריד ומסייעת לשמור את הצנתר בתנוחה הנכונה (איור 5ב, ג).
- השתמש המסיכה קלטת כדי לשתק את הצנרת על גבי underpad. השתמש המלקחיים ישר כדי לסחוט את כלי הדם קולחים לנפח את הכבד כמה פעמים כדי להבטיח כל הדם יש אזל (איור 5D).
הערה: הקלטת מעבדה סטנדרטיים לא יפעלו; עם זאת, המסיכה קלטת יישארו דבוקות underpad, אפילו בתנאים רטובים.
3. הכבד זלוף
- ואילו הכבד הוא שטיפה עם PBS, למדוד החוצה על 24 מ ג IV סוג Collagenase, ממקמת הבקבוקון המכיל 45 מ של מאגר 2 באמבט מים. הקפד מערבולת הנוזל בתוך הבקבוק כך collagenase באופן מלא התפרקה ולמקם את הבקבוק בחזרה המלחציים כך החלק המכיל נוזלי + בקבוקי שתייה צידניות באופן מלא שקוע במים.
- להבחין בשינוי הצבע של הכבד כפי שזה התרוקן עם PBS. לשנות את הצנרור יצוא מן הבקבוק 1 ליטר הבקבוקון 125 מ. אל תאפשר בועות אוויר לזרום לתוך הכבד.
- ברגע המאגר זלוף מגיע הכבד, בקצרה מחצי חזק את כלי הדם קולחים לבנות קצת בלחץ בתוך הכלי ולאפשר הנוזל למלא כל אונות הכבד. הקפד לא לחתוך את ניקוז ארוך מדי, כמו זה ייתכן פרץ רקמת חיבור דק סביב הכבד (הקפסולה של גליסון) ולהשמיד את זלוף או זרימה של נוזל בתוך המיטה נים של הכבד.
- לאפשר מאגר 2 עם collagenase כדי perfuse דרך הכבד עד 45 מ ל כל זרמו דרך הרקמות.
הערה: אם מצליחים, הכמוסה של גליסון להפרידם parenchyma או רקמת הכבד, הכבד עצמו אמור להופיע אמורפי. - להוסיף כ- 10 מ"ל של מאגר 1 למנה crystallizing אחרים והצב אותה ליד העכבר.
- להסיר את הצנתר ולכבות את המשאבה.
- עם מלקחיים ישר, מספריים, חותכים את הכבד מן העכבר. אם העיכול collagenase היה מאוד יעיל, ייתכן צורך את הכף נקי, סטרילי על היד כדי להיפטר הכבד מן העכבר ולמקם אותו מאגר 1.
4. hepatocyte טיהור
הערה: מניפולציה של התאים מבוצעות בשכונה תרביות רקמה סטרילי כדי להגביל זיהום אם התאים להיות בתרבית בצעדים העוקבים כל.
- שימוש סטרילי טכניקה, לתפוס את הכבד עם מלקחיים ומנערים בעדינות תאים מן הכבד. להפריד או התרחק הכמוסה של גליסון: המאגר יהפוך אטום כמו תאים הם מזועזע מן הכבד.
- שופכים את הפתרון תא לתוך חרוט 50 מ עם מסנן 100 מיקרומטר, מניחים מעל.
- להוסיף עוד 1 מאגר שרידי כבד ולהמשיך תיכנסנה תאים. המשך עד הכבד מופיע ללא תאים או כאשר החלקים מעוכל הכבד לא תשואה יותר תאים.
- שופכים את הנוזל הסלולר לתוך עוד 50 מל חרוט המכיל מסנן מיקרומטר 40.
- Centrifuge חרוט בתוך הרוטור דלי מתנדנדים ב 100 x g למשך 3 דקות.
הערה: אין להשתמש בבלמים המרבי כמו זה עשוי לסלק בגדר תא. להשתמש את הבלם ב 80% וזה מספיק עבור כל השלבים הנותרים צנטריפוגה ב 4 ° C - יוצקים את תגובת שיקוע (אשר מכיל NPCs, מת hepatocytes) לתוך חרוט נקייה ומניחים אותו על קרח. ודא שזאת בתנועה אחת להתבונן צניפה הדבקות.
- Resuspend בגדר ב- 40 מ"ל של מאגר 1. חזור על שלבים 4.5 ו- 4.6. Resuspend בגדר ב- 40 מ"ל של מאגר 3. חזור על שלבים 4.5 ו- 4.6 פעמיים.
- Resuspend את hepatocytes מטוהרים חמים DMEM + 10% FBS + 2 x פניצילין-סטרפטומיצין (עט/דלקת).
- אם התאים מתורבתים על קולגן מצופה לוחות, לאפשר להם לפעול ולהתבטא עבור 1 h, החלף המדיה לפחות פעם אחת כמו זה ימנע כל המתהווה חיידקים מזהמים.
- להפוך את הצלחות קולגן מצופה על-ידי המקננת בהם עם 0.05% קולגן ב- 0.001% חומצה אצטית במשך לפחות שעה ב 37 ° C ולאחר מכן כביסה עם 1 x PBS.
- אם הכדאיות hepatocyte הוא נמוך, ויש רצון להשיג hepatocytes גבוהה-קיימא מטוהרים ואז להשתמש בפרוטוקול הבא הותאם ואחKreamer10.
- מיקס 9 כרכים של פתרון של PVP (Percoll, פתרון w/w 23% מים ו- 15-30 ננומטר סיליקה colloidal חלקיקי מצופה פוליוינילפירולידון עבור צפיפות צנטריפוגה) ונפח 1 של x HBSS 10 כדי להפוך פתרון PVP iso-osmotic (SIP).
- להוסיף מ 24 ל- SIP סטרילי 50 מ ל חרוט עשוי להיות מאוחסן בתנאים אלו עד 2 חודשים-4 מעלות צלזיוס.
- התאם את הריכוז hepatocyte ל 5-10 × 106 תאים למ"ל תרבות בינונית כמו שרשמת בשלב 4.8.
- להוסיף 25 מ של השעיה תא כל מ ל 24 SIP המכיל חרוט ומערבבים על ידי היפוך עדין. הצפיפות של פתרון זה הוא 1.06 g/mL.
- Centrifuge חרוט ב g x 50 דקות 10-4 מעלות צלזיוס.
- האחות SIP ו גדול, resuspend תאי HBSS.
- לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה-50 גרם x 10 דקות ב 4 º C.
- חזור על שלב 4.10.6 עוד פעם אחת, ואז resuspend בתאים מדיום הגידול.
5. טיהור סק
- גלולה התאים supernatants מהשלב 4.6 על ידי סחרור הצינורות ב 163 x g עבור 10 דקות להשליך את supernatants מן הצינורות resuspend כל תא כדורי ב 5 מ של RPMI ללא סרום, בריכה אותם יחד בצינור אחד.
- ברגע שיש כבר איחדו את כל החבילות, להוסיף RPMI לנפח סופי של 35 מ.
- Centrifuge את במאגר חרוט ב 25 x g עבור מינימלית 3 בקפידה תשאף mL 25 העליון של RPMI עם 25 מ ל פיפטה, המקום הזה המדיה המכילה NPCs ב נקי 50 מ ל חרוט על קרח.
- להוסיף 25 מ של טרי RPMI בחזרה הצינור, resuspend בגדר.
- חזור על צעד 5.3 חדר שטיפת השני ובריכת תגובת שיקוע. למחוק את 10 מ"ל הנותרים של מדיה גלולה (בגדר מורכב בעיקר מת hepatocytes). Centrifuge את תגובת שיקוע במאגר-163 g x 10 דקות.
- במהלך צנטריפוגה, להכין את מעברי צבע פתרון PVP ב חרוט 50 מ.
- להוסיף 15 מ"ל של 50% פתרון PVP 50 מ ל חרוט ואחריו 20 מ של 25% Percoll ועליהן pipettor להגדיר למהירות האיטית ביותר הפליטה. הקפד לצפות קו שבירה-סימון 15 מ"ל demarcates שתי שכבות, כמו זה שבו שניות של kcs ב לצבור לאחר צנטריפוגה.
- Resuspend התאים מגורען בעבר בשלב 5.5 ב 10 מ של RPMI קר, כיסוי אותם אל מעבר הצבע פתרון של PVP. הקפד לשמור על תיחום ברור בין שתי השכבות. Centrifuge מעבר הצבע ב 805 g x עבור 20 דקות עם בלם שוכן בגובה 50%.
- האחות מלמעלה למטה לכיוון לסימן 20 מ"ל ברכבת התחתית ולמחוק את החומר הזה. עם פיפטה העברה 5 מ"ל, לאסוף את שניות kcs ב הממוקמים במקום הממשק 25/50%. להתעלם כל גושים חומים של תאים כמו אלו hepatocytes מת.
- למקם את תאי חרוט 50 מ ל, להוסיף RPMI עד כדי לסמן 50 מ ל כדי לדלל את הפתרון PVP. צנטריפוגה-200 גרם x 10 דקות, עם 80% בלם.
- האחות למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בעת שטיפת את ספירלת חרוט ב 12 מ של RPMI חמים.
- להפריד את שניות kcs על-ידי הצבת את תגובת שיקוע פוליסטירן פטרי, דגירה ב חממה תרביות רקמה humidified במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר.
- האחות התקשורת עם פיפטה 25 מ ל, יש לשטוף הצלחת עם המדיה, עם pipettor הגדר במהירות הנמוכה ביותר כדי לאסוף את שניות שנותרו בזמן kcs ב לדבוק הצלחת.
- Centrifuge את שניות ב 200 x g למשך 10 דקות, resuspend RPMI + 5% FBS + עט/סטרפ. ואז כייל התאים, והמקום במנות תרבות מצופים קולגן.
Representative Results
שיטה demonstrational, מעודן זלוף הכבד והעשרה טיהור/hepatocytes ואת שניות מוצג כאן המספקת עצות מפורטות אופטימלית תא טיהור/העשרה בדומה לדוחות אחרים המודפס הידור זה הפניה סקירת 5. השלבים הקריטיים הקובעים הצלחה לטיהור הסלולר להתרחש ב המסלול ואת הפרטים הטכניים של ההליך זלוף collagenase, יוקפו בקו פרוטוקול זה. מה השטויות המנגנון הוא העלות האפקטיבית עם ציוד סטנדרטי, בניגוד למערכות אחרות, כי כבר פורסם11 (איור 1) ופשוט למדי. ב הגדרת הזה, המגש מחזיקים את העכבר יושב על המים הרותחים עם חלק הצנרת עודף באמבט מים כדי לשמור על הטמפרטורה של נוזלים פרפוזיה בתוך הכבד. המנגנון כמוצג כאן עשוי לשמש עבור עכברים, כמו גם חולדות, עם גיאומטריה שונה במקצת עכברוש זלוף הכבד12 (איור 2).
בהליך זה, הכבד perfused דרך וריד שער הכבד במקום הווריד הנבוב (וזה מסלול זלוף פופולרי נוסף) בשל קלות גישה בתוך הבטן, שמאכילה הווריד ישירות לתוך הכבד. הצופה צריך להיות מודע כי וריד שער הכבד יש מספר סניפים קטנים אשר עלול לגרום לקצר את perfusate, הצנתר להניחה בעבר ענפים אלה עבור הצלחה אופטימלית13 (איור 3). ברגע וריד שער הכבד מזוהה, מלקחיים מעוקל משמשים כדי לצייר תפירה או חוט פוליאסטר מתחת וריד שער הכבד בין הכבד את הווריד הלבלב-תריסריון מעולה. המלקחיים משמשים גם לסדר את וריד שער הכבד אשר נמצאת תחת לחץ דם חיובית (איור 4א). המחט בתוך הקטטר יוצבו במקביל, בסמוך את הווריד (איור 4B), השיקוע שיש להוסיף בעדינות לתוך לומן של הווריד (איור 4C). השמה נכונה תסומן באמצעות דם המופיע לאורך הצנתר. ברגע שהמחט "ניתק" הצנתר צריך להיות התייצב עם חוט כבול עליו, לחץ הדם יהיה כוח דם למעלה דרך הקטטר. מומלץ כי הצנתר יהיה מחובר לאורך צינור משאבת לפני דם נשפך החוצה (איור 4D). ברגע לאורך צינור המשאבה מחוברת, לחתוך מיד לכלי דם גדולים כגון הנבוב או העורקים abdominalis ניקוז דם/נוזל (איור 5א). . זה בדרך כלל אין צורך לחתוך את הצד של קיר הבטן של העכבר ניקוז מספיק, כמו הצטברות של דם בבטן מקשה להמחיש את התהליך זלוף, דם עשוי יועברו לתוך הטיהור תא (איור 5 B)-ברגע PBS מתחיל perfuse הכבד, הכבד בלנש עם חסרונו של הדם (איור 5C). אם רק כמה מן האונות בלנש, אז הסיבה הסבירה היא כי הצנתר הוצב רחוק מדי בתוך הכבד, יהיה עליך להיות מגובה לאט. לאחר השמה של הקטטר הוא אישר, להשתמש עמיד במים המסיכה קלטת כדי לאבטח את הצנרור במקום. מעבדה כללי קלטת מספיקה בדרך כלל לא. כדי לאשר השמה נכונה של הקטטר, לסחוט את כלי הדם לחתוך חדל ניקוז ולבחון את ולהגביר את הלחץ בתוך הכבד. עושה את זה יסייע שטיפה הדם בכבד (איור 5D). זה צריך להיעשות גם כאשר הפתרון collagenase נכנס בתחילה הכבד על מנת להבטיח כי כל האונות נחשפים collagenase. לאחר collagenase פתרון שנגמר, עיכול collagenase טוב זה מעיד על-ידי ניתוקו של הקפסולה של גליסון parenchyma.
כללי נוהל טיהור הסלולר שמתואר באיור 6 , איור 7 שבו hepatocytes נקצרים מוקדם במסגרת ההליך במהלך מהירות נמוכה ספינים טהורות מאוד, לאחר 4 שוטף במאגרי המכילות BSA (איור 8 ). שניות מטוהרים במשותף עם kcs על מעבר הדרגתי PVP (איור 9א), ואז המופרדות על-ידי הדבקה סלקטיבית על פוליסטירן מצופים קולגן פטרי. טוהר שניות בשיטה זו 83-90% טהור, תלויה, במידה רבה היעילות הכוללת של עיכול collagenase (איור 9ב'). מדידות כמותיים באמצעות אור מיקרוסקופ (כפי hepatocytes והן שניות יש תכונות מזהות של תאים אחרים) מראים בהכנה נציג, hepatocytes נמצאים כמעט 100% טהור, שניות רק מעל 89% טהור (טבלה 1). לחלופין, ניתן לקבל העשרת גבוה יותר של שניות על ידי הפרדה מגנטית עמודה לאחר מעבר הצבע PVP, למרות שזה מעבר להיקף של פרוטוקול זה. ניתן למצוא פרטים נוספים על הפרדה מגנטית של שניות kcs ב. מאייר et al. 9 וליו. et al. 14 יש לזכור כי הכדאיות של hepatocytes פוחת במהירות בכבד מעוכל מספיק, אבל זה לא הכרחי נכון NPCs. כבדי מתעכל דיו גם לייצר פסולת התאים, אשר אינה לגמרי חיסלה בשלבים צנטריפוגה.
איור 1 : ייצוג סכמטי של הסוויטה זלוף. המבחנות מתקיימים במקום על ידי מהדק (לא מוצג); הצנרת נוזל המכיל הוא החליפו מן הבקבוק 1 ליטר ל הבקבוקון 125 מ ל במהלך ההליך מיוצג באמצעות קו מקווקו אדום. שימו לב, להאכיל החמצן לא בועה ישירות לתוך הפתרונות ב המבחנות. גם צריך להיות מחורצים פקקים כדי לאפשר זרימה נוזלים במעגל סגור עם הצנרת מוכנס בתוך החריץ. זה קריטי במהלך החימום של הצנרת ועל הוצאה של כל האוויר בתוך הצנרת. הגלישה אוויר מורכב של T-המחבר אשר מחובר לצנרת Tygon, קמצוץ אבזמי-פתיחה מהירה, סגירת המערכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הסוויטה זלוף במהלך העכבר הכבד זלוף. המגש עם העכבר ממוקם בפינת הרחובות לאמבט המים. החמצן הוא מתנתק הפתרון collagenase כמו זה כבר היה חמצן במהלך החימום. מיקומם של פריטי התיקייה הם א) חמצן קווים, flask ב) 1 ליטר המכיל PBS, ג) 125 מ ל בקבוק המכיל מאגר 2 עם collagenase, ד) משאבת, משאבת ה) פקדים, מלכודת F) בועה, קו ז) נוזל בורח. הבקבוק, דרך המשאבה, העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : דימוי להערכת של הבטן העכבר. החדרת הקטטר צריך להיות מתחת צמתי וריד הקיבה, הלבלב יורד וריד שער הכבד (נקודה ירוקה), הטיפ צריך להיות ממוקם ליד הכבד הימני ושמאלה פורטל הורידים (נקודה צהובה) המהווה מזלג אל האונות הראשי של הכבד. לאחר השמה הנכונה מושגת, הקטטר צריך להיות התייצב עם חוט באמצעות קשר בוהן פשוט. K = כליות, L = הכבד, SI = המעי הדק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : השמה צנתר וריד שער הכבד. (א) המלקחיים משמשים כדי להבטיח דם engorgement של וריד שער הכבד וכדי לסדר את הווריד עבור מיקום הצנתר. (B) הצנתר הוא בשורה במקביל וריד שער הכבד עם שפוע. (ג) השיקוע של המחט בתוך הקטטר מוכנס לתוך הווריד של, ולא דרך הווריד. "ניתק" (D) המחט של הקטטר, דם יהיה זרם אחורי דרך הקטטר כמצוין על-ידי הקצה של המלקחיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : זלוף הכבד תקין. (א) אחרי קטטר השמה, הסוף סכינים סטריליים הנשי של הקטטר מתחבר לסוף זכר סכינים סטריליים (לחתוך מ מזרק 1 מ"ל) לאורך צינור המשאבה. (B) לאחר חיתוך אחד גדול יורד כלי דם, דם, PBS. מנוקזות מהבטן על ידי חיתוך בצד של העכבר עם מספריים. (ג) הכבד צריך בלנש ואילו הדם התרוקן (D) יתנפח תחת לחץ על ידי סגור לוחצת כלי הדם לחתוך עם מלקחיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : חלוקה סכמטית של טיהור hepatocyte ובידוד NPC. רוב הצעדים צנטריפוגה במטרה להסיר תאים שאינם parenchymal hepatocytes בשידור חי ומת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : חלוקה סכמטית של טיהור וניקוי שניה העשרה. NPCs מופרדים על-ידי מעבר הצבע PVP ואחריו שניה ההפרדה על ידי הדבקה קצר על צלחת פוליסטירן סטנדרטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8 : טיהור hepatocytes. Hepatocytes מצופה על צלחות תרבות רקמת קולגן מצופה DMEM + 8% FBS + עט/סטרפ, מודגרות במשך 6 שעות ולאחריה אוסף תמונה על ידי מיקרוסקופ 400 X. בר שווה 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9 : טיהור שניה. (א) שניות, kcs ב היו שנאספו מממשק PVP 25/50% (חיצים צהובים) ושטף בינונית ללא סרום. שניות (B) היו מופרדים מן kcs ב אדהזיה סלקטיבית על בצלחות פטרי סטנדרטי, שטף, מצופה על מנות מצופים קולגן תרביות רקמה RPMI + 5% FBS. התמונות צולמו על ידי מיקרוסקופ EVOS הפוכה 400 X. בר שווה 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 10 : סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים של העכבר הכבד האנטומיה. כבד עכבר היה perfused עם PBS ואחריו מקבע (cacodylate נתרן 100 מ מ, גלוטראלדהיד 25% 12 mL, 15.6 mL 16% paraformaldehyde, 2.65 מ"מ סידן כלורי, סוכרוז 180.2 מ מ, מעורב 100 מ ל תמיסת) בקצב של 1 מ"ל לדקה עבור 4 דק נחתכו רקמות ו מוכן עבור סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים. תמונות נאספו ב- SEM שדה פליטה 10, 000 X. חיצים צהובים מציינים את microvilli בין hepatocytes. בר שווה 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 11 : ויזואליזציה של המלח לעומת hepatocytes בשידור חי- לאחר 2 שוטפים עם מאגר 1, hepatocytes מגורען עשויים להידרש, עבור יחס חי/מת לפי העין. גלולה בהיר (משמאל) מציינת כי לפחות חצי hepatocytes המת. בגדר כהה יותר בצד הימין הוא מגורען איתנה יותר לתחתית הצינור, היא גרה למעלה מ-90%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| טבלה 1: תא טיהור | ||
| סוג התא | התאים היעד % | % תאים אחרים |
| Hepatocytes | 99 | 1 |
| תאי אנדותל Sinsusoidal | המהווה 89.1 | 10.9 |
טבלה 1: הערכה של התא טוהר על ידי מיקרוסקופ אור.
Discussion
פרוטוקול זה מדגיש את הכלים הזמינים ואת זה להרשות למשתמש שיעור גבוה של הצלחה בהליך זה. זלוף מוצלח הוא היסוד עבור כל יישום במורד הזרם בעת עבודה עם ראשי תאים.
ישנם כמה צעדים קריטיים של הנוהל הקובעות את ההצלחה. ראשית, השמה של קצה הצנתר בתוך וריד שער הכבד חייבים להיות נכונים. אם מניחים רחוק מדי בתוך הכבד, רק האונות משניות perfused. הטיפ צריך להיות מתחת הענפים מימין ומשמאל של וריד שער הכבד. היתרון של שימוש צנתר מרוכבים פולימריים על מחט הוא בארב של המחט סביר יותר להרוס את הווריד במהלך זלוף מאשר צנתר. שנית, collagenase האיכות והכמות לקבוע את יעילות עיכול של הכבד. בהליך זה, שימש collagenase שאושרו מראש סוג 4, זה הוא resuspended-0.5 מ"ג/מ"ל מאגר 2 אם הפעילות collagenase כדי להיות לבדיקה גדול מ 900 IU.
בסוף זלוף collagenase, הכבד צריך לשמור על שיזוף כהה במקצת לצבע חום. אם זה גוון צהבהב בהיר, ואז רוב hepatocytes הם מתים. הכבד צריך להיות מתפרק כשהוא נחתך מן העכבר. בתנאים הטובים ביותר, הכבד עשוי להיות צירפו מתוך חלל הגוף של העכבר עם כפית קטנה. כבדי במצב זה תמיד נותן הכדאיות תא גבוהה מאוד. אם זה לוקח הרבה מאמץ כדי לנער את התאים בנפרד, אם הכבד נמצא המשרד עדיין במהלך החילוץ, או אם יש הרבה כוח נדרש להעביר את hepatocytes באמצעות המסננים, ואז יהיה hepatocytes של הכדאיות נמוכה יותר. Hepatocytes מכוסים microvilli, מה שמאפשר להם בעלי פני שטח גבוהה מאוד (איור 10). עיכול לא שלם שומרת על צמתי תא-תא בין hepatocytes, חיתוך מכני תקרע קרום פלזמה לגזרים. זלוף בחיי עיר עם collagenase היא השיטה הטובה ביותר להפריד את התאים ולשמור על הכדאיות גבוהה. איור 11, הושוו שני hepatocyte ההכנות מתבצעים ב אשר התא. גללים לאחר כמה שוטף מאגר 1. בגדר בצד השמאל בהיר יותר ומכיל את הכדאיות תא של-50%. בגדר מימין הוא כהה יותר ובעל על הכדאיות של 92%. באופן דומה, כאשר הנוזל הוא שפך של 50 mL חרוט, בגדר כהה הוא נייח בתוך הצינור, בניגוד בגדר בהיר יותר, אשר יהיה להחליק בצינור כמו הנוזל נמזג. הכדאיות התא התחתון או perfusions לא יעיל עלולה להתרחש כאשר הכבד יש רמות גבוהות של טרשת נפוצה.
מאז hepatocytes בשידור חי יש צפיפות גבוהה יותר מאשר hepatocytes מת, ההליכים צנטריפוגה תגרום הכנה זה מאוד טהור hepatocytes קיימא15. אם יש כמות משמעותית של hepatocytes מת (אשר מתרחש לעיתים קרובות כאשר התנאים שיוצרת), בשידור חי התאים עשויים להיות עוד יותר מועשר, הופרדו תאים מתים באמצעות מעברי צבע PVP. בנוסף, מאז hepatocytes בשידור חי הצניפה מהר יותר hepatocytes מת, השאיפה של 3 העליוןרואד של בגדר יהיה גם להגדיל את היחס של חיה על תאים מתים בגדר. הליכים אלה הם מהירים, שיטות קל להפריד בשידור חי מת hepatocytes תא פסולת בעת הצורך10,16. פעולה זו שימושית במיוחד אם המדגם הוא יקר, ורק כמה תאים מיליון נדרשים עבור הניסוי.
לסיכום, זוהי שיטה נוחה ויעילה עבור קציר hepatocytes שניות מן הכבד. במחירים הנוכחיים, העלות של ביצוע הליך זה כולל סרולוגיה וכל חד פעמי היא מתחת לגיל 75 USD הכנה. אם מספר עכברים הם הרצויה, מומלץ להמשיך בטהרה hepatocyte ולשמור את השבר NPC על הקרח עד שיסתיים העיבוד של כל העכברים. NPCs יציבים בדרך כלל על קרח במשך לפחות 5 שעות, אבל יותר פעמים שלא נבדקו במעבדה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המימון מסופק בחלקו על ידי NIH של גרנט R01HL130864.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
| T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
| Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
| Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
| Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
| Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
| glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
| curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
| sterlized spoon | Home supply store | ||
| Cotton ball(s) | Home supply store | ||
| Polyester sewing thread | Home supply store | ||
| Masking tape | Home supply store | ||
| thumb tacks | Home supply store | ||
| styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
| cookie/baking sheet | Home supply store | ||
| Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
| 19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
| BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
| Crystallizing dishes 100x50 | VWR | 89000-290 | |
| Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
| graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
| EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
| EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
| Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
| Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
| Reagents | |||
| Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
| Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
| KCl | 0.5 | 6.7 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
| KCl | 0.5 | 6.71 | |
| CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
| HEPES | 24 | 100 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
| Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.35 | 4.7 | |
| MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
| CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.2 | 2.7 | |
| Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
| KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
| Other reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | Gibco | 11965118 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | |||
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
| LSEC medium | |||
| RPMI | Gibco | 11875119 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
- Edstrom, S., Ekman, L., Ternell, M., Lundholm, K. Isolation of mouse liver cells: perfusion technique and metabolic evaluation. Eur Surg Res. 15 (2), 97-102 (1983).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Buhler, L. Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Sies, H. The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems. Methods Enzymol. 52, 48-59 (1978).
- Smedsrod, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. Munin open research archive. , University of Tromsø. 1-10 (2012).
- Smedsrod, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstrom, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell Tissue Res. 241 (3), 639-649 (1985).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Exp Cell Res. 349 (2), 291-301 (2016).
- Kreamer, B. L., et al. Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (4), 201-211 (1986).
- Meijer, D. K., Keulemans, K., Mulder, G. J. Isolated perfused rat liver technique. Methods Enzymol. 77, 81-94 (1981).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. J Vis Exp. (57), e3138 (2011).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. 2008 edn (1965).
- Liu, J., et al. Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells. Methods Mol Biol. 1540, 249-258 (2017).
- Knobeloch, D. E., Ehnert, S., Schyschka, L., Buchler, P., Schoenberg, M., Kleeff, J., Thasler, W. E., Nussler, N. C., Godoy, P., Hengstler, J., Nussler, A. K. Human Hepatocytes: Isolation, Culture, and Quality Procedures. Methods in Molecular Biology. 806, 99-120 (2012).
- Clarke, B. L., Weigel, P. H. Recycling of the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. ATP depletion blocks receptor recycling but not a single round of endocytosis. J Biol Chem. 260 (1), 128-133 (1985).
