Summary
Målet med denne protokollen er å oppnå høy levedyktighet og høy avkastning av hepatocytter og sinusformet endotelceller fra leveren. Dette oppnås ved perfusing leveren med en type IV collagenase løsning via portalen blodåre, etterfulgt av differensial sentrifugering hepatocytter og sinusformet endotelceller.
Abstract
Denne protokollen viser en metode for høy avkastning og levedyktigheten for musen hepatocytter og sinusformet endotelceller (sek) egnet for dyrking eller skaffe celle lysates. I denne protokollen brukes portalen blodåre som stedet for catheterization, snarere enn vena cava, som dette begrenser forurensning av andre mulige celletyper i leveren servering. Det kreves ingen spesiell instrumentering i hele denne prosedyren. Et vannbad brukes som en kilde til varme til å opprettholde temperaturen i alle buffere og løsninger. En standard peristaltiske pumpe brukes til å kjøre væske, og en nedkjølt bord sentrifuge kreves for sentrifugering prosedyrene. Den eneste begrensningen for denne teknikken er plasseringen av kateter i portalen blodåre, som er utfordrende på noen av musene i 18-25 g størrelse rekkevidde. En fordel med denne teknikken er at bare en åre benyttes for perfusjonen og tilgang til venen er raskt, som minimerer iskemi og reperfusion av leveren som reduserer hepatic celle levedyktighet. En annen fordel med denne protokollen er at det er enkelt å skille live fra døde hepatocytter av syn på grunn av forskjellen i mobilnettet tetthet under sentrifugering trinnene. Celler fra denne protokollen kan være brukt i cellekultur for nedstrøms programmer som behandlet for noen biokjemiske vurdering.
Introduction
Collagenase perfusjon av leveren for å få hepatocytter er utført siden tidlig på 1950-tallet og har blitt stadig forbedres1,2,3,4. En veldig fin gjennomgang av mange av de metoder, teknikker og reagenser i liver celle rensing er utarbeidet i Meyer et al5. Få en tilfredsstillende avkastning av svært levedyktig hepatocytter og sek er teknisk utfordrende. De mekaniske kreftene som skiller cellene inkludert kvaliteten på collagenase er noen av variablene som er vanskelig å kontrollere. På grunn av hepatocyte følsomhet for mekaniske krefter reduseres deres levedyktighet markert i sub-optimale forhold, spørre behovet for en protokoll som beskriver optimale forhold for isolasjon. Sekunder synes ikke å være så følsomme for mekanisk klipping. In situ perfusjon collagenase fordøyelsen er langt den beste metoden å forstyrre celle-celle veikryss for å få enkeltcelle preparater fra lever og andre organer som tarm og milt6. Denne protokollen demonstrerer en enkel metode for å innføre perfusjon buffer i portalen blodåre ved hjelp av en uttrekkbar plast kateter i stedet for et snitt som kan forårsake portalen blodåre å kollapse, som beskrevet i Smedsrød et al7.
Målet med dette manuskriptet er å vise de viktigste trinnene som kreves for suksess i leveren overflod prosedyren. Disse trinnene omfatter kateter plassering, flyt av perfusjon væsker og håndtering av vev etter fordøyelsen. Strømningshastigheten er justert utover den naturlige blodstrøm, men lav nok til å holde den Glisson kapsel intakt. Når leveren er riktig fordøyd og cellene blir separert i løsningen, er celle rensing relativt enkel om det utføres av differensial sentrifugering, plate heft eller magnetiske perle rensing. Live hepatocytter har en høyere tetthet og er lett renset fra nonparenchymal stamceller (NPC) og døde hepatocytter med lav hastighet sentrifugering. De fleste programmer plate vedheft til å skille Kupffer celler (KCs) og sekunder er en felles metode8, men det finnes rapporter om at det ikke produserer beste renheten av sek9. Markedsledende har en tendens til å følge solide stive flater raskt og Petri retter (standard polystyren) er den mest brukte materialet for denne prosedyren. SEC eller KC rensing med bruk av antistoff-konjugerte magnetiske perler er utvilsomt den beste metoden for betydelig rensing av disse cellene, men fremgangsmåten legger en annen 3-4 h på denne protokollen og totale avkastningen er redusert9. Denne rapporten viser i detalj prosessen for en optimal leveren perfusjon som vanligvis gir mange levedyktige cellers.
Protocol
Alle dyr prosedyrer skissert i denne protokollen er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) på universitetet av Lincoln - Nebraska under protokollen #1435.
1. forberedelse
- Utarbeidelse av løsninger og kultur medier
- Forberede alle kultur medier og buffer i henhold til Tabellen for materiale.
- Utarbeidelse av instrumenter
- Definere et vannbad (> 10 L) på 42 ° C, en peristaltiske pumpe med variabel hastighet og klemmer for å holde flasker. Forberede buet saks og tang (figur 1).
- På eller ved siden av vannbad, sette opp en bakervarer ark (ca 38 x 26 cm) med en Styrofoam pad (50 mL konisk rack), kledde med en absorberende underpad skjære i et 20 x 20 cm stykke (figur 1).
- Legg et stykke maskeringstape (5-8 cm) i nærheten. Plasser en 20 cm polyester sytråd i nærheten som er kuttet og klar til bruk. Få en plast kateter med en uttrekkbar nål (7 mm x 19 mm, figur 1).
- Utarbeidelse av glass
- Ved hjelp av klemmer, plasser og nakkens en 1 L kolbe i vannbad som inneholder 200 mL 1 x PBS med en propp som har to 1 mL Pipetter går inn i løsningen. Gummi kork er hakk slik at resirkulering av væske i en lukket krets.
- Med en annen bøyle, plasserer du en 125 mL kolbe som inneholder 45 mL Buffer 2 sammen med en propp som har to 1 mL Pipetter, hvorav ett er i væsken nær bunnen av flasken og den andre som holdes over væsken og blåser oksygen i flasken.
Merk: Hver Pipetter i stoppers må en rask koble adapteren til slutt for å enkelt bytte av slangen. Oksygen vil være forsiktig strømmer inn begge kolber via Pipetter i stopperen som ikke ligger i væsken. - Avsette to sterile størkner retter.
2. dyr prosedyre
- Varme opp PBS og Buffer 2 løsninger til 42 ° C i vannbad og sirkulere PBS for minst 20 mL/min slangen i en lukket krets å holde flytende linjene varme. Legg noen overflødig rør i vannbad forbli så nært som mulig til 42 ° C. Renne den mannlige enden av slangen i 1 L kolbe med PBS.
- Plasser en bomullsdott på den absorberende underpad og legge til ca 2 mL av 30% isoflurane (består i polyetylenglykol 200 som reduserer fordamping frekvensen av isoflurane) på bomullsdott bruker en overføring pipette.
- Plukke opp musen ved halen, plasserer den i en av størkner retter og deretter raskt omgjøre parabolen på bomull ballen slik at musen har en liten plass til å puste inn av bedøvelsen. Observere pustefrekvens museklikk og sikrer musa er effektivt under narkose.
Merk: Pustefrekvens bør være tregere og dypere, halen flaccid og paws selv knipe test under anesthesia; se IACUC retningslinjer for ytterligere informasjon. - Mens musa kommer under narkose (dette tar 1-2 min), forberede fat av en 10 mL sprøyte ved å dra ut stempelet og sette en liten bomullsdott. Legge til 1-2 mL 30% isoflurane med en overføring pipette bomullsdott inni fat og plassere fat åpne slutten ned på et bord mens du venter musen å bli bevisstløs.
- Raskt ta av størkner parabolen, Vend musen på ryggen og plasser sprøytesylinderen over nesen sin. Dobbeltsjekke pustefrekvens, tå knipe og flaccid halen. Alle svar til tå knipe og flaccid hale angir at musen ikke er fullstendig under narkose. Hold sprøytesylinderen over snuten å opprettholde bevisstløshet.
- Sted tommelen stifter gjennom paws museklikk, med lemmer utstrakte i supine posisjon. Våt magen og rib bur med 70% isopropanol eller etanol.
- Med rett tang i den ene hånden, løft huden nær bunnen av magen. Med saks i den andre hånden, kuttet telt huden og peritoneum. Snittet skal være vannrett eller vannrett grunnlaget av telt huden. Husk å skjære gjennom alle lag av huden og peritoneum for å få tilgang til tarmen. Kutte lateralt rundt magen til ribbe buret på begge sider uten skår noen av organene.
- Avskåret klaffen på huden ved å kutte over lavere ribbe buret. Flytte tarmen til høyre med baksiden av tang å avsløre portalen blodåre.
Merk: Blødning fra dyr bør være minimal. dyr burde fremdeles være åndedrag og under dyp anestesi. - Plass lukket buet tang under portalen blodåre mellom leveren og overlegen pancreaticoduodenal vene (Figur 3 pil).
- Åpne tang mens under portalen blodåre. Forstå tråden og trekk den forsiktig slik at den midtstilles under portalen blodåre. Knytte et halvstikk knuten rundt portalen blodåre uten cinching det ned.
- Plasser buet tang under portalen blodåre, og trekk den mot halen av musen til å rette ut venen (Figur 4A).
- Med kateter i den andre hånden, plassere skråkant nålen opp og parallelt med den nedre delen av portalen blodåre nær tang (Figur 4B).
- Forsiktig punktering venen med nålen (Figur 4C). Sikre skråkant nålen i lumen i venen. Trekke fjærbelastet nålen og fortsetter å presse polymer kateter gjennom åre til skråkant er nær venøs forgrenet. Dette er i leveren. Hvis kateter plasseres riktig, vises en tilbake-flyten av blod. (Figur 4D).
- Snurp halvstikk knuten, og dra det ned kateter å stabilisere det. Umiddelbart slår ned pumpe hastigheten fra 20 mL/min til 4 mL/min og kuttet en annen stor blodåre for drenering. Kuttet aorta abdominalis for optimale resultater.
- Plass den mannlige enden av slangen til kvinnelige slutten av kateter (figur 5et). Kontroller at det er ingen luftbobler i linjen. Vær forsiktig at kateter ikke er enten presset til leveren eller fra venen. Plassering av tråden er ikke viktig, men det hindrer tilbake flyten av venen og holder kateter i riktig posisjon (figur 5B, C).
- Bruk maskeringstape for å nakkens slangen på underpad. Bruke rett tang for å presse avløpsvann blodkaret å blåse leveren noen ganger å sikre alle blod har drenert ut (figur 5D).
Merk: Standard laboratorium tape kan ikke fungere; men vil maskeringstape forbli fast til underpad, selv under våte forhold.
3. lever perfusjon
- Mens leveren lampene med PBS, måle ut ca 24 mg av Collagenase Type IV og plasser den i flasken inneholder 45 mL Buffer 2 i vannbad. Husk å virvle væsken i flasken slik at collagenase er fullstendig oppløst og plassere kolbe tilbake i klemmen slik at den flytende inneholdende delen av kolbe er helt nedsenket i vannet.
- Observere endring i fargen på leveren som det er spylt med PBS. Endre ut slangen fra 1 L kolbe til 125 mL kolbe. Tillat ikke luftbobler å strømme inn i leveren.
- Når perfusjon bufferen når leveren, kort Klem fast avløpsvann blodkaret å bygge opp noen trykket i fartøyet og tillate denne væsken å fylle alle lobes av leveren. Pass på at du ikke kuttet drenering lenge, som som kan sprekke i tynne bindevev omgir leveren (glissons kapsler) og ødelegge perfusjon eller flyten av væske i kapillær sengen i leveren.
- Lar Buffer 2 med collagenase til perfuse gjennom leveren til alle 45 mL ha strømmet gjennom vev.
Merk: Hvis den Glisson capsule skal skilles fra parenchyma eller leveren vev og leveren vises selv amorfe. - Legge til ca 10 mL av Buffer 1 andre størkner fatet og plassere den ved siden av musen.
- Fjerne kateter og slå av pumpen.
- Rett tang og saks, kuttet leveren fra musen. Hvis collagenase fordøyelsen var svært effektive, kan det være nødvendig å ha en ren, sterile skje på side å øse leveren fra musen og plassere den i Buffer 1.
4. hepatocyte rensing
Merk: Manipulering av cellene er utført i sterilt vev kultur hette å begrense forurensning hvis cellene skal være dyrket i alle etterfølgende trinnene.
- Bruker steril teknikk, grip leveren med tang og forsiktig risting cellene fra leveren. Flerre eller trekke tilbake det Glisson capsule: bufferen blir ugjennomsiktig som cellene er rystet fra leveren.
- Hell av cellen løsningen i en 50 mL konisk med en 100 µm filter plassert over toppen.
- Legge til flere Buffer 1 leveren restene og fortsette å riste ut celler. Fortsett til leveren vises uten celler eller når de ufordøyd delene av leveren ikke gir lenger celler.
- Hell mobilnettet væsken i en annen 50 mL konisk inneholder filtere for 40 µm.
- Sentrifuge den konisk en svingende bøtte rotor 100 x g i 3 minutter.
Merk: Ikke bruk maksimal bremsen som dette kan dislodge celle pellets. Bruk bremsen på 80% som er tilstrekkelig for alle andre sentrifugering trinnene på 4 ° C - Hell av nedbryting (som inneholder NPCer og død hepatocytter) i en ren koniske og plasser den på is. Kontroller dette gjøres i én bevegelse å observere pellet etterlevelse.
- Resuspend pellet i 40 mL Buffer 1. Gjenta 4.5 og 4.6. Resuspend pellet i 40 mL av Buffer 3. Gjenta trinn 4.5 og 4.6 to ganger.
- Resuspend de renset hepatocytes som varm DMEM + 10% FBS + 2 x Penicillin-Streptomycin (penn/Strep).
- Hvis cellene er kultivert på kollagen belagt plater, tillate dem å følge 1t og ombytte media minst en gang da dette vil hindre alle begynnende bakteriell forurensning.
- Gjør kollagen belagt plater av rugende dem med 0,05% kollagen i 0,001% eddiksyre minst 1t på 37 ° C, og deretter vaske med 1 x PBS.
- Hvis det er et ønske om å få renset høy-levedyktige hepatocytter deretter bruke følgende protokollen tilpasset fra Kreamer et al10hepatocyte levedyktighet er lav.
- Mix 9 mengder PVP løsning (Percoll, en 23% w/w løsning av vann og 15-30 nm kolloidal silika partikler belagt i polyvinylpyrrolidone for tetthet sentrifugering) og 1 volumet av 10 x HBSS å lage en iso-osmotisk PVP løsning (SIP).
- Legge til 24 mL SIP i et sterilt 50 mL konisk som lagres i disse forholdene for opptil 2 måneder på 4 ° C.
- Justere hepatocyte konsentrasjonen til 5-10 × 106 celler/mL med kultur medium som du noterte i trinn 4.8.
- Legg 25 mL av cellen suspensjon til hver 24 mL SIP inneholder koniske og bland ved mild inversjon. Tettheten av denne løsningen er 1.06 g/mL.
- Sentrifuge den koniske 50 x g i 10 min på 4 ° C.
- Sug opp den SIP og flocculant, og resuspend cellene i HBSS.
- Vask cellene med sentrifugering 50 x g i 10 min på 4 ° C.
- Gjenta trinn 4.10.6 igjen og deretter resuspend celler i vekst medium.
5. sekund rensing
- Pellets cellene i supernatants fra trinn 4.6 ved å spinne rør 163 x g for 10 min. Forkast supernatants fra rørene og resuspend alle cellen pellets i 5 mL av RPMI uten serum og samle dem sammen i en tube.
- Når alle pellets har blitt samlet, kan du legge RPMI til siste bind i 35 mL.
- Sentrifuge den grupperte konisk 25 x g for 3 min. nøye Sug opp den topp 25 mL av RPMI med 25 mL pipette og sted dette mediet som inneholder NPCer i en ren 50 mL konisk på is.
- Legg til 25 mL av fersk RPMI tilbake til røret og resuspend pellet.
- Gjenta trinn 5.3 for en andre vask og basseng nedbryting. Kast de resterende 10 mL av media og pellets (pellet består hovedsakelig av død hepatocytter). Sentrifuge gruppert nedbryting 163 x g i 10 min.
- Under sentrifugering, forberede PVP løsning graderingene i en 50 mL konisk.
- Legge til 15 mL 50% PVP løsning av 50 mL konisk etterfulgt av 20 mL 25% Percoll kledde med en hindre satt til den laveste utstøting hastigheten. Sørg for å observere en brytning linje på 15 mL merket som demarcates de to lagene, dette er hvor den sekunder og KCs samle etter sentrifugering.
- Resuspend cellene tidligere pelleted i trinn 5.5 i 10 mL kaldt RPMI og klæ dem til PVP løsning graderingen. Husk å opprettholde en klare skillelinjer mellom de to lagene. Sentrifuge graderingen 805 x g for 20 min med en brems satt til 50%.
- Sug opp fra toppen ned til 20 mL merke på røret og kast dette materialet. Med en 5 mL overføring pipette, samle sekunder og KCs som ligger på 25/50% grensesnittet. Kast noen brun klumper av celler som disse er død hepatocytter.
- Plasserer cellene i et 50 mL koniske og legge RPMI opp til 50 mL merket å fortynne PVP løsningen. Sentrifuge 200 x g for 10 min, med 80% brems.
- Sug opp og kaste nedbryting og resuspend pellet mens vaske av membran av den koniske i 12 mL av varm RPMI.
- Skille i sekunder fra KCs ved å plassere nedbryting i en isopor Petriskål og ruge i en fuktet vev kultur inkubator i 8 min ved romtemperatur.
- Sug opp media med 25 mL pipette og skyll platen med samme media, med hindre satt på den laveste hastigheten å samle de gjenværende sekunder mens markedsledende overholder platen.
- Sentrifuge sek 200 x g i 10 min og resuspend i RPMI + 5% FBS + penn/Strep. Deretter titer cellene, og plass i kollagen-belagt kultur retter.
Representative Results
En demonstrasjons, raffinert metode for leveren perfusjon og rensing/anriking av hepatocytter og sek er presentert her som gir detaljerte tips for optimal celle rensing/berikelse ligner andre utskrevne rapporter samlet i dette refererer til gjennom 5. De avgjørende skritt som avgjør suksessen for mobilnettet rensing forekommer i ruten og tekniske detaljer av collagenase perfusjon prosedyren og er beskrevet i denne protokollen. Opplegget for apparatet er ganske enkel og kostnadseffektiv med standard laboratorieutstyr, i motsetning til andre systemer som har vært publisert11 (figur 1). I dette oppsettet sitter skuffen holder musen på vannbad med noen av overflødig slangen i vannbad å opprettholde temperaturen på væske perfusing i leveren. Apparatet som vist her kan brukes for mus og rotter, med en litt annen geometri for rotte leveren perfusjon12 (figur 2).
I denne fremgangsmåten er leveren perfused via portalen blodåre i stedet for vena cava (som er en annen populær perfusjon rute) på grunn av sin brukervennlighet i magen og som venen feeds direkte i leveren. Betrakteren bør være klar over at portalen blodåre har små avdelinger som kan kortslutte perfusate, og kateter plasseres forbi disse grenene for optimal suksess13 (Figur 3). Når portalen blodåre er identifisert, brukes buet tang til å trekke en kirurgisk Sutur eller polyester tråd under portalen blodåre mellom leveren og overlegen bukspyttkjertelen-duodenal venen. Tang brukes også til å rette ut portalen blodåre som er under positiv blodtrykk (Figur 4A). Nålen i kateter plasseres parallelt og i venen (Figur 4B) og skråkant bør være forsiktig inn lumen i venen (Figur 4C). Riktig plassering angis med blod vises langs kateter. Når nålen er trukket til kateter bør stabiliseres med en tråd knyttet på det og blodtrykket vil tvinge blod opp gjennom kateter. Det anbefales at kateter kobles til pumpen slangen før blod søl ut (Figur 4D). Når pumpen slangen er koblet, umiddelbart kutte en stor blodåre som vena cava eller aorta abdominalis for blod/væske drenering (figur 5et). Det er vanligvis nødvendig å kutte siden av bukveggen museklikk for tilstrekkelig drenering, som en oppbygging av blod i buken gjør det vanskelig å visualisere perfusjon prosessen, og blod kan bære over til celle rensing (figur 5 B). en gang PBS begynner å perfuse leveren, leveren vil blanch med fravær av blod (figur 5C). Hvis bare noen av lobes blanch, så er den sannsynlige årsaken at kateter er plassert langt i leveren og må sikkerhetskopieres ut sakte. Når plasseringen av kateter er bekreftet, bruk vannavstøtende maskeringstape for å sikre slangen på plass. De generelle laboratorium tape er vanligvis ikke tilstrekkelig. For å bekrefte riktig plassering av kateter, klem kuttet blodkaret skal opphøre drenering og observere øker trykket i leveren. Dette vil hjelpe i skylle blod av leveren (figur 5D). Dette bør også gjøres når collagenase løsningen først går i leveren til å sikre at alle fliker er utsatt for collagenase. Etter collagenase renner løsning ut, en god collagenase fordøyelsen er indikativ av separasjon av de Glisson kapsel fra parenchyma.
Den generelle fremgangsmåten for mobilnettet rensing er skissert i figur 6 og figur 7 hvor hepatocytter høstes tidlig i fremgangsmåten under det lav fart spinner og er meget ren etter 4 vasker i BSA inneholder buffere (Figur 8 ). Sek er co renset med markedsledende på PVP gradering (figur 9A) og deretter atskilt med selektiv vedheft på en kollagen-belagt polystyren Petriskål. Renheten av sekunder ved hjelp av denne metoden er 83-90% ren og i stor grad avhenger av effektiviteten på collagenase fordøyelsen (figur 9B). Kvantitative mål med lys mikroskopi (som både hepatocytter og sekunder har særtrekk fra andre celler) viser at i en representant forberedelse, hepatocytter er nesten 100% ren og sek er litt over 89% ren (tabell 1). Alternativt kan en høyere anriking av sekunder fås ved magnetiske kolonnen separasjon etter PVP gradient, selv om det er utenfor omfanget av denne protokollen. Du finner mer informasjon om magnetiske separasjon av sekunder og markedsledende i Meyer et al. 9 og Liu et al. 14 det bør huskes at levedyktighet av hepatocytter raskt synker i en utilstrekkelig fordøyd leveren, men dette er ikke nødvendig sann for tilstrekkelig fordøyd lever også produsere mer mobilnettet rusk, som ikke er helt NPCer. eliminert i sentrifugering trinnene.
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av perfusjon suiten. Flasker holdes på plass av klemmer (vises ikke); slangen som inneholder væske er byttet fra 1L kolbe til 125 mL kolbe under prosedyren er representert ved den røde prikkede linjen. Merk, at oksygen feed ikke boble direkte i løsningene i flasker. Korkene bør også være hakk for å tillate en lukket krets flytende strøm med slangen settes inn i hakket. Dette er kritisk under oppvarming av slangen og utstøting av alle luft i slangen. Bleed luften består av T-kontakten som er koblet til Tygon rør og knipe klemmer for rask åpning og lukking av systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Perfusjon suiten under musen leveren perfusjon. Skuffen med musen er plassert på hjørnet av vannbad. Oksygen er koblet fra collagenase løsningen som det var allerede oksygenert under oppvarmingen. Lokasjon er A) oksygen linjer, B) 1 L kolbe som inneholder PBS, C) 125 mL kolbe som inneholder buffer 2 med collagenase, D) pumpe, E) pumpe kontroller, F) boble felle, G) flytende linje som går fra flasken, gjennom pumpen og musen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Bilde av blodkar av musen magen. Innsetting av kateter bør være like nedenfor de mage og bukspyttkjertelen blodåre knutepunktene kommer av portalen blodåre (grønn prikk) og spissen plasseres nær venstre og høyre hepatic portal venene (den gule prikken) som danner en gaffel i de viktigste lobes av leveren. Når riktig plassering er oppnådd, bør kateter stabiliseres med tråden ved hjelp av en enkel halvstikk knot. K = nyre, L = leveren, SI = tynntarmen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Kateter plassering i portalen blodåre. (A) tang brukes å sikre blod overfylling av portalen blodåre og rette ut i venen for kateter plassering. (B) i kateter er stilt parallelt med portalen blodåre med skråkant opp. (C) skråkant nålen i kateter settes inn i venen, ikke gjennom åre. (D) nålen av kateter er trukket og blod vil tilbakestrømming gjennom kateter som indikert av spissen av tang. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Riktig leveren perfusjon. (A) etter kateter plassering, Luer hunnkoplingen på kateter kobler til den mannlige Luer enden (kuttet fra en 1 mL sprøyte) av pumpen slangen. (B) når kutte en av de store synkende blodkarene, blod og PBS er drenert fra magen skjære siden av musen med saks. (C) leveren bør blanch mens blodet tømmes og (D) vil hovne opp når presset av klemmer slår kuttet blodkaret med tang. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Skjematisk oversikt over hepatocyte rensing og NPC isolasjon. De fleste av punktene sentrifugering mål å fjerne levende og døde hepatocytter fra ikke-parenchymal celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Skjematisk oversikt over SEC berikelse og rensing. NPCer skilles med PVP graderingen etterfulgt av SEC separasjon av kort vedheft til en standard polystyren plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Renset hepatocytter. Hepatocytter var belagt på kollagen belagt vev kultur plater med DMEM + 8% FBS + penn/Strep og ruges i 6 h etterfulgt av bildesamlingen av mikroskop for 400 X. Bar tilsvarer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : SEC rensing. (A) sekunder og KCs ble samlet fra 25/50% PVP grensesnittet (gule piler) og vasket med serum-free medium. (B) The sekunder var atskilt fra markedsledende med selektiv vedheft på standard Petri retter, vasket og belagt kollagen-belagt vev kultur retter i RPMI + 5% FBS. Bildene ble tatt av en EVOS invertert mikroskopet på 400 X. Bar tilsvarer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10 : Skanning elektronmikroskop musen leveren anatomi. En mus lever var parfyme med PBS etterfulgt av bindemiddel (100 mM natrium cacodylate, 12 mL 25% glutaraldehyde, 15.6 mL 16% paraformaldehyde, veisalt 2.65 mM, 180.2 mM sukrose, blandet i 100 mL løsning) med en hastighet på 1 mL/min for 4 min. vev var skiver og forberedt for skanning elektronmikroskop. Bildene ble samlet på en feltet utslipp SEM på 10, 000 X. Gule piler indikerer microvilli mellom hepatocytter. Bar lik 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11 : Visualisering av døde versus live hepatocytter. Etter 2 vasker med Buffer 1, vurderes pelleted hepatocytter for live/dead forholdet av øyet. Lettere pellets (venstre) angir at minst halvparten av hepatocytter død. Det mørkere pellet til høyre er mer bestemt pelleted til bunnen av røret og er mer enn 90% live. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tabell 1: Cellen rensing | ||
| Celle Type | % målet celler | % andre celler |
| Hepatocytter | 99 | 1 |
| Sinsusoidal endotelceller | 89.1 | 10.9 |
Tabell 1: Vurdering av cellen renhet av * lys.
Discussion
Denne protokollen fremhever verktøyene som er tilgjengelige og som vil gi brukeren en høy grad av suksess i denne fremgangsmåten. En vellykket perfusjon er grunnleggende for alle nedstrøms programmer når du arbeider med primær celler.
Det er noen kritiske trinnene av fremgangsmåten som bestemmer suksess. Først må plassering kateter tips i portalen blodåre være riktig. Hvis plassert langt inne i leveren, vil bare små lobes være parfyme. Spissen bør være like nedenfor høyre og venstre grenene i portalen blodåre. Fordelen med å bruke en polymer-kompositt kateter over en nål er at barb nålen er mer sannsynlig å rive venen under perfusjon enn et kateter. Andre bestemmer collagenase kvaliteten og kvantiteten fordøyelsen effektiviteten i leveren. I denne fremgangsmåten prekvalifisert collagenase Type 4 ble brukt og det er resuspended på 0,5 mg/mL i Buffer 2 Hvis collagenase aktiviteten å være assayed er større enn 900 IU.
På slutten av collagenase perfusjon, bør leveren beholde en litt mørk brunfarge til brun farge. Hvis det er en lys brun farge, så er de fleste av hepatocytter død. Leveren bør falle fra hverandre da kuttet fra musen. I de beste forholdene, kan leveren øses ut av kroppens hulrom av musen med en liten skje. Lever i denne tilstanden gi alltid svært høyt levedyktighet. Hvis det tar mye arbeid å riste cellene fra hverandre, hvis leveren er fortsatt fast ved utpakking, eller hvis det er mye av makt må flytte hepatocytter gjennom filtrene, må hepatocytter en lavere levedyktighet. Hepatocytter er dekket med microvilli, som tillater dem å ha en meget høy overflate (Figur 10). Ufullstendig fordøyelsen beholder celle-celle veikryss mellom hepatocytter, og mekanisk klipping vil flerre plasma membranen. In situ perfusjon med collagenase er den beste metoden å bryte cellene og opprettholde høy levedyktighet. I Figur 11, ble to hepatocyte forberedelser er laget i som cellen pellets sammenlignet etter noen gangers vask i Buffer 1. Pellets til venstre er lettere og inneholder en celle levedyktigheten til 50%. Pellets til høyre er mørkere og har en levedyktigheten til 92%. Tilsvarende når væske helles fra de 50 mL koniske, er det mørkere pellet i røret, i kontrast til de lysere pellet, som vil gli i røret som væske helles av. Lavere celle levedyktighet eller ineffektiv perfusions kan oppstå når leveren har høye nivåer av sklerose.
Siden live hepatocytter har en høyere tetthet enn døde hepatocytter, vil sentrifugering prosedyrer resultere i et preparat som er svært ren i levedyktig hepatocytter15. Hvis det er en betydelig mengde døde hepatocytter (som ofte oppstår når forholdene er suboptimal), live kan celler være ytterligere beriket og atskilt fra døde celler med PVP graderinger. I tillegg siden live hepatocytter pellets raskere enn døde hepatocytter, vil aspirasjon av topp 3rd av pellet også øke andelen levende døde celler i pellet. Disse prosedyrene er raske og enkle metoder for å skille live fra døde hepatocytter og celle rusk når behøvde10,16. Dette er spesielt nyttig hvis prøven er dyrebare, og bare et par millioner celler kreves for eksperimentet.
I konklusjonen, er dette en enkel og effektiv metode for høsting hepatocytter og sekunder fra leveren. På dagens priser er kostnaden ved å utføre denne prosedyren inkludert alle reagenser og forbruksmateriell under 75 USD per forberedelse. Hvis flere mus er ønskelig, er det best å fortsette med hepatocyte rensing og holde NPC brøken på is til alle mus er behandlet. NPC er generelt stabile på is minst 5 h, men lengre tid har ikke blitt testet i dette laboratoriet.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Midlene er gitt i del av NIH fra grant R01HL130864.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
| T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
| Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
| Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
| Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
| Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
| glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
| curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
| sterlized spoon | Home supply store | ||
| Cotton ball(s) | Home supply store | ||
| Polyester sewing thread | Home supply store | ||
| Masking tape | Home supply store | ||
| thumb tacks | Home supply store | ||
| styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
| cookie/baking sheet | Home supply store | ||
| Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
| 19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
| BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
| Crystallizing dishes 100x50 | VWR | 89000-290 | |
| Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
| graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
| EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
| EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
| Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
| Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
| Reagents | |||
| Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
| Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
| KCl | 0.5 | 6.7 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
| KCl | 0.5 | 6.71 | |
| CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
| HEPES | 24 | 100 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
| Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.35 | 4.7 | |
| MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
| CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.2 | 2.7 | |
| Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
| KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
| Other reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | Gibco | 11965118 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | |||
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
| LSEC medium | |||
| RPMI | Gibco | 11875119 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
- Edstrom, S., Ekman, L., Ternell, M., Lundholm, K. Isolation of mouse liver cells: perfusion technique and metabolic evaluation. Eur Surg Res. 15 (2), 97-102 (1983).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Buhler, L. Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Sies, H. The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems. Methods Enzymol. 52, 48-59 (1978).
- Smedsrod, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. Munin open research archive. , University of Tromsø. 1-10 (2012).
- Smedsrod, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstrom, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell Tissue Res. 241 (3), 639-649 (1985).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Exp Cell Res. 349 (2), 291-301 (2016).
- Kreamer, B. L., et al. Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (4), 201-211 (1986).
- Meijer, D. K., Keulemans, K., Mulder, G. J. Isolated perfused rat liver technique. Methods Enzymol. 77, 81-94 (1981).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. J Vis Exp. (57), e3138 (2011).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. 2008 edn (1965).
- Liu, J., et al. Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells. Methods Mol Biol. 1540, 249-258 (2017).
- Knobeloch, D. E., Ehnert, S., Schyschka, L., Buchler, P., Schoenberg, M., Kleeff, J., Thasler, W. E., Nussler, N. C., Godoy, P., Hengstler, J., Nussler, A. K. Human Hepatocytes: Isolation, Culture, and Quality Procedures. Methods in Molecular Biology. 806, 99-120 (2012).
- Clarke, B. L., Weigel, P. H. Recycling of the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. ATP depletion blocks receptor recycling but not a single round of endocytosis. J Biol Chem. 260 (1), 128-133 (1985).
