Summary
Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge levensvatbaarheid en hoog rendement van hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen van lever. Dit wordt bereikt door zoogdierlevercellen de lever met een type IV collagenase oplossing via de portal ader, gevolgd door differentiële centrifugeren hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen te verkrijgen.
Abstract
Dit protocol wordt een methode voor het verkrijgen van hoge opbrengst en levensvatbaarheid voor muis hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen (SECs) geschikt voor het kweken van of voor het verkrijgen van cel lysates gedemonstreerd. In dit protocol, wordt de portal ader gebruikt als de site voor catheterisatie, in plaats van de vena cava, zoals dit besmetting van andere mogelijke celtypes in de laatste lever voorbereiding beperkt. Geen speciale instrumentatie is vereist tijdens de gehele procedure. Een waterbad wordt gebruikt als een bron van warmte om de temperatuur van alle buffers en oplossingen. Een standaard peristaltische pomp wordt gebruikt om te rijden de vloeistof, en een gekoelde tafelblad centrifuge is vereist voor het centrifugeren procedures. De enige beperking van deze techniek is de plaatsing van de katheter in de ader van de portal, die op een aantal van de muizen in de groottewaaier van 18-25 g is uitdagend. Een voordeel van deze techniek is dat slechts één ader wordt gebruikt voor de perfusie en de toegang tot de ader snel is, die minimaliseert ischemie en reperfusie van de lever waardoor de levensvatbaarheid van de hepatische cellen. Een ander voordeel bij dit protocol is dat het makkelijk te onderscheiden live dode hepatocyten door gezichtsvermogen vanwege het verschil in dichtheid van de cellulaire tijdens het centrifugeren stappen. Cellen van dit protocol kunnen worden gebruikt in celkweek voor alle downstream toepassingen evenals verwerkt voor elke biochemische beoordeling.
Introduction
Collagenase perfusie van de lever te verkrijgen van hepatocyten is verricht sinds de vroege jaren 1950 en is voortdurend verbeterd1,2,3,4. Een heel mooi overzicht van veel van de methoden, technieken en lever cel zuivering gebruikte reagentia is gecompileerd in Meyer et al.5. Verkrijgen van een bevredigende opbrengst van de hoogst haalbare hepatocyten en seconden is technisch uitdagend. De mechanische krachten die de cellen met inbegrip van de kwaliteit van collagenase scheiden zijn enkele van de variabelen die moeilijk te controleren zijn. Vanwege de gevoeligheid van de hepatocyte aan mechanische krachten, is hun levensvatbaarheid aanzienlijk verminderd in sub optimale omstandigheden, waarin de noodzaak voor een beschrijving van de optimale omstandigheden voor isolatie protocol wordt gevraagd. Seconden lijken niet zo gevoelig voor mechanische schuintrekken. Perfusie- in situ met collagenase spijsvertering is veruit de beste methode om het verstoren van cel-cel kruispunten ophalen van eencellige preparaten bij lever en andere organen zoals de darm en de milt6. Dit protocol wordt een eenvoudige methode voor de invoering van perfusie buffer in de ader van het portaal met behulp van een intrekbare kunststof katheter in plaats van een sneetje waardoor de portal ader te storten, zoals beschreven in Smedsrød et al.7gedemonstreerd.
Het doel van dit manuscript is om aan te tonen de belangrijkste stappen die nodig zijn voor succes in de lever overvloed-procedure. Deze stappen omvatten de plaatsing van de katheter, stroom van de perfusie vloeistoffen, en de behandeling van het weefsel na vertering. Debiet zijn aangepaste boven het natuurlijke cijfer van de bloedstroom, maar laag genoeg van de Glisson capsule om intact te houden. Zodra de lever wordt goed verteerd en cellen worden gescheiden in oplossing, is cel zuivering relatief eenvoudig of het wordt uitgevoerd door middel van centrifugeren differentiële, plaat adhesie, of door magnetische kraal zuivering. Live hepatocyten hebben een hogere dichtheid en zijn gemakkelijk gezuiverd van de nonparenchymal cellen (NPC) en de dode hepatocyten met trage centrifugeren. Voor de meeste toepassingen, plaat hechting voor het scheiden van Kupffer cellen (KCs) en SECs is een gemeenschappelijke methode8, maar er zijn rapporten dat het niet de beste zuiverheid van SECs9produceren. KCs hebben de neiging vast te houden aan vaste stijve oppervlakken snel en petrischalen (standaard polystyreen) zijn het meest gebruikte materiaal voor deze procedure. SEC of KC zuivering met behulp van magnetische kralen antilichaam-geconjugeerde is ongetwijfeld de beste methode voor belangrijke zuivering van deze cellen, hoewel de procedure een ander 3-4 h op dit protocol voegt en de totale opbrengst verminderde9 is. Dit verslag toont in detail het proces voor een optimale lever perfusie die meestal een groot aantal levensvatbare cellen levert.
Protocol
Alle dierlijke procedures die worden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) op de Universiteit van Lincoln - Nebraska onder protocol #1435.
1. voorbereiding
- Bereiding van de oplossingen en kweekmedia
- Bereiden alle cultuurmedia en buffer volgens de Tabel van materialen.
- Voorbereiding van instrumenten
- Instellen van een waterbad (> 10 L) op 42 ° C, een peristaltische pomp met variabele snelheid, en klauwen voor het houden van de kolven. Bereiden gebogen schaar en pincet (Figuur 1).
- Op of naast het waterbad, stelt op een bakplaat (ongeveer 38 x 26 cm) met een piepschuim zeem (50 mL conische rack), bedekt met een absorberend underpad gesneden in een stuk van 20 x 20 cm (Figuur 1).
- Plaats een stukje plakband (5-8 cm) in de buurt. Plaats een 20 cm polyester naaigaren in de buurt die gesneden en klaar voor gebruik. Het verkrijgen van een kunststof katheter met een intrekbare naald (7 mm x 19 mm, Figuur 1).
- Voorbereiding van glaswerk
- Met behulp van klemmen, plaats en immobiliseren een 1 L-kolf in het waterbad met 200 mL 1 x PBS met een stop met twee pipetten van 1 mL in te gaan op de oplossing. De kurk rubber is gekerfd zodat recirculatie van vloeistof in een gesloten circuit.
- Plaats een 125 mL-kolf met 45 mL Buffer 2 samen met een stop met twee pipetten van 1 mL, waarvan er één in de vloeistof in de buurt van de onderkant van de kolf en de andere die blijft boven de vloeistof en blaast van zuurstof in de kolf met een andere klem.
Opmerking: Elke pipet in de stoppers zal hebben een snelle adapter verbonden is met het eindpunt voor het eenvoudig wisselen van de buis te verbreken. Zuurstof wordt zachtjes stromen in beide kolven via de pipet in de stop dat is niet in de vloeistof ondergedompeld. - Gereserveerd twee steriele kristalliseren gerechten.
2. dierlijke Procedure
- Opwarmen van de PBS en Buffer 2 oplossingen tot 42 ° C in het waterbad en circuleren PBS voor ten minste 20 mL/min bij de slang in een gesloten circuit de vloeibare lijnen om warm te houden. Eventuele overtollige buis in het waterbad blijven onderdompelen zo dicht mogelijk tot 42 ° C. Afvoer van de andere stekker van de buis in de 1 L kolf met PBS.
- Plaats een katoenen bal op de absorberende underpad en voeg ongeveer 2 mL 30% Isofluraan (aangelengd met polyethyleenglycol 200 die de verdampingssnelheid van Isofluraan vermindert) op de katoenen bal met behulp van een precisiepipet overdracht.
- De muis halen door de staart, plaatst u deze in een van de crystallizing gerechten, en vervolgens snel de schotel op de katoenen bal kantelen, zodat de muis heeft een kleine ruimte om te ademen van de narcose. Observeer het ademhalingstarief van de muis en zorgen dat de muis is in feite onder verdoving.
Opmerking: Het ademhalingstarief moet langzamer en dieper, de staart slappe, en de poten op de snuifje proef onder verdoving; Zie richtlijnen voor de IACUC voor meer informatie. - Terwijl de muis gaat onder verdoving (dit duurt 1-2 min), bereiden het vat van een 10 mL spuit door te trekken uit de zuiger en een kleine katoenen bal te voegen. Voeg 1-2 mL 30% Isofluraan met een pipet overdracht tot de katoenen bal binnen het vat en plaats het vat open-end neer op een tafel tijdens het wachten voor de muis tot onbewuste.
- Snel opstijgen van de crystallizing schotel, flip van de muis op zijn rug en plaatst u de injectieampul op zijn neus. Dubbel te controleren het ademhalingstarief, Teen snuifje en slappe staart. Alle reacties op de teen knijp- en slappe staart geeft aan dat de muis niet volledig onder narcose. Houd de injectieampul over de snuit te handhaven van bewusteloosheid.
- Plaats de duim spijkers door de poten van de muis, met de benen gestrekt in liggende positie. Natte de buik en de ribbenkast met 70% isopropanol of ethanol.
- Met de rechte pincet in de ene hand, til de huid in de buurt van de onderkant van de buik. Knip met een schaar in de andere hand, de tenten huid en buikvlies. De incisie moet horizontaal of over de basis van de tenten huid. Zorg ervoor dat alle lagen van de huid en het buikvlies doorsnijden om toegang tot de darm. Gesneden lateraal rond de buik tot de ribbenkast aan beide zijden zonder plukt een van de organen.
- Afgesneden de klep van huid door snijden in de lagere ribbenkast. De darmen naar rechts verplaatsen met de achterkant van de verlostang om de portal vein bloot te stellen.
Opmerking: Bloeden uit het dier moet minimaal; het dier moet nog steeds worden ademhalen en onder diepe verdoving. - Plaats de gesloten gebogen verlostang onder de portal ader tussen de lever en superieure pancreaticoduodenal ader (Figuur 3 pijl).
- Open de verlostang terwijl onder de portal ader. Pak de draad en trek het voorzichtig door zodat het onder de portal ader wordt gecentreerd. Leg een knoopje van de bovenhands rond de ader portal zonder het cinching naar beneden.
- Plaats de gebogen verlostang onder de portal ader en trek het voorzichtig naar de staart van de muis om de ader (Figuur 4A) rechtzetten.
- Plaats met de katheter in de andere hand, de schuine kant van de naald gezicht-omhooggaande en parallel met het onderste deel van de ader van de portal in de buurt van de verlostang (Figuur 4B).
- Voorzichtig doorprikken de ader met de naald (Figuur 4C). Zorg ervoor de schuine kant van de naald in het lumen van de ader. Intrekken van de Openspringende naald en blijven de polymeer-katheter via de ader te duwen totdat de schuine kant in de buurt van de veneuze vertakte gebied is. Dit is binnen de lever. Als de katheter op de juiste wijze is geplaatst, zal een terug-doorstroming van het bloed zichtbaar zijn. (Figuur 4D).
- Draai de bovenhands knoop en trek het naar beneden op de katheter te helpen stabiliseren van het. Direct afslaan van de pomp rate van 20 mL/min tot 4 mL/min en snijd een andere grote bloedvat voor de afwatering. Snijd de aorta abdominalis voor optimale resultaten.
- Plaats de andere stekker van de buis aan de contrasteker van de katheter (Figuur 5A). Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de lijn. Wees voorzichtig dat de katheter niet ofwel geduwd in de lever of uit de ader is. Plaatsing van de wol is niet essentieel, maar het helpt voorkomen dat back-stroom uit de ader en zorgt u ervoor dat de katheter in de juiste positie (Figuur 5B, C).
- Gebruik plakband om te immobiliseren van de buis op de underpad. De rechte verlostang te knijpen het afvalwater bloedvat te blazen de lever een paar keer gebruiken om ervoor te zorgen dat al het bloed uit (Figuur 5D) heeft gedraineerd.
Opmerking: Standaard laboratorium tape werkt niet; afplakband blijft echter vast aan de underpad, ook in natte omstandigheden.
3. lever perfusie
- Terwijl de lever is spoelen met PBS, meet ongeveer 24 mg van Collagenase Type IV en breng dit in de kolf met 45 mL Buffer 2 in het waterbad. Zorg dat de vloeistof in de kolf swirl zodat de collagenase volledig is opgelost en plaats de kolf terug in de klem zodat het vloeibare met gedeelte van de kolf wordt volledig ondergedompeld in het water.
- Observeer de verandering in de kleur van de lever zoals het is gespoeld met PBS. Omzetten in de buis van de uitstroom uit de maatkolf van 1 L de 125 mL-kolf. Laat geen luchtbellen naar stroom in de lever.
- Zodra de perfusie buffer de lever bereikt, knijp even strak het afvalwater bloedvat om te bouwen wat druk binnen het schip en deze vloeistof te vullen alle lobben van de lever. Zorg dat u niet af te snijden drainage te lang, dat kan barsten de dun bindweefsel rond de lever (Glisson de capsule) en vernietigen de perfusie of het debiet van de vloeistof binnen het capillaire bed van de lever.
- Voldoende Buffer 2 met collagenase te perfuse via de lever totdat alle 45 mL hebben stroomde door het weefsel.
Opmerking: Als dat lukt, van de Glisson capsule moet worden gescheiden van de parenchym of het leverweefsel en de lever hoort zich amorf. - Voeg ongeveer 10 mL Buffer 1 toe aan de andere crystallizing schotel en plaats deze naast de muis.
- Verwijderen van de katheter en de pomp uitzetten.
- Met de rechte Tang en schaar, knip de lever van de muis. Als de spijsvertering collagenase zeer efficiënt was, het mogelijk moet zijn een schone, steriele lepel aan kant te schep de lever van de muis en plaats deze in de Buffer 1.
4. de hepatocyte zuivering
Opmerking: De manipulatie van de cellen worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap te beperken van verontreiniging als de cellen worden gekweekt in alle opeenvolgende stappen.
- Met behulp van steriele techniek, pak de lever met een tang en zachtjes schudden de cellen van de lever. Scheuren of terugtrekken van de Glisson capsule: de buffer wordt ondoorzichtig als cellen van de lever worden geschud.
- Giet af oplossing van de cel in een 50 mL kegelvormig met een 100 µm filter geplaatst over de bovenkant.
- Meer Buffer er 1 bij optellen om de lever overblijfselen en blijven schudden uit cellen. Totdat de lever verschijnt verstoken van cellen of wanneer de onverteerd gedeelten van de lever doen geen oogst meer cellen.
- Giet de cellulaire vloeistof in een andere 50 mL kegelvormig met een 40 µm filter.
- Centrifugeer de conische in een swingende rotor van de emmer bij 100 x g gedurende 3 minuten.
Opmerking: Gebruik niet de maximale rem als dit kan het verjagen van de cel-pellet. Gebruik van de rem op 80%, hetgeen lager voldoende voor alle resterende centrifugeren stappen bij 4 ° C is - Giet af het supernatant (waarop NPC's en dode hepatocyten) in een schoon conische en plaats deze op het ijs. Ervoor zorgen dat dit gebeurt in een beweging te observeren van de naleving van de pellet.
- Resuspendeer de pellet in 40 mL Buffer 1. Herhaal stap 4.5 en 4.6. Resuspendeer de pellet in 40 mL Buffer 3. Herhaal de stappen 4.5 en 4.6, tweemaal.
- Resuspendeer de gezuiverde hepatocyten in warme DMEM + 10% FBS + 2 x penicilline-streptomycine (Pen/Strep).
- Als de cellen worden gekweekt op collageen gecoate platen, laten houden voor 1 h en vervangen de media ten minste eenmaal als dit zal voorkomen dat een ontluikende bacteriële contaminanten.
- De collageen gecoate platen maken door ze aan het broeden met 0,05% collageen in 0,001% azijnzuur gedurende ten minste 1 uur bij 37 ° C, en daarna te wassen met 1 x PBS.
- Als de hepatocyte levensvatbaarheid laag is en er is een verlangen om te verkrijgen van gezuiverde high-levensvatbare hepatocyten dan het volgende protocol aangepast van Kreamer et al.10gebruiken.
- Mix 9 volumes van PVP oplossing (Percoll, een 23% w/w-oplossing van water en 15-30 nm Coloïdale siliciumdioxide deeltjes gecoat in Polyvinylpyrrolidon voor dichtheid centrifugeren) en 1 deel 10 x HBSS om een iso-osmotische PVP-oplossing (SIP) te maken.
- 24 mL SIP toevoegen aan een steriele 50 mL conische die kan worden opgeslagen in deze voorwaarden voor maximaal 2 maanden bij 4 ° C.
- Aanpassen van de concentratie van de hepatocyte op 5-10 × 10-6 cellen/mL met kweekmedium zoals in stap 4.8 genoteerd.
- Voeg 25 mL celsuspensie tot elke 24 mL SIP met conische en meng door zachte inversie. De dichtheid van deze oplossing is 1.06 g/mL.
- Centrifugeer de conische bij 50 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- De SIP en flocculant gecombineerd en resuspendeer de cellen in HBSS.
- Wassen van de cellen door centrifugeren bij 50 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Herhaal stap 4.10.6 nogmaals en vervolgens resuspendeer de cellen in groeimedium.
5. SEC zuivering
- Pellet de cellen in het supernatant uit stap 4.6 door het draaien van de buizen bij 163 x g gedurende 10 min. negeren het supernatant van de buisjes en resuspendeer alle cel pellets in 5 mL RPMI zonder serum en hen samen te bundelen in één buis.
- Zodra alle pellets hebben gebundeld, toevoegen van RPMI aan eindvolume van 35 mL.
- Centrifugeer de gepoolde conische op 25 x g voor 3 min. zorgvuldig gecombineerd met een 25 mL pipet en plaats de top 25 mL van RPMI deze media met NPC's in een schone 50 mL conische op ijs.
- Voeg 25 mL vers RPMI terug op de buis en resuspendeer de pellet.
- Herhaal stap 5.3 voor een tweede wassen en zwembad het supernatant. Gooi de overblijvende 10 mL van de media en pellet (de pellet bestaat meestal uit dode hepatocyten). Centrifugeer het gepoolde supernatant bij 163 x g gedurende 10 minuten.
- Tijdens het centrifugeren, bereiden de PVP oplossing verlopen in een 50 mL kegelvormig.
- Voeg toe 15 mL 50% PVP-oplossing tot de 50 mL conische gevolgd door 20 mL 25% Percoll met een pipet ingesteld op de traagste uitwerpen bedekt. Zorg om het observeren van een refractie-lijn op de 15 mL merk dat de twee lagen kadert, zoals dit is waar de SEC en de KCs zal statistische na het centrifugeren.
- Resuspendeer de cellen die eerder Ingehuld in stap 5.5 in 10 mL koude RPMI en hen naar de PVP oplossing gradiënt overlay. Zorg ervoor dat een duidelijke afbakening tussen de twee lagen behouden. Het verloop bij 805 x g gedurende 20 minuten centrifugeren met een rem ingesteld op 50%.
- Van boven naar beneden richting gecombineerd tot de 20 mL streep op de buis en zich te ontdoen van dit materiaal. Pipetteer 5 mL overdracht door de SEC en de KCs die zich bevinden op het raakvlak van 25/50% te verzamelen. Gooi bruin bosjes van cellen zijn dood hepatocyten.
- Plaats van de cellen in een 50 mL conische en voeg RPMI aan tot de streep 50 mL om te verdunnen de PVP-oplossing. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 min, met 80% rem.
- Gecombineerd en verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet tijdens het wassen van de kegel van de conische in 12 mL warme RPMI.
- Scheiden van de SEC van KCs door het plaatsen van de bovendrijvende substantie in een polystyreen petrischaal en broeden in een incubator bevochtigde weefselkweek gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
- Gecombineerd de media met een 25 mL pipet en spoel de plaat met dezelfde media, met de pipet op de laagste snelheid ingesteld op het verzamelen van de resterende seconden terwijl de KCs houden aan de plaat.
- Centrifugeer het SECs bij 200 x g gedurende 10 minuten en resuspendeer RPMI + 5% FBS + Pen/Strep. Vervolgens titer de cellen, en de plaats in collageen beklede cultuur gerechten.
Representative Results
Een demonstraties, verfijnde methode voor lever perfusie en zuivering/verrijking van hepatocyten en seconden wordt hier gepresenteerd waarmee gedetailleerde tips voor optimale cel zuivering/verrijking vergelijkbaar met andere afgedrukte rapporten opgesteld in dit waarnaar wordt verwezen Bekijk 5. De kritische stappen die bepalend zijn voor succes voor cellulaire zuivering optreden in de route en de technische details van de procedure collagenase perfusie en worden uiteengezet in de dit protocol. De set-up voor het apparaat is vrij eenvoudig en kosteneffectief met gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden, in tegenstelling tot andere systemen die gepubliceerd11 (Figuur 1 zijn). In deze set-up zit de lade vasthouden van de muis op het waterbad met een aantal van de overtollige buis in het waterbad handhaving van de temperaturen van de vloeistoffen zoogdierlevercellen binnen de lever. Het apparaat zoals hier getoond mogen worden gebruikt voor zowel muizen als ratten, met een iets andere geometrie voor rat lever perfusie12 (Figuur 2).
In deze procedure, is de lever geperfundeerd via de portal vein in plaats van de vena cava (dat is een andere populaire perfusie route) te wijten aan het gemak van toegang in de buik en dat de ader-feeds rechtstreeks in de lever. De viewer moeten beseffen dat de portal ader heeft meerdere kleine vestigingen die het perfusaat kunnen kortsluiting, en de katheter moet worden geplaatst langs deze takken voor optimale succes13 (Figuur 3). Zodra de portal ader is geïdentificeerd, worden gebogen pincet gebruikt om een chirurgische hechtdraad of polyester draad onder de portal vein tekenen tussen de lever en de superieure alvleesklier-duodenale ader. De verlostang worden ook gebruikt om de portal-ader die onder positieve bloeddruk (Figuur 4A) rechtzetten. De naald in de katheter parallelle en naast de ader (Figuur 4B) moet worden geplaatst en de schuine kant voorzichtig moet worden ingevoegd in het lumen van de ader (Figuur 4C). Juiste plaatsing zal worden aangegeven door bloed verschijnt langs de katheter. Zodra de naald wordt teruggetrokken de katheter moet worden gestabiliseerd met een draad die hieraan gebonden en de bloeddruk zal dwingen bloed omhoog door de katheter. Het wordt aanbevolen dat de katheter worden aangesloten op de pomp slang voordat bloed morst uit (Figuur 4D). Zodra de slang van de pomp is verbonden, onmiddellijk snijden een groot bloedvat zoals de vena cava of aorta abdominalis voor bloed/vloeistof afvoer (Figuur 5A). Er moet meestal gesneden van de kant van de buikwand van de muis voor voldoende afwatering, zoals een ophoping van bloed in de buik maakt het moeilijk om te visualiseren van het proces van perfusie en bloed kan worden overgedragen naar de cel zuivering (Figuur 5 B). Zodra de PBS begint te perfuse van de lever, de lever zal blanch met de afwezigheid van bloed (Figuur 5C). Als slechts een paar van de lobben blanch, dan is de waarschijnlijke oorzaak is dat de katheter te ver binnen de lever heeft gebracht en moet worden ondersteund uit langzaam. Zodra plaatsing van de katheter wordt bevestigd, gebruiken waterbestendig plakband om de buis in plaats veilig te stellen. Algemene laboratorium tape is meestal niet voldoende. Om te bevestigen de juiste plaatsing van de katheter, knijp de gesneden bloedvat om te staken van drainage en observeren van de verhoging van de druk in de lever. Hierdoor zal de steun in het afboeken van bloed uit de lever (Figuur 5D). Dit moet ook gebeuren wanneer de collagenase oplossing in eerste instantie in de lever om ervoor te zorgen gaat dat alle lobben zijn blootgesteld aan collagenase. Na de collagenase oplossing wordt uitgevoerd, een goede collagenase spijsvertering is een indicatie door een scheiding van de Glisson de capsule van de parenchym.
De algemene procedure voor cellulaire zuivering is geschetst in Figuur 6 en Figuur 7 waar hepatocyten zijn geoogst vroeg op in de procedure tijdens de lage snelheid draaiingen en zijn zeer zuiver na 4 wast in BSA-bevattende buffers (Figuur 8 ). Seconden die zijn samen met KCs gezuiverd op een PVP helling (Figuur 9A) en vervolgens gescheiden door selectieve hechting op een collageen beklede polystyreen petrischaal. De zuiverheid van de seconden met behulp van deze methode is 83-90% zuiver en hangt grotendeels af van de algehele doeltreffendheid van de collagenase spijsvertering (Figuur 9B). Kwantitatieve metingen met behulp van licht microscopie (zoals hepatocyten zowel SECs hebben kenmerken van andere cellen) tonen aan dat in een representatieve preparaat, hepatocyten zijn bijna 100% zuiver en SECs zijn iets meer dan 89% zuiver (tabel 1). Als alternatief, een hogere verrijking van seconden kan worden verkregen door magnetische kolom scheiding na het verloop van de PVP, hoewel die valt buiten het bestek van dit protocol. Meer informatie over magnetische scheiding van SEC en KCs kan worden gevonden in Meyer et al. 9 en Liu et al. 14 bedenke men dat de levensvatbaarheid van hepatocyten snel in een onvoldoende verteerd lever afneemt, maar dit niet noodzakelijk waar van de NPC is. onvoldoende verteerd levers produceren ook meer cellulaire puin, die niet helemaal is geëlimineerd in de stappen van centrifugeren.
Figuur 1 : Schematische weergave van de suite perfusie. De kolven worden op hun plaats gehouden door klemmen (niet afgebeeld); de slang met vloeistof is verwisseld uit de maatkolf van 1L aan de 125 mL maatkolf tijdens de procedure wordt vertegenwoordigd door de rode stippellijn. Opmerking, die de zuurstof voeden niet rechtstreeks in de oplossingen in de kolven bubble. De kurken moeten ook worden gekerfd zodat een gesloten circuit vloeistof stroom met de slang in de Inkeping zijn ingevoegd. Dit is essentieel tijdens warming-up van de buis en uitwerpen van alle lucht in de leidingen. De afloop van de lucht is samengesteld uit de T-connector die is aangesloten op Tygon buizen en snuifje klemmen voor snelle open en sluiting van het systeem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : De suite van de perfusie tijdens muis lever perfusie. De lade met de muis is geplaatst op de hoek van het waterbad. De zuurstof wordt losgekoppeld van de collagenase oplossing zoals die was al zuurstof tijdens de warming-up. Locatie van objecten zijn A) zuurstof lijnen, B) 1 L kolf met PBS, C) 125 mL-kolf met buffer 2 met collagenase, pomp D), E) pomp controles, F) Waterventiel, G) vloeiende lijn die loopt van de kolf door de pomp en de muis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Foto van de therapieën van de muis buik. Inbrengen van de katheter moet net onder de kruispunten van de maag en alvleesklier ader komt uit de portal vein (groene stip) en het uiteinde moet worden geplaatst in de buurt van de links en rechts hepatische portal veins (gele stip) die vormt een vork in de belangrijkste lobben van de lever. Zodra de juiste plaatsing wordt bereikt, moet de katheter worden gestabiliseerd met draad met behulp van een eenvoudige bovenhands knoop. K = nier, L = lever, SI = dunne darm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Plaatsing van de katheter in de ader portal. (A) de verlostang worden gebruikt om bloed congestie van de portal-ader en voor het rechtzetten van de ader voor plaatsing van de katheter. (B) de katheter wordt opgesteld in parallel met de ader van de portal met de schuine kant omhoog. (C) de schuine kant van de naald in de katheter wordt in de ader, niet via de ader geplaatst. (D) de naald van de katheter is ingetrokken en bloed zal terugvoer via de katheter, zoals aangegeven door de tip van de verlostang. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Goede lever perfusie. (A) na de katheter plaatsing, het vrouwelijke Luer-einde van de katheter is verbonden met het mannelijke Luer einde (gesneden uit een spuit van 1 mL) van de slang van de pomp. (B) nadat snijden één van de grote aflopende bloedvaten, bloed en PBS worden bevloeid uit de buik door het snijden van de kant van de muis met een schaar. (C) de lever moet blanch terwijl het bloed is gespoeld uit en (D) zal zwellen wanneer onder druk door persen afsluiten van de geknipte bloedvat met een tang. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Schematisch overzicht van de hepatocyte zuivering en isolatie van de NPC. Allermeest naar de centrifugeren stappen willen verwijderen van levende en dode hepatocyten uit de niet-parenchymal cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Schematisch overzicht van SEC verrijkings- en zuivering. NPC's worden gescheiden door het verloop van de PVP gevolgd door SEC scheiding van korte hechting aan een standaard polystyreen plaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : Gezuiverd van hepatocyten. Hepatocyten waren verguld op collageen gecoat weefselkweek platen met DMEM + 8% FBS + Pen/Strep en 6 h gevolgd door de foto collectie door een microscoop bij 400 X ge¨ uncubeerd. Bar is gelijk aan 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 : SEC zuivering. (A) SEC en KCs gewassen met serumvrij medium werden verzameld uit de 25/50% PVP interface (gele pijlen). (B) de seconden die werden gescheiden van de KCs door selectieve hechting op standaard petrischalen, gewassen en vergulde op collageen beklede weefselkweek gerechten in RPMI + 5% FBS. Beelden werden genomen door een Microscoop EVOS omgekeerd bij 400 X. Bar is gelijk aan 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10 : Scanning elektronen microscopie van muis lever anatomie. De lever van een muis was geperfundeerd met PBS gevolgd door fixeer (100 mM natrium cacodylate 12 mL 25% Glutaaraldehyde, 15.6 mL 16% paraformaldehyde, 2,65 mM calciumchloride, 180.2 mM sacharose, gemengd in 100 mL oplossing) met een snelheid van 1 mL/min voor 4 min. weefsels werden gesneden en voorbereid voor het scannen van elektronenmicroscopie. Beelden werden verzameld op een veld emissie SEM op 10, 000 X. Gele pijlen geven aan de microvilli tussen de hepatocyten. Bar is gelijk aan 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 11 : Visualisatie van dode versus live hepatocyten. Na 2 met Buffer 1 wast, kunnen Ingehuld hepatocyten worden beoordeeld voor wonen/dode verhouding met het blote oog. Een lichtere pellet (links) geeft aan dat ten minste de helft van de hepatocyten dood. Is krachtiger Ingehuld de donkerder pellet op het recht naar de onderkant van de buis en is meer dan 90% leeft. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Tabel 1: Cel zuivering | ||
| Celtype | % doelcellen | % andere cellen |
| Hepatocyten | 99 | 1 |
| Endotheliale cellen van de Sinsusoidal | 89.1 | 10.9 |
Tabel 1: Beoordeling van de zuiverheid van de cel door de lichte microscopie.
Discussion
Dit protocol onderstreept de hulpprogramma's die beschikbaar zijn en dat de gebruiker een hoge mate van succes in deze procedure zal veroorloven. Een succesvolle perfusie is van fundamenteel belang voor elke stroomafwaartse toepassing bij het werken met primaire cellen.
Er zijn een paar essentiële stappen van de procedure die bepalend zijn voor succes. Ten eerste moet de plaatsing van het uiteinde van de katheter in de ader van de portal de juiste. Als geplaatst te ver binnen de lever, kan alleen de kleine lobben zal worden geperfundeerd. De tip moet net onder de linker- en takken van de ader van de portal. Het voordeel van het gebruik van een polymeer-samengestelde katheter over een naald is dat de Berber van de naald meer kans is op het scheuren van de ader tijdens de perfusie dan een katheter. Ten tweede, de collagenase kwaliteit en kwantiteit bepalen de efficiëntie van de spijsvertering van de lever. In deze procedure, pre-gekwalificeerde collagenase Type 4 werd gebruikt en het is geresuspendeerde bij 0,5 mg/mL in Buffer 2 als de activiteit collagenase vehiculumcontrolegroep worden groter dan 900 IU is.
Aan het einde van de perfusie collagenase, moet de lever een ietwat donker bruin tot bruine kleur behouden. Als er een licht bruine kleur, zijn de meeste van de hepatocyten dood. De lever moet worden uit elkaar te vallen toen gesneden van de muis. In de beste omstandigheden, kan de lever worden schepte uit de lichaamsholte van de muis met een kleine lepel. Levers in deze toestand geven altijd de levensvatbaarheid van de zeer hoge cellen. Als het kost veel moeite te schudden de cellen uit elkaar, als de lever is nog steeds stevig tijdens de extractie, of als er is een heleboel kracht die nodig is om de hepatocyten doorlopen de filters, dan is de hepatocyten zullen hebben een lagere levensvatbaarheid. Hepatocyten zijn bedekt met microvilli, waardoor ze een zeer hoge oppervlakte (Figuur 10). Onvolledige spijsvertering behoudt cel kruispunten tussen hepatocyten en mechanische scheren zal scheuren het plasma-membraan. Perfusie- in situ met collagenase is de beste methode om de cellen splitsen en onderhouden van hoge levensvatbaarheid. In Figuur 11, werden twee hepatocyte in die de cel pellets worden voorbereidingen getroffen nadat een paar wast in Buffer 1 vergeleken. De pellet aan de linkerkant is lichter en bevat een levensvatbaarheid van de cellen van ongeveer 50%. De pellet op het recht is donkerder en heeft een levensvatbaarheid van 92%. Evenzo, wanneer de vloeistof wordt gegoten uit de 50 mL kegelvormig, de donkerder pellet stilstaat in de buis, in tegenstelling tot de lichtere pellet, die in de buis glijden zal als de vloeistof is gegoten uit. De levensvatbaarheid van de cellen van de lagere of inefficiënte perfusions treedt op wanneer de lever hoge niveaus van sclerose heeft.
Aangezien levende hepatocyten een hogere dichtheid dan dode hepatocyten hebben, zal het centrifugeren procedures resulteren in een preparaat dat zeer zuiver in levensvatbare hepatocyten15. Als er een significante hoeveelheid van dode hepatocyten (die vaak optreedt wanneer de voorwaarden zijn suboptimaal), levende kunnen cellen verder verrijkt en gescheiden van dode cellen met behulp van PVP verlopen. Bovendien, aangezien levende hepatocyten sneller dan dode hepatocyten pellet, zal aspiratie van de top 3rd van de pellet ook de verhouding van levend aan dode cellen in de pellet. Deze procedures zijn snel en gemakkelijk methoden om te scheiden wonen van dode hepatocyten en cel puin wanneer nodig10,16. Dit is vooral handig als het monster is kostbaar, en slechts een paar miljoen cellen zijn vereist voor het experiment.
Kortom, is dit een gemakkelijke en efficiënte methode voor het oogsten van hepatocyten en seconden van de lever. Tegen lopende prijzen is de kosten van het uitvoeren van deze procedure inclusief alle reagentia en disposables minder dan 75 USD per voorbereiding. Als meerdere muizen gewenst zijn, is het beste om te gaan met de hepatocyte zuivering en houden van de Fractie van de NPC op ijs totdat alle de muizen zijn verwerkt. NPC's zijn over het algemeen stabiel op ijs voor ten minste 5 h, maar langere tijden zijn niet getest in dit laboratorium.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering wordt gedeeltelijk verzorgd door de NIH verlenen R01HL130864.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
| T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
| Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
| Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
| Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
| Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
| glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
| curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
| sterlized spoon | Home supply store | ||
| Cotton ball(s) | Home supply store | ||
| Polyester sewing thread | Home supply store | ||
| Masking tape | Home supply store | ||
| thumb tacks | Home supply store | ||
| styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
| cookie/baking sheet | Home supply store | ||
| Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
| 19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
| BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
| Crystallizing dishes 100x50 | VWR | 89000-290 | |
| Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
| graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
| EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
| EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
| Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
| Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
| Reagents | |||
| Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
| Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
| KCl | 0.5 | 6.7 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
| KCl | 0.5 | 6.71 | |
| CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
| HEPES | 24 | 100 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
| Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.35 | 4.7 | |
| MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
| CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.2 | 2.7 | |
| Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
| KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
| Other reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | Gibco | 11965118 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | |||
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
| LSEC medium | |||
| RPMI | Gibco | 11875119 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
- Edstrom, S., Ekman, L., Ternell, M., Lundholm, K. Isolation of mouse liver cells: perfusion technique and metabolic evaluation. Eur Surg Res. 15 (2), 97-102 (1983).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Buhler, L. Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Sies, H. The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems. Methods Enzymol. 52, 48-59 (1978).
- Smedsrod, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. Munin open research archive. , University of Tromsø. 1-10 (2012).
- Smedsrod, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstrom, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell Tissue Res. 241 (3), 639-649 (1985).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Exp Cell Res. 349 (2), 291-301 (2016).
- Kreamer, B. L., et al. Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (4), 201-211 (1986).
- Meijer, D. K., Keulemans, K., Mulder, G. J. Isolated perfused rat liver technique. Methods Enzymol. 77, 81-94 (1981).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. J Vis Exp. (57), e3138 (2011).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. 2008 edn (1965).
- Liu, J., et al. Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells. Methods Mol Biol. 1540, 249-258 (2017).
- Knobeloch, D. E., Ehnert, S., Schyschka, L., Buchler, P., Schoenberg, M., Kleeff, J., Thasler, W. E., Nussler, N. C., Godoy, P., Hengstler, J., Nussler, A. K. Human Hepatocytes: Isolation, Culture, and Quality Procedures. Methods in Molecular Biology. 806, 99-120 (2012).
- Clarke, B. L., Weigel, P. H. Recycling of the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. ATP depletion blocks receptor recycling but not a single round of endocytosis. J Biol Chem. 260 (1), 128-133 (1985).
