Summary
Bu iletişim kuralının amacı yüksek canlılık ve yüksek verim tetkikine ve sinüsoidal endotel hücreleri karaciğer elde etmektir. Bu bir tür IV collagenase eriyik yolu ile portal ven, hepatositlerin ve sinüsoidal endotel hücreleri elde etmek için farklı aralıklarla tarafından takip ile karaciğer Ventriküler tarafından gerçekleştirilir.
Abstract
Bu iletişim kuralı yüksek verim ve canlılığı fare tetkikine ve sinüsoidal endotel hücreleri (saniye) kültür veya hücre lysates elde etmek için uygun elde etmek için bir yöntem gösterir. Bu kirlenme son karaciğer hazırlık diğer olası hücre tiplerinin sınırları olarak bu protokol için portal ven site Kateterizasyon için vena kava yerine kullanılır. Hiçbir özel araçları yordam gereklidir. Bir su banyosu ısı kaynağı olarak tüm arabellekleri ve çözümleri sıcaklığını korumak için kullanılır. Standart Peristaltik pompa sıvının sürücü için kullanılır ve buzdolabında bir masa üstü santrifüj Santrifüjü yordamlar için gereklidir. Sadece bu tekniğin bazı 18-25 g boyut aralığı fareler zorlu portal ven içinde kateter yerleştirme kısıtlamasıdır. Bir avantajdır bu tekniğin tek bir ven perfüzyon için kullanılmaktadır ve damar erişim hangi iskemi ve reperfüzyon karaciğer hücre canlılığı azaltır karaciğer en aza indirir, hızlıdır. Bu iletişim kuralı için bir diğer avantajı canlı ölü tetkikine hücresel yoğunluk farklılığı nedeniyle görme tarafından Santrifüjü adımları sırasında ayırt etmek kolay olmasıdır. Bu iletişim kuralı hücrelerden hücre kültüründe herhangi bir aşağı akım uygulama için kullanılacak yanı sıra herhangi bir biyokimyasal değerlendirme için işlenmiş.
Introduction
Collagenase perfüzyon tetkikine elde etmek için karaciğer erken 1950'lerden beri gerçekleştirilen ve sürekli1,2,3,4geliştirilmiştir. Çok güzel bir inceleme yöntemleri, teknikleri ve karaciğer hücre Arıtma kullanılan reaktifler çoğunun Meyer ve ark5' te derlenmiştir. Son derece uygun tetkikine ve saniye bir tatmin edici verim alma teknik olarak zordur. Collagenase kalitesini de dahil olmak üzere hücreleri ayrı mekanik kuvvetleri kontrol etmek zor değişkenleri bazılarıdır. Mekanik Kuvvetleri Hepatosit duyarlılık nedeniyle, canlılığı belirgin yalıtım için en uygun koşulları açıklayan bir protokol ihtiyacını isteyen alt-optimal koşullarda azalır. Saniye mekanik kesme için hassas olmak görünür. Situ perfüzyon ile collagenase sindirim karaciğer ve diğer organlara bağırsak ve dalak6gibi tek hücre ürünleri almak için hücre-hücre kavşak bozmak için en iyi yöntem gereğidir. Bu iletişim kuralı perfüzyon arabellek portal ven daraltmak, portal ven Smedsrød ve ark7' de açıklandığı gibi neden olabilir bir kesi yerine bir geri çekilebilir plastik kateter kullanarak tanıtmak için basit bir yöntem gösterir.
Bu el yazması karaciğer bolluk yordamı başarı için gereken en kritik adımları göstermek için hedeftir. Kateter yerleştirme, bu adımlar içerir perfüzyon sıvılar ve sindirim sonra doku işleme akışı. Akış oranları kan akımı doğal hızı üzerinde ayarlanmış ama Glisson'ın kapsül sağlam tutmak için yeterince düşük. Bir kez karaciğer düzgün sindirmek ve hücreler çözümde ayrılır, hücre arıtma olup olmadığını fark Santrifüjü, plaka yapışma, veya manyetik boncuk arıtma tarafından gerçekleştirilen oldukça kolaydır. Canlı tetkikine yüksek yoğunluklu var ve nonparenchymal hücreleri (NPCs) ve yavaş hız Santrifüjü ile ölü tetkikine kolayca saf. Çoğu uygulama için Kupffer ayırmak için plaka adezyon (KCs) hücreleri ve saniye olduğu ortak bir yöntem8saniye9en iyi saflığı üretmek değildir raporları olsa. KCs katı sert yüzeylere hızlı bir şekilde bağlı kalmak için bir eğilimi var ve Petri yemekler (Standart polistiren) bu yordamı için en sık kullanılan malzeme vardır. SN veya KC saflaştırılması kullanımıyla manyetik boncuklar antikor Birleşik hiç şüphesiz en iyi bu hücrelerinin önemli arıtma rağmen bu protokolü üzerine başka bir 3-4 h yordamı ekler ve genel verim azalmıştır9yöntemdir. Bu rapor için genellikle hücrelerin sayısının yüksek verimleri en uygun bir karaciğer perfüzyon sürecini ayrıntılı olarak gösterir.
Protocol
Bu protokol için özetlenen tüm hayvan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Lincoln Üniversitesi - iletişim kuralı #1435 altında Nebraska tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlık
- Çözümler ve kültür ortamı hazırlanması
- Tüm kültür medya ve arabellek Malzemeler tablogöre hazırlayın.
- Aletleri hazırlanması
- Bir su banyosu ayarla (> 10 L) 42 ° C, değişken hız ve şişeler tutan kelepçeleri Peristaltik pompa. Eğri makas ve forseps (şekil 1) hazırlayın.
- Tarih veya bitişik su banyosu, 20 x 20 cm parça (şekil 1) kesme bir emici underpad ile overlaid bir fırın tepsisine (yaklaşık 38 x 26 cm) ile bir köpük yastık (50 mL konik raf) ayarlayın.
- Yakın maskeleme bandı (5-8 cm) bir parça yerleştirin. 20 cm polyester dikiş ipliği Yani kesme ve kullanıma hazır yakın yerleştirin. Plastik bir kateter geri çekilebilir bir iğne ile (7 mm x 19 mm, şekil 1) elde edilir.
- Züccaciye Mağazaları hazırlanması
- Kelepçeler kullanılarak, yer ve hareketsiz bir 1 L şişesi 200 mL 1 x PBS çözüm içine gidiş iki 1 mL Pipetler vardır bir tıpa ile içeren su banyosu. Lastik Mantar devridaim sıvı bir kapalı devre izin vermek için çentikli.
- Başka bir kelepçe ile tampon 2 45 mL sıvı sıvı kalır ve balonun oksijen darbeler alt şişeye ve diğer biri iki 1 mL Pipetler, vardır bir tıpa ile birlikte içeren bir 125 mL şişe yerleştirin.
Not: Her pipet Stoppers kolay tüp geçiş için sonu iliştirilmiş adaptörü çıkarın hızlı olacaktır. Oksijen yavaşça sıvı içinde dalmış değil tıpa pipet ile her iki şişe içine akan. - Steril crystallizing tabağı kenara.
2. hayvan yordamı
- PBS ve tampon 2 çözümleri 42 ° c su banyosunda ısınmak ve PBS için en az 20 mL/dak tüp sıvı hatları sıcak tutmak için bir kapalı devre içinde dolaşımda. Aşırı herhangi bir boru içinde kalmak için su banyosu bırakın 42 ° C'ye mümkün olduğunca yakın Erkek sonuna 1 L şişe içeren PBS içine tüp drenaj.
- Bir pamuk topağı üzerinde emici underpad yerleştirin ve yaklaşık 2 mL (polietilen hangi isoflurane buharlaşma hızı azalır glikol içinde 200 kadar yapılmış) % 30 isoflurane transfer pipet kullanarak pamuk topu ekleyin.
- Fareyi kuyruğundan almak, crystallizing yemekleri taşıyıcıya yerleştirin ve fare anestezi nefes için küçük bir yerde olması çanak pamuk üzerine hızla devirmek. Fare nefes oranını gözlemlemek ve fare etkili anestezi altında olduğundan emin olun.
Not: Solunum hızı daha yavaş ve daha derin, olmalıdır kuyruk sarkık ve pençeleri yanıt vermeyen çimdik testi altında anestezi; IACUC kurallar ek ayrıntılar için bkz. - Süre (1-2 dakika sürer) anestezi altında fare oluyor, bir 10 mL şırınga varil pistonu çekerek ve küçük bir pamuk ekleme hazırlamak. Pamuk varil içinde 1-2 mL % 30 isoflurane transfer pipet ile eklemek ve bilinçsiz olmak için fare beklerken varil bir masada aşağı open-end yerleştirin.
- Hızlı bir şekilde crystallizing çanak, fare sırtını çevirme alıp şırınga varil burnu yerleştirin. İki kez kontrol solunum hızı, ayak çimdik ve sarkık kuyruk. Ayak çimdik ve sarkık kuyruk için herhangi bir yanıt fare değil tam anestezi altında olduğunu gösterir. Şırınga varil bilinçsizlik korumak için burun üzerinde tutun.
- Belgili tanımlık paws sırtüstü pozisyonda uzanmış uzuvları ile fare aracılığıyla yer başparmak tacks. Karın ve göğüs kafesi % 70 isopropanol veya etanol ile ıslak.
- Bir elinde düz Forseps ile karın yakın cilt kaldırın. Diğer elinde makasla kesilmiş çadır cilt ve karın zarını. Belgili tanımlık kesme yatay veya çadır cilt Bankası arasında olmalıdır. Gut erişim kazanmak için tüm cilt ve Periton katmanından kesmek emin olun. Yanal göğüs kafesi kadar karın çevresinde her iki tarafta herhangi bir organ nicking olmadan kesti.
- Cilt kapağı kesim tarafından daha düşük göğüs kafesi kesilmiş. Bağırsak portal ven ortaya çıkarmak için forseps arkasına ile sağa doğru ilerleyin.
Not: hayvandan kanama en az olmalıdır; hayvan hala nefes ve derin anestezi altında. - Kapalı eğri forseps karaciğer ve üstün pancreaticoduodenal ven (şekil 3 ok) arasında portal ven altına yerleştirin.
- Forseps portal ven iken altında açın. İş parçacığı tutun ve portal ven ortalanacak şekilde dikkatlice çekin. Aşağı cinching olmadan portal ven çevresinde bir yukarıdan aşağı düğüm kravat.
- Portal ven altında kıvrımlı pensler yerleştirin ve yavaşça ven (şekil 4A) düzeltmek için fare kuyruğu doğru çekin.
- Diğer elinde sonda ile iğne eğimi yukarı doğru ve alt kısmında forseps (şekil 4B) yakınındaki portal ven paralel yerleştirin.
- Yavaşça ven iğne (şekil 4C) ile delik. İğneyi konik ven Lümen içinde olduğundan emin olun. Yaylı iğne geri çekmek ve eğimi Venöz dallı alandır kadar damar yoluyla polimer kateter itmeye devam edin. Karaciğer içinde bu. Kateter doğru şekilde yerleştirilmiş olması durumunda, kan akışının arka görünür hale gelir. (Şekil 4D).
- Yukarıdan aşağı düğüm sıkın ve stabilize yardımcı olmak için kateter üzerinde aşağı çekin. Hemen 20 mL/dk dan Pompa hızı 4 mL/dk geri çevirmek ve drenaj için başka bir büyük kan damarı kesilmiş. En iyi sonuçlar için aorta abdominalis kesti.
- Erkek kadın sonuna kadar kateter (şekil 5A) boru sonuna yerleştirin. Başında hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. Kateter da karaciğer içine veya damar dışına itti değil dikkatli olun. Damar dışına geri akış önlemeye yardımcı olur ve doğru konumda (şekil 5B, C) kateter tutmanıza yardımcı olur iş parçacığı yerleşimini temel, değildir.
- Boru underpad üzerine immobilize için maskeleme bandı kullanın. Bir kaç kez karaciğer şişirmek için atık kan damarı sıkmak için düz forseps kullanın tüm kan (şekil 5D) drene emin olmak için.
Not: Standart laboratuvar bant işe yaramayabilir; Ancak, maskeleme bandı için ıslak koşullarda bile underpad takılıp kalır.
3. karaciğer perfüzyon
- Karaciğer PBS ile kızarma, Collagenase tip IV yaklaşık 24 mg ölçmek ve tampon 2 45 mL su banyosunda içeren şişeye koyun. Böylece collagenase tam olarak feshedilmiştir sıvı şişeye girdap ve böylece şişeye sıvı içeren bölümünü tamamen suda batık şişeye geri kelepçe içinde yer emin olun.
- PBS ile aktarılmadan olarak karaciğer renk değişikliği gözlemlemek. Çıkış boru 1 L şişesi 125 mL şişe için değiştirin. Karaciğer akmaya hava kabarcıkları izin vermez.
- Perfüzyon arabellek karaciğer ulaştıktan sonra kısa bir süre sıkı atık damar bazı basınç gemi içinde oluşturmak ve bu sıvının bütün karaciğer lobları doldurmak izin vermek için sıkmak. Bu karaciğer (Glisson'ın kapsül) çevreleyen ince bağ dokusu patlama ve perfüzyon veya karaciğer kapiller yatak içinde sıvı yok gibi drenaj çok uzun kesmemeye dikkat edin.
- Tampon 2 collagenase tüm 45 mL akan kadar doku ile karaciğer sıvı ile izin verir.
Not: Eğer başarılı olursa, Glisson'ın kapsül ayrılmalıdır parankimi ya da karaciğer dokusu ve karaciğer kendini amorf görüntülenmesi gerekir. - Diğer crystallizing yemek için tampon 1 yaklaşık 10 mL ekleyin ve yanındaki fareyi getirin.
- Kateter kaldırmak ve pompa devre dışı.
- Düz forseps ve makas ile karaciğer fare kesmek. Collagenase sindirim çok etkili olsaydı, el üstünde fare karaciğer kepçe ve tampon 1 yeri temiz, steril bir kaşık alabilir gerekli olabilir.
4. Hepatosit arıtma
Not: Hücreleri manipülasyon bir steril doku kültürü Hood kontaminasyon hücreleri tüm sonraki adımlar kültürlü olmak istiyorsak sınırlamak için yapılmaktadır.
- Steril tekniği kullanarak, karaciğer Forseps ile kapmak ve karaciğer hücrelerinden hafifçe çalkalanır. Altını üstüne getirin veya geri çekme Glisson'ın kapsül: hücreleri karaciğer sarsılmış gibi arabellek opak olacaktır.
- Hücre çözümü yerleştirilmiş 100 µm filtre ile 50 mL konik dökün.
- Daha fazla tampon 1 karaciğer kalıntıları ekleyin ve hücreleri titremeye devam edin. Karaciğer hücreleri veya ne zaman karaciğer sindirilmemiş bölümlerini artık hücreleri verimi değil yoksun görünene kadar devam edin.
- Hücresel sıvı başka bir 50 mL 40 µm filtre içeren konik dökün.
- Konik bir sallanan kova Open End 100 x g de 3 dk santrifüj kapasitesi.
Not: Bu hücre Pelet çıkarmak en fazla fren kullanmayın. Tüm kalan Santrifüjü adımları 4 ° C'de için yeterli olan %80, fren kullanın - (Hangi içermek NPCs ve ölü tetkikine) süpernatant temiz konik dökün ve buz üzerinde yerleştirin. Bu Pelet bağlılık gözlemlemek için bir hareket yapılır emin olun.
- Pelet tampon 1 40 mL resuspend. 4.5 ve 4,6 adımları yineleyin. Pelet tampon 3 40 mL resuspend. 4.5 ve 4,6 adımları iki kez tekrarlayın.
- Arıtılmış tetkikine sıcak DMEM + 10 resuspend % FBS + 2 x penisilin-streptomisin (kalem/Strep).
- Hücreleri kollajen kaplı Tabaklarda kültürlü, 1 h için bağlı kalmak izin ve Değiştir medya en az bir kez bu kadar herhangi bir yeni doğmakta olan bakteriyel kirletici engeller.
- Onları % 0.001 Asetik asit için en az 1 h 37 ° C'de % 0.05 kollajen ile kuluçka ve 1 x PBS ile yıkama tarafından kolajen kaplı levha olun.
- Hepatosit canlılığı düşüktür ve arıtılmış yüksek uygun tetkikine elde sonra Kreamer ve ark10' dan adapte aşağıdaki iletişim kuralını kullanmak için bir istek varsa.
- Mix 9 birimleri PVP çözüm (Percoll, % 23 w/w çözüm su ve 15-30 nm kolloidal silika partikülleri polyvinylpyrrolidone yoğunluğu Santrifüjü için kaplı) ve ISO ozmotik PVP çözümünü (SIP) yapmak için 10 x HBSS 1 hacmi.
- Bir steril 50 4 ° C'de 2 aya kadar bu koşullarda depolanan ml konik SIP 24 mL ekleyin
- 5-10 × 106 hücre/ml kültür orta adım 4,8 not ettiğiniz biri gibi ile Hepatosit konsantrasyon ayarlayın.
- Hücre süspansiyon 25 mL her 24 mL konik içeren SIP ve nazik INVERSION tarafından karıştırın. Bu çözüm 1.06 g/mL yoğunluğudur.
- Konik, 50 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
- SIP ve flocculant Aspire edin ve HBSS hücrelerde resuspend.
- Santrifüjü 50 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tarafından hücreleri yıkama
- Adımı 4.10.6 bir kez daha yineleyin ve sonra hücre büyüme orta resuspend.
5. sn arıtma
- Adım 4.6 supernatants hücrelerde tüpler 163 x g 10 dk. atmak için de iplik tüpler üzerinden supernatants cips ve tüm hücre pellet RPMI 5 ml serum olmadan resuspend ve onları birlikte bir tüpte Havuzu.
- Bir kez tüm pellets havuzlu, RPMI 35 mL son hacim için ekleyin.
- Havuza alınan santrifüj kapasitesi 25 x g, konik bir temiz 50 ml konik buzda NPCs içeren bu medya RPMI en iyi 25 mL 25 mL pipet ve yer ile 3 dk. dikkatle Aspire için.
- Taze RPMI 25 mL tüp geri ekleyin ve Pelet resuspend.
- 5.3 ikinci yıkama ve havuzu süpernatant için adımları yineleyin. Kalan 10 mL medya ve Pelet (çoğunlukla ölü tetkikine Pelet oluşur) atmak. Havuza alınan süpernatant vasıl 163 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.
- Santrifüjü sırasında PVP çözüm degradeler 50 ml konik hazırlayın.
- 15 mL % 50 PVP çözeltisi 50 ml konik Percoll fırlatma hızını yavaşlatmak için ayarla bir pipettor ile overlaid % 25 20 mL ardından ekleyin. Bu saniye sürdü ve KCs Santrifüjü sonra nerede toplamak olduğu gibi iki kat demarcates 15 mL işareti bir kırılma satırında gözlemlemek emin olun.
- Soğuk RPMI adım 5.5 10 mL içinde daha önce pelleted hücreleri resuspend ve onları PVP çözüm degrade yerleşimi. İki kat arasında net bir sınır korumak emin olun. Degrade vasıl 805 x g 20 dk santrifüj kapasitesi % 50 ayarlamak bir fren.
- Tüp 20 mL işaretine yukarıdan aşağıya doğru yönde Aspire edin ve bu malzeme atın. 5 mL transfer pipet ile saniye sürdü ve %25/50 arayüzü bulunmaktadır KCs toplamak. Bu ölü tetkikine olarak hücreleri herhangi bir kahverengi kümeleri atmak.
- Hücreleri bir 50 mL konik yerleştirin ve RPMI PVP çözüm sulandırmak için 50 mL işareti kadar ekleyin. 200 x g 10 dk için de % 80 fren ile santrifüj kapasitesi.
- Aspire edin ve süpernatant atın ve sıcak RPMI 12 ml konik koni kapalı yıkarken Pelet resuspend.
- Saniye KCs süpernatant bir polistiren Petri kabına koyarak ayırın ve oksijen doku kültürü kuluçka oda sıcaklığında 8 min için kuluçkaya.
- Medya bir 25 mL pipet ve durulama KCs süre kalan saniye toplamak için en düşük hızda ayarla pipettor ile aynı medya ile plaka uygun plaka ile Aspire edin.
- Saniye 200 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve resuspend RPMI + % 5 içinde FBS + kalem/Strep. O zaman titresi hücreleri ve kolajen kaplı kültür yemekleri yerde.
Representative Results
Karaciğer perfüzyon ve arıtma/zenginleştirme tetkikine ve saniye bir gösteri ve rafine bir yöntem burada ayrıntılı ipuçları için optimum hücre arıtma/zenginleştirme başvurulan bunda derlenmiş diğer basılı raporlara benzer sağlayan sunulur 5gözden geçirin. Başarı için hücresel arıtma belirleyen önemli adımlar rota ve teknik ayrıntıları collagenase perfüzyon yordam bulunur ve bu protokol için özetlenen. Kurulum aparatı için oldukça basit ve düşük maliyetli standart Laboratuar donanımları, yayımlanmış11 (şekil 1) olmuştur diğer sistemlerin aksine ile. Bu kurulum, fare tutan tepsi su banyosu bazı karaciğer içinde Ventriküler sıvı sıcaklığını korumak için su banyosu içinde aşırı boru ile oturuyor. Burada gösterildiği gibi cihazlar sıçan karaciğer perfüzyon12 (Şekil 2) için biraz farklı bir geometri ile fareler, yanı sıra fareler için kullanılabilir.
Bu yordam, karaciğer portal ven yerine (Bu başka bir popüler perfüzyon rota) vena kava yoluyla karın içinde erişim kolaylığı nedeniyle derin ve damar doğrudan karaciğer beslemeleri. Görüntüleyiciyi portal ven perfusate kısa devre birkaç küçük dalı vardır ve bu dallar en iyi başarı13 (şekil 3) geçmiş kateter yerleştirilmesi gerektiğini bilmeniz gerekir. Portal ven tanımlanır sonra karaciğer ve üstün duodenal pankreas ven arasında bir cerrahi dikiş veya portal ven altında polyester iplik çizmek için eğri forseps kullanılmaz. Forseps pozitif kan basıncı (şekil 4A) altında olan portal ven dışarı düzeltmek için de kullanılır. İğneyi kateter içinde paralel ve damar (şekil 4B) yanında yer almalıdır ve eğimi yavaşça ven (şekil 4C) Lümen eklenmesi gereken. Uygun yerleştirme kateter görünen kan ile belirtilir. İğne geri çektiği bir kez kateter onu bağladı bir iplik ile stabilize ve kan basıncı kan kadar ile kateter zorlar. Bu kan (şekil 4D) dökülmelere önce kateter pompa boru bağlı olması tavsiye edilir. Pompa boru bağlantı kurulduktan sonra hemen vena kava veya aorta abdominalis kan/sıvı drenaj (şekil 5A) gibi büyük bir kan damarı kesilmiş. Karın kan birikmesi perfüzyon işleminin görselleştirmek zorlaştırır ve kan hücre arıtma (şekil 5 taşımak gibi fare için yeterli drenaj, karın duvarı tarafına kesmek genellikle gereklidir B). karaciğer sıvı PBS başladıktan sonra karaciğer kan (şekil 5C) yokluğu ile beyazlatmak. Eğer sadece birkaç LOB beyazlatmak, olası neden kateter yerleştirilen çok ileri karaciğer içinde ve yavaş yavaş yedeklenmesi gerekir olmasıdır. Kateter yerleştirme onayladıktan sonra suya dayanıklı maskeleme bandı yerde boru güvenliğini sağlamak için kullanın. Genel laboratuvar bant genellikle yeterli değildir. Kateterin uygun yerleştirme onaylamak için kesme damar drenaj ateşkes ve karaciğer içindeki artış basıncı gözlemlemek için sıkmak. Bunu kan karaciğer (şekil 5D) dışarı fışkırma yardımcı. Collagenase çözüm Başlangıçta tüm LOB collagenase için maruz kalır emin olmak için karaciğer içine girdiğinde Ayrıca yapılması gerekir. Collagenase sonra çözüm biterse, iyi collagenase sindirim tarafından parankimi Glisson'ın kapsül, ayrılık göstergesidir.
Genel yordam hücresel arıtma için şekil 6 ' da belirtilen ve hangi tetkikine erken bölümündeki yordamı sırasında düşük hızlı hasat Şekil 7 döner ve 4 BSA içeren arabellekleri (şekil 8 yıkar sonra çok saf ). Saniye KCs ile ortak bir PVP degrade (Şekil 9A) saflaştırılmış ve kolajen kaplı polistiren Petri kabına tarih seçici yapışma tarafından ayrılmış. Bu yöntemi kullanarak saniye saflık 83-%90 saf ve collagenase sindirim (Şekil 9B) genel etkinliğini büyük ölçüde bağlıdır. Işık kullanarak nicel ölçüleri mikroskobu (hepatositler ve saniye ayırt edici özellikleri diğer hücrelerden gibi) göstermek bu temsili bir hazırlık olarak, hepatositlerin neredeyse % 100 saf ve saniye vardır biraz üzerinde % 89 saf (Tablo 1). Alternatif olarak, her ne kadar bu iletişim kuralı kapsamý dýþýndadýr saniye daha yüksek bir zenginlik manyetik sütun ayrılıktan sonra PVP degrade tarafından alınabilir. Meyer ve ark. saniye ve KCs manyetik ayırma hakkında daha fazla bilgi bulunabilir 9 ve Liu vd. 14 bu canlılığı hepatositler hızla yeterince sindirilmiş bir karaciğerde azalır, ancak bu gerekli true için NPCs. yeterince sindirilir karaciğerleri aynı zamanda tamamen değil daha hücresel enkaz üretmek değil unutulmamalıdır Santrifüjü adımda ortadan kaldırılmıştır.
Resim 1 : Perfüzyon paketinin şematik gösterim. Şişeler (gösterilmez); kelepçeler tarafından yerinde tutulur içeren sıvı 1 L şişesi 125 mL şişe için işlem sırasında takas edilir tüp kırmızı noktalı çizgiyle temsil edilir. Dikkat, oksijen besleme şişe çözümlerinde içine doğrudan kabarcık değil. Mantarlar da kapalı devre sıvı akış içinde çentik eklenen boru ile izin vermek için çentikli. Boru ve tüp içinde tüm hava dışarı atmak için Isınma sırasında bu önemlidir. Hava taşma payı Tygon boru ve hızlı açık için çimdik kelepçeler ve sistem kapatılması bağlı T Bağlayıcısı oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Fare karaciğer perfüzyon sırasında perfüzyon Süiti. Tepsiyi fare ile su banyosu köşesine yerleştirilir. Bu zaten ısınma sırasında oksijenli gibi oksijen collagenase eriyik--dan kesilir. Öğenin yerini çoğu A) oksijen çizgiler, PBS, collagenase, D) pompa, pompa E) denetimleri, F) kabarcık tuzak, G) sıvı hattı pompa ve fare balonun çalışan ile tampon 2 içeren C) 125 mL şişe içeren B) 1 L cep şişesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Fare karın damarlara görüntüsünü. Kateterin ekleme sadece portal ven (yeşil nokta) geliyor mide ve pankreas ven kavşak aşağıda olmalı ve ucu sol ve sağ hepatik portal bir çatal karaciğer lobları ana oluşturan damarları (sarı nokta) yakınında yer almalıdır. Bir kez doğru yerleşim elde, kateter basit bir yukarıdan aşağı düğüm kullanarak iş parçacığıyla stabilize. K böbrek, L = karaciğer, SI = ince bağırsak =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Kateter yerleştirme portal ven. (A)forseps kan şişkinliği portal ven, emin olmak için ve damar kateter yerleştirme için dışarı düzeltmek için kullanılır. (B) kateter eğimi ile portal ven paralel olarak dizilmiş. (C) kateter içinde iğne eğimi damar, damar yoluyla eklenir. (D) iğne kateterin geri çekildi ve kan olacak geri tepme kateter aracılığıyla forseps İpucu tarafından belirtildiği gibi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Uygun karaciğer perfüzyon. (Kateter yerleştirme, kateter kadın radarı sonu (1 mL şırıngadan kesim) erkek radarı sonuna pompa boru hattır sonraA). (Fare yan makas ile dilimleme tarafından karından kesim bir büyük azalan kan damarları, kan ve PBS süzülmüş sonraB). (C) karaciğer kan sifonu çektim ve kabarma Forseps ile sıkma kapalı kesme kan damarı olacaktır zaman baskı altında (D) Haşlamak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Hepatosit arıtma ve NPC yalıtım şematik anahat. Santrifüjü adımları çoğunu canlı ve ölü tetkikine parenkima olmayan hücrelerden kaldırma hedefliyoruz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Sn zenginleştirme ve arıtma şematik anahat. NPCs tarafından sn ayrılık kısa yapışma tarafından standart polistiren tabakta takip PVP degrade ayrılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 : Hepatositlerin arıtılmış. Hepatositlerin kaplı kollajen doku kültürü Tabaklarda kaplama DMEM + %8 FBS + kalem/Strep ile ve 6 h resim koleksiyonu tarafından takip için mikroskop 400 X tarafından inkübe edildi. Bar eşittir 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9 : Sn arıtma. (A)saniye sürdü ve KCs %25/50 PVP arabiriminden (sarı ok) toplanmıştır ve serum-Alerjik orta ile yıkanır. (B) saniye standart Petri yemekler tarih seçici yapışma KCs ayrılmış, yıkanmış ve kolajen kaplı doku kültürü yemekleri RPMI + % 5 kaplama FBS. Görüntüleri bir ters EVOS mikroskobu 400 X tarafından alındı. Bar eşittir 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10 : Fare karaciğer anatomi elektron mikroskobu tarama. Bir fare karaciğer periosteum ile 1 mL/dk'ya 4 dk. hızında sabitleştirici (100 mM sodyum cacodylate, 12 mL % 25 oxazolidin, 15.6 mL % 16 paraformaldehyde, 2.65 mM Kalsiyum klorür, 180.2 mM sukroz, 100 mL solüsyon içinde karışık) tarafından izlenen PBS doku dilimlenmiş ve elektron mikroskobu tarama için hazır. Görüntüleri 10'da, bir alan emisyon SEM toplanan 000 X. Sarı oklar tetkikine arasında microvilli gösterir. Bar eşittir 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 11 : Ölü canlı tetkikine karşı görselleştirme. Tampon 1 ile 2 yıkar sonra pelleted tetkikine canlı/ölü oranı için göz tarafından değerlendirildi. Daha hafif bir Pelet (solda) en az yarım tetkikine ölü olduğunu gösterir. Sağdaki daha koyu Pelet daha sıkıca tüp altına pelleted ve daha--dan %90 canlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Tablo 1: Hücre arıtma | ||
| Hücre tipi | % hedef hücreleri | % diğer hücreleri |
| Hepatosit | 99 | 1 |
| Sinsusoidal endotel hücreleri | 89.1 | 10,9 |
Tablo 1: Hücre saflık ışık mikroskobu tarafından değerlendirilmesi.
Discussion
Bu protokol kullanılabilir durumdadır ve bu başarı bu yordamdaki yüksek orandaki kullanıcı gerçekleştirecek araçları vurgulayan daha basit. Başarılı bir perfüzyon Primer hücre ile çalışırken herhangi bir aşağı akım uygulama için temel olabilir.
Başarısını belirlemek birkaç kritik adım yordam vardır. İlk olarak, portal ven içinde kateter ucu yerleşimini doğru olması gerekir. Eğer çok ileri karaciğer içinde yerleştirilmişse periosteum sadece küçük loblar. Ucu sadece sağ ve sol dallarında portal ven olmalıdır. Bir iğne üzerinde bir polimer kompozit kateter kullanmanın avantajı iğne barb daha bir kateter daha perfüzyon sırasında damar gözyaşı olasılığı olmasıdır. İkinci olarak, collagenase kalite ve miktar karaciğer sindirim verimliliğini belirlemek. Bu yordamda, önceden nitelikli collagenase tip 4 kullanıldı ve denetlesinler için collagenase etkinliği 900 IU büyük ise 0,5 mg/mL tampon 2, resuspended.
Collagenase perfüzyon sonunda, karaciğer kahverengi renk için biraz karanlık bir tan bulundurmalısınız. Açık kahverengi renk ise, hepatositlerin çoğu ölü. Karaciğer otelde fare kesmek ayrı düşen. En iyi koşullarda, karaciğer küçük bir kaşık ile fare vücut boşluğuna dışarı scooped. Bu durumda karaciğerleri her zaman çok yüksek hücre canlılık verir. Karaciğer ayıklama sırasında hala sağlam ise hücreler ayrı, sallamak için çok çaba alır veya kuvvet tetkikine filtreler aracılığıyla taşımak için gerekli bir sürü ise, hepatositlerin daha düşük bir canlılık olacaktır. Hepatositlerin onları çok yüksek yüzey alanı (şekil 10) olmasını sağlayan microvilli ile kaplıdır. Hücre-hücre kavşak tetkikine arasında eksik sindirim korur ve mekanik kesme Plazma zarı parçalara ayıracak. Situ perfüzyon collagenase ile hücreleri parçalayın ve yüksek canlılık korumak için en iyi yöntemdir. Şekil 11' de, iki Hepatosit hazırlıkları hangi hücrenin granül yapılır karşılaştırıldığında birkaç yıkar sonra tampon 1. Sol Pelet hafiftir ve yaklaşık % 50 bir hücre canlılığı içerir. Sağdaki Pelet koyu olup, bir canlılık % 92. Sıvı 50 mL konik dökülür, benzer şekilde, daha koyu Pelet sıvı kapalı dökülür gibi hangi tüp Slayt hafif Pelet aksine tüp içinde sabit olur. Karaciğer skleroz yüksek düzeyi vardır alt hücre canlılığı veya verimsiz perfusions ortaya çıkabilir.
Canlı tetkikine ölü tetkikine daha yüksek yoğunluklu beri Santrifüjü yordamlar uygun tetkikine15dakika içinde son derece saf bir hazırlık neden olur. Eğer (koşullar suboptimal olduğunda hangi sıklıkta oluşur) ölü tetkikine, önemli miktarda canlı hücreler daha olması zenginleştirilmiş ve ölü hücreleri PVP degradeler kullanarak ayrılmış. Ayrıca, canlı tetkikine ölü tetkikine daha hızlı cips beri Pelet en iyi 3rd aspirasyon Pelet ölü hücreleri canlı oranı da artacaktır. Bu işlemleri hızlı ve kolay yöntemler ayırmak için ölü tetkikine yaşamak ve hücre gerektiğinde enkaz10,16. Örnek değerli ve bir kaç milyon hücre deney için gerekli olan sadece bu özellikle yararlıdır.
Sonuç olarak, hepatositlerin ve saniye karaciğer hasat için kolay ve etkin bir yöntem bu. Cari fiyatlarla tüm reaktifler ve tek kullanımlık dahil olmak üzere bu yordamı gerçekleştirme hazırlık küçük 75 YTL maliyetidir. Birden çok fareler istenirse, Hepatosit arıtma ile devam etmek ve tüm fareler işlenene kadar NPC kesir buz üzerinde tutmak en iyisidir. NPCs buz en az 5 h için genellikle sabit, ama daha uzun zaman bu laboratuvarda sınanmamıştır.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Finansman kısmen NIH grant R01HL130864 dan tarafından sağlanır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
| T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
| Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
| Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
| Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
| Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
| glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
| curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
| sterlized spoon | Home supply store | ||
| Cotton ball(s) | Home supply store | ||
| Polyester sewing thread | Home supply store | ||
| Masking tape | Home supply store | ||
| thumb tacks | Home supply store | ||
| styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
| cookie/baking sheet | Home supply store | ||
| Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
| 19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
| BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
| Crystallizing dishes 100x50 | VWR | 89000-290 | |
| Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
| graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
| EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
| EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
| Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
| Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
| Reagents | |||
| Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
| Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
| KCl | 0.5 | 6.7 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
| KCl | 0.5 | 6.71 | |
| CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
| HEPES | 24 | 100 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
| Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.35 | 4.7 | |
| MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
| CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.2 | 2.7 | |
| Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
| KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
| Other reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | Gibco | 11965118 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | |||
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
| LSEC medium | |||
| RPMI | Gibco | 11875119 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
- Edstrom, S., Ekman, L., Ternell, M., Lundholm, K. Isolation of mouse liver cells: perfusion technique and metabolic evaluation. Eur Surg Res. 15 (2), 97-102 (1983).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Buhler, L. Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Sies, H. The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems. Methods Enzymol. 52, 48-59 (1978).
- Smedsrod, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. Munin open research archive. , University of Tromsø. 1-10 (2012).
- Smedsrod, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstrom, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell Tissue Res. 241 (3), 639-649 (1985).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Exp Cell Res. 349 (2), 291-301 (2016).
- Kreamer, B. L., et al. Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (4), 201-211 (1986).
- Meijer, D. K., Keulemans, K., Mulder, G. J. Isolated perfused rat liver technique. Methods Enzymol. 77, 81-94 (1981).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. J Vis Exp. (57), e3138 (2011).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. 2008 edn (1965).
- Liu, J., et al. Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells. Methods Mol Biol. 1540, 249-258 (2017).
- Knobeloch, D. E., Ehnert, S., Schyschka, L., Buchler, P., Schoenberg, M., Kleeff, J., Thasler, W. E., Nussler, N. C., Godoy, P., Hengstler, J., Nussler, A. K. Human Hepatocytes: Isolation, Culture, and Quality Procedures. Methods in Molecular Biology. 806, 99-120 (2012).
- Clarke, B. L., Weigel, P. H. Recycling of the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. ATP depletion blocks receptor recycling but not a single round of endocytosis. J Biol Chem. 260 (1), 128-133 (1985).
