Summary
本工作提出了一种通过细菌及其相应的纳米粒子制备钨酸钠和钼酸钠微胶囊的协议。
Abstract
我们提出了一种方法, 细菌矿物排泄 (BME), 合成两种微胶囊, 钨酸钠和钼酸钠, 和两个金属氧化物的相应纳米粒子-前者是小到22纳米和后者 15 nm。我们喂养了两株细菌,希瓦藻类和Pandoraea sp., 各种浓度的钨酸盐或钼酸离子。对钨酸和钼酸盐的浓度进行了调整, 使微胶囊的长度和直径比不同。我们发现, 浓度越高, 纳米粒子越小。纳米颗粒以三的长径比: 10:1、3:1 和 1:1, 分别以低浓度、中等浓度和高浓度的细菌为食。采用扫描电子微球 (SEM) 对空心微胶囊进行了图像分析。通过 x-射线衍射 (XRD) 验证了晶体结构, 钼酸盐微胶囊的晶体结构为 na2MoO4 , 钨酸微胶囊为 na2窝4与 na2W2O7。这些合成都是在近环境条件下完成的。
Introduction
金属氧化物纳米微粒被开发为药物传递1, 构造人工骨骼2, 非均相催化3, 场发射4,5, 太阳能电池6, 气体传感器7, 以及锂电池8。在实际应用中, 纳米晶及其显微结构的力学强度是至关重要的。在微结构中, 空心壳体可用于创建轻质、机械坚固的材料9。在空心壳体结构中, 已知球形形状比椭球形更坚硬;后者具有比前1011更大的长径比。本工作介绍了一种在环境条件下用非毒性方法合成球形微胶囊的协议, 与其他方法 (包括模板合成方法12) 形成了对比,超声波喷雾辅助合成方法13和水热法14。一些替代方法需要模板12, 一些温度高达500° c13, 一些高压14。至于所产生的结构, 采用酵母模板的模板合成方法带来了一个核心壳结构15, 而不是一个单一的墙, 而使用大肠杆菌模板的一个结构产生长径比为 1.7: 0.8, 而不是球形。16。
在这项工作中, 我们利用细菌代谢, 在环境条件下, 用单壁和球形形状制作金属氧化物微胶囊。在细菌酵解中, 代谢碳源的化学过程, 如葡萄糖和乳糖, 碳源被认为是其中产生的还原力的来源。我们通过调节碳源的浓度来控制细菌代谢, 以达到预期的目的。这种方法对环境友好, 使用无毒剂, 耗电量更少。最后, 这种方法可以简单地通过增加肉汤的体积来批量生产微胶囊。
在该方法之前, 还有另外两种利用细菌代谢来制造矿物质的方法: 生物诱导矿化 (比)17和生物控制矿化 ()18。这两种方法都不能用于制备钨酸钠和钨酸盐微胶囊, 如我们的工艺, 被指定为细菌矿物排泄 (BME)19。在这个实验中, 微胶囊的形状可以被控制为有一个长度-直径比从10:1 到 1:1, 和大小的纳米颗粒形成的壳可以调整范围从 15 nm 到 110 nm。
Protocol
注意: 使用乳胶手套、防护眼镜和实验室工作服进行实验。使用生物安全柜时, 打开橱柜风扇, 使柜门半闭。
1. 玻璃微珠的制备
- 将100个直径3毫米的玻璃珠放在一个100毫升的实验室瓶子里, 然后把它紧紧地盖住。
- 高压釜的内容在120° c 为10分钟。
- 让瓶子冷却到室温, 然后把它放在生物安全柜里。
2. 性汤的制备 (LB)
- 在500毫升的实验室瓶中溶解8克的 LB-蓝诺克斯粉, 400 毫升的水。
- 用 PTFE 磁性搅拌棒搅拌20分钟, 然后将其盖紧。
- 高压釜的内容在120° c 为10分钟。
- 把溶液冷却到室温, 放在生物安全柜里。
- 使用吸管, 分的肉汤到八15毫升离心管在生物安全柜 (每12.5 毫升)。
- 分将剩余的肉汤放入生物安全柜中的三100毫升的实验室瓶子中 (每瓶100毫升)。把三瓶瓶盖拧紧。把它们放在生物安全柜里
3.希瓦藻类的培养
- 使用深冻超低温保存的菌株。
- 在生物安全柜中, 用不锈钢刮刀从冷冻管中取出1毫升的冷冻材料, 并将其放入3.5 步中制备的离心管中。
- 在37° c 孵化箱中孵育24小时的培养基。
4. 用琼脂制作发酵皿
- 用100毫升的水将两片 LB-蓝诺克斯 (汤与琼脂) 溶入一个100毫升的实验室瓶子。
- 用 PTFE 磁性搅拌棒搅拌20分钟, 然后将其紧紧地盖住。
- 高压釜的内容在120° c 为10分钟。
- 在生物安全柜中, 用手分100毫升的溶液放入4培养皿中, 确保每一个接收 ~ 25 毫升。让溶液冷却到室温。
5. 单克隆细菌的制备
- 在生物安全柜中, 分别标明步骤2.6、#1、#2 和 #3 的三瓶。
- 移液0.1 毫升的结果细菌悬浮在步骤3.3 到瓶子 #1。瓶盖的瓶子和摆动它的手1分钟, 得到一个均匀的解决方案。
- 在步骤5.2 中, 将所合成的细菌液体的0.1 毫升移入瓶子 #2。瓶盖的瓶子和摆动它的手1分钟, 得到一个均匀的解决方案。
- 在步骤5.3 中, 将所合成的细菌液体的0.1 毫升移入瓶子 #3。把瓶子盖上, 用手摇动1分钟以得到一个均匀的溶液。
- 将瓶中的液体 #3 到步骤4.4 中准备的4种培养皿中, 每次使用0.02 毫升。
- 把1.3 步准备好的玻璃珠放入4个培养皿中, 每道4珠。
- 关闭培养皿的盖子, 用手摇动它们1分钟。
- 将培养皿倒置, 在一个37° c 的孵化箱中孵育24小时。
6. 单克隆细菌的增殖
- 在步骤2.5 中提取7根管子。
- 在步骤5.8 中, 用不锈钢刮刀将4培养皿中的单克隆细菌提取出来, 然后分别放入7管中。
- 将7根管子放在37° c 的恒温箱中24小时。
- 用视觉比色法选取最大光散射的一个。
7. 用葡萄糖和盐制备 LB 蓝诺克斯汤
- 将10克的 LB 蓝诺克斯汤、10克氯化钠和10克葡萄糖放入500毫升的实验室瓶中。加入水, 直到体积达到450毫升。
- 搅拌的内容与聚四氟乙烯磁性搅拌棒20分钟。
- 高压釜的内容在120° c 为10分钟。
8. 钨酸钠的制备
- 将16.5 克钨酸钠 Na2窝4. 2H2O 放入一个100毫升的实验室瓶子, 用不锈钢刮刀。加入水, 直到体积达到50毫升。
- 搅拌的内容与聚四氟乙烯磁性搅拌棒20分钟。
- 高压釜的内容在120° c 为10分钟。
- 在生物安全柜中, 用1µm 孔的真空玻纤过滤器获得滤液。
9. 用葡萄糖、盐和钨酸钠制备 LB
- 在生物安全柜中, 将步骤8.4 中的滤液用手倒入步骤7.3 中制备的葡萄糖和盐溶液中。
- 在生物安全柜中, 分用吸管将500毫升的溶液在步骤9.1 中转化为 10 x 50 毫升离心管。
10. 细菌培养
- 在生物安全柜中, 取出步骤6.4 中准备好的液体, 然后用吸管将其分在步骤9.2 中准备的10试管中, 每根管子接收0.05 毫升。
- 孵育10管在一个37° c 孵化器为 120 h。
11. BME 矿物的收获
- Ultrasonicate 10 管在步骤9.2 在20赫与 150 W 为 1 h。
- 离心管在 2025 x g 为 1 h。
- 用吸管除去管内的透明液体, 再加水, 再重复步骤11.1 和11.2 次。
- 用吸管除去管内的透明液体, 加入酒精, 然后在20赫上 ultrasonicate 150 W, 1 小时。
- 离心管在 2025 x g 为 1 h。
- 重复步骤11.4 和11.5 一次
- 用吸管除去管内的透明液体, 收获 BME 矿物;之后, 立即盖上管子而不运行任何干燥过程。
12. 振荡温度与Pandoraea sp和钼酸盐
- 区域性Pandoraea sp的方式与步骤2、3、4、5和6中的希瓦藻类相同。此步骤的结果对应于步骤6.4。
- 用与步骤7、8和9相同的方法使 LB 肉汤与葡萄糖和盐相同, 但步骤7.1 中钨酸钠的16.5 克被替换为12克钼酸钠, Na2MoO4 ·2H2O。此步骤的结果对应于步骤9.2。
- 在生物安全柜中, 取出步骤12.1 中准备好的液体, 然后用吸管将其分在步骤12.2 中准备的10管中, 每个管子接收0.05 毫升。
- 孵育10管在步骤12.3 在振荡温度下为 120 h 在一个相互摇晃的浴, 摆动温度5次在25° c 和37° c 之间, 以每温度持久为 12 h。
Representative Results
图 1显示了真正的球形微胶囊。两株细菌,希瓦藻和Pandoraea sp, 原来都有长度-直径比3:1。为了达到1:1 的长径比, 需要高浓度 (> 100 mM) 的金属 oxyanions。低浓度 (< 5 毫米) 的 oxyanions 可以导致长度到直径比 10:1, 因为那在图 2, 这可能是由于涌入的 oxyanions, 阻断了二元裂变细菌。最后, 为了实现长径比为 3:1, 如图 3所示, 需要一个中等浓度 (约 20 mM) 的 oxyanions。球壳的形成, 长度与直径比为 1:1, 可能是由细菌驱动, 使自己收缩其表面积, 以平衡 oxyanions 的摄入, 同时扩散 oxyanions 通过细胞膜。三的数字显示, 长径比可以通过调整 oxyanions 的浓度来调节到10:1 到1:1。
图 4和图 5显示了不同大小的钼酸钠颗粒: 较小的是 15 nm, 更大的一个 110 nm。请注意, 在图 5中, 在未被粉碎的壳体上, 110 nm 的粒子仍然可以相互链接, 形成多孔壳。更大的一个是通过摆动发酵液的温度5次在25° c 和37° c 之间, 以每温度持续为 12 h。在温度振荡过程中, 不仅可以生产不同尺寸的晶粒, 还能保持微球形结构, 这就意味着我们可以通过控制肉汤的温度, 使不同粒度的微胶囊从 15 nm 到 110 nm。.
图 6显示了在墙的开口旁边有较大颗粒的破墙。壁厚约 22 nm, 较大的颗粒约 40-60 nm。不同的新陈代谢过程可能会导致大小的差异, 而这还没有被确定。
图 1: 具有长径比为1:1 的空心球形壳的 SEM 图像.这种结构是由以葡萄糖为碳源的希瓦藻排出的钨酸钠。经《固体科学与技术》、6 (3)、N3113 (2017) 的许可, 转载。版权所有 2017, 电化学学会。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 长度-直径比为10:1 的空心长丝壳的 SEM 图像.该结构是由以葡萄糖为碳源的Pandoraea sp排出的钼酸钠。经《固体科学与技术》、6 (3)、N3113 (2017) 的许可, 转载。版权所有 2017, 电化学学会。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 具有长度-直径比为3:1 的空心杆形壳体的 SEM 图像.这种结构是由以葡萄糖为碳源的希瓦藻排出的钨酸钠。经《固体科学与技术》、6 (3)、N3113 (2017) 的许可, 转载。版权所有 2017, 电化学学会。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 被粉碎的钼酸钠壳的 SEM 图像, 粒度为 15 nm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 被粉碎和非粉碎的钼酸钠壳的 SEM 图像, 粒度为 110 nm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 具有长度-直径比为1:1 的破空心壳的 SEM 图像.这种结构是由以葡萄糖为碳源的希瓦藻排出的钨酸钠。大小约 40-60 nm 的颗粒悬挂在壳体的旁边的一个大洞, 而外壳本身是由颗粒的大小约 22 nm。经《固体科学与技术》、6 (3)、N3113 (2017) 的许可, 转载。版权所有 2017, 电化学学会。请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
关于实验结果的自洽性, 单克隆细菌的制备和增殖至关重要。本实验, 不同于模板合成实验的15,16, 采用了生物活性革兰阴性菌。为了获得一个单一的壁, 我们选择了原核细菌, 而不是真核细菌, 如酵母15。为了实现一个直径为1:1 的长径比的球形形状, 而不是更大的长径比16, 我们为细菌提供了更高浓度的 oxyanions, 以使它们能够收缩成球形, 制作微胶囊有一个单一的, 圆的, 薄的墙 (< 30 nm)。
由于 BME 主要依靠调节 oxyanions 的浓度来控制细菌的代谢, 因此具有两个局限性。首先, oxyanions 的浓度受溶解度的限制, 但浓度应尽可能高。其次, 大多数细菌的新陈代谢会在45° c 或5° c 以下的温度下停止, 分别是我们实验的上下限。
尽管这两个限制, BME 有很大的潜力, 使金属氧化物材料的实际利益。为了证实这一说法, 我们将尝试用这种方法制作锆微囊和铁微囊--前者是人造骨骼的良好候选材料, 后者用于药物的传递。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国台湾科技部的支持, 其资助人数最多 105-2221-011-008, 还有先进的 Connectek Inc.、台北、台湾、中华民国的合同号 RD Ref. No. 6749 和 Dept. Ref. No. 011 通过国立台湾科技大学光电工程学院毕业。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB(Lennox)broth with agar tablets | Sigma-Aldrich | L7075 | 1 tablet for 50 mL broth with agar |
| LB (Lennox) broth | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | LB (Lennox) powder 1 kg |
| Dextrose anhydrous | Nihon Shiyaku Reagent | PL 78695 | glucose |
| Sodium Tungstate | Nihon Shiyaku Reagent | PL 76050 | Na2WO4 · 2H2O |
| Sodium Molybdate | Nihon Shiyaku Reagent | PL103564 | Na2MoO4 · 2H2O |
| Sodium Chloride | Nihon Shiyaku Reagent | PL 68131 | NaCl |
| Ethanol 99.5% | Acros organics | AC615090040 | CH3CH2OH |
| Water | Made in our university | de-ionlized water | |
| Autoclave | Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei City, Taiwan, ROC | TM-329 | heat to 120 °C for 10 min |
| Centrifuge | Digit System Laboratory System, New Taipei City, Taiwan, ROC | DSC302SD | centrifuge at 2025 x g |
| -80 °C Refrigerator | Panasonic | MDF-U3386S | Use to deep-freeze cryopreserve strain |
| Ultrasonic Homogenizer Sonicator Processor Cell Disruptor | Lenox | UPS-150 | frequency 20 KHz power 150 W |
| Incubator | Customer made | custom made | heat to 40 °C or cool to 18 °C with time cotrol |
| Reciprocal shaking baths | Kingtech Scientific Co., Ltd | WBS-L | |
| Digital Stirring Hot Plate | Corning | #6797-620D | use with PTFE magnetic stirring bar |
| Biosafety cabinet | Zong Yen co., LTD | ZYBH-420 | All bacteria related process are done here |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-6500F | SEM Images |
| 50 mL centrifudge tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 15 mL centrifudge tube | Falcon | 14-959-53A | |
| Laboratory bottle 100 mL | Duran | 21 801 24 5 | |
| Laboratory bottle 500 mL | Duran | 21 801 44 5 | |
| Stainless steel spatula | Chemglass | CG-1981-10 | |
| PTFE Disposable Stir Bars | Fisher | S68066 | |
| Plastic Petri Dishes | Fisher | S33580A | |
| Shewanella algae | Courtesy of author #3 | Courtesy of author #3 | |
| Pandoraea sp. | Courtesy of author #3 | Courtesy of author #3 |
References
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