Summary
Здесь мы представляем протокол производить тахикардия индуцированной кардиомиопатия в свиней. Эта модель представляет собой мощный способ для изучения гемодинамики прогрессивного хронической сердечной недостаточности и эффекты лечения.
Abstract
Для многих экспериментов понять гемодинамики или для проверки эффектов новых методов лечения необходима стабильная и надежная модель хронической сердечной недостаточности. Здесь мы представляем такой модели, тахикардия индуцированной кардиомиопатия, который может быть получен путем быстрого сердца, ходить в свиней.
Один ходить свинца является введено transvenously в полностью анестезированные здоровых свиней, чтобы верхушки правого желудочка и зациклена. Его другом конце дорзально затем туннель в паравертебральных регион. Там он подключен к внутренней изменение сердца кардиостимулятор подразделение, которое затем имплантируется в кармане подкожной.
После 4-8 недель быстрого желудочков ходить на скорости 200-240 ударов/мин осмотр показал признаки тяжелой сердечной недостаточности - тахипноэ, спонтанное синуса тахикардия и усталость. Эхокардиография и Рентген показал дилатация всех камер сердца, излияния и тяжелой систолической дисфункцией. Эти выводы соответствуют хорошо декомпенсированного Дилатационная кардиомиопатия также сохраняются и после прекращения ходить.
Эта модель тахикардия индуцированной кардиомиопатия может использоваться для изучения патофизиологии прогрессивного хронической сердечной недостаточности, особенно гемодинамических изменений, вызванных новых методов лечения, как механические кровообращения поддерживает. Эта методология легко выполнить, и результаты являются надежными и воспроизводимость.
Introduction
Различные новые методы лечения сердечной недостаточности (ВЧ), особенно растущее во всем мире использование механических кровообращения поддерживает и экстракорпоральной мембранной оксигенации (Эмо) в клинической практике, отражающие в доклинические экспериментальные испытания. Основное внимание уделялось гемодинамических изменений, вызванных исследуемого лечения условий, а именно на системного артериального давления1, сократимости миокарда, давление и объем изменений в камерах сердца и сердца работы2,3, приток артериальной крови в системных и периферических артерий, наряду с метаболической компенсации4 - региональные ткани насыщенность, легочной перфузии и анализ газа крови. Другие исследования направлены на долгосрочные последствия кровообращения поддержки5, сопутствующего воспаления или возникновении гемолиза. Все эти виды исследования нужна стабильная biomodel застойной ВЧ.
Большинство опубликованных экспериментов на покинул желудочков (LV) производительность и гемодинамики механических кровообращения поддержки были проведены на экспериментальной модели острого ВЧ2,6,,78 , 9 , 10, или даже на полностью нетронутыми сердца. С другой стороны в клинической практике, механические кровообращения поддерживает часто применяются в состояние декомпенсации кровообращения, которая развивается на основании ранее настоящего хронические болезни сердца. В таких ситуациях механизмов адаптации полностью разработаны и могут играть важную роль в непоследовательности результатов наблюдается согласно «остроты или хронизации» основной болезни сердца11. Таким образом модель стабильной хронической ВЧ может предложить новые идеи в патофизиологических механизмов и гемодинамики. Хотя есть причины, почему использование хронической HF моделей скудные - много времени подготовке, нестабильность сердечного ритма, этические вопросы и смертности - их преимущества очевидны, как они предлагают присутствие долгосрочных нейрогуморальные активации, Общие системные адаптация, функциональные изменения кардиомиоцитов и структурные изменения сердца мышцы и клапанов12,13.
В целом наличие и разнообразие животных моделей, используемых для исследования гемодинамики широк и предлагает выбор для многих конкретных потребностей. Для этих экспериментов, главным образом свинину, собак, овец, или с мышиным меньше параметров модели, в настоящее время выбраны и предложение хорошее Моделирование ожидаемого человека телесных реакций14. Кроме того формы единого органа эксперименты становятся более частыми15. Чтобы достоверно имитировать патофизиологии HF, тираж искусственно ухудшается. Повреждение сердца может быть вызвано различными методами, часто ишемии, аритмии, давление перегрузки или кардиотоксический эффект препаратов, с любым из них ведет к ухудшению гемодинамики модели. Для получения истинной модели хронической HF, время должна быть обеспечена для разработки долгосрочной адаптации всего организма. Такая надежная и стабильная модель хорошо представлена тахикардия индуцированной кардиомиопатия (ТИЦ), который может быть получен путем быстрого сердца, ходить в подопытных животных.
Было показано, что в предрасположенных сердца, долговечные непрекращающихся тахиаритмиями может привести к систолической дисфункции и растяжений с снижение сердечного выброса. Условие, именуемый как Тиц был впервые описано в 1913 году16, широко используемая в экспериментах с 196217и в настоящее время общепризнанным расстройства. Его происхождение может лежать в различных видах аритмий - суправентрикулярной и желудочковая тахикардия может привести к постепенным ухудшением систолической функции, бивентрикулярная дилатация и прогрессивного клинические признаки ВЧ включая асцит, отеки, летаргия и в конечном итоге сердечной декомпенсации, ведущих к терминал ВЧ и, если не лечить, смерть.
Подобные эффекты кровообращения подавления были замечены путем введения высокого уровня сердца, ходить в животных моделях. В модель свинину, сокращение предсердий или желудочков сердечного ритма над 200 ударов в минуту является достаточно мощным, чтобы побудить HF конце этапа в течение 3-5 недель (прогрессивный фаза) с характеристиками TIC, хотя межличностных различий18, 19. Эти выводы соответствуют хорошо декомпенсированного кардиомиопатия и являются, главное, также сохраняются после прекращения стимуляции (хроническая фаза)19,20,21,22, 23.
Свиней, собак или баранину TIC модели неоднократно были подготовлены для изучения патофизиологии ВЧ14, как изменения в LV имитировать характеристики Дилатационная кардиомиопатия24. Гемодинамические характеристики хорошо описаны - увеличение желудочков конечного диастолического давления, снижение сердечного выход, расширение системного сосудистого сопротивления и дилатация обоих желудочков. В противоположность этому последовательно не наблюдается гипертрофия стены, и даже стены истончение был охарактеризован некоторыми исследователями25,26. С прогрессированием желудочков измерений регургитация на Предсердно-желудочковые клапаны развивается26.
В этой публикации мы представляем протокол производить TIC, долгосрочный быстро сердца электрокардиостимуляции в свиней. Этот biomodel является мощным средством для изучения декомпенсированного Дилатационная кардиомиопатия, гемодинамика прогрессивного хронический ВЧ с низкого сердечного выброса и эффекты лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот экспериментальный протокол был рассмотрен и одобрен организационного комитета экспертов животного на первый факультет, Университет Чарльз и была исполнена на экспериментальной лаборатории университета, Кафедра физиологии, первый факультет Медицина, Карлов университет в Праге, Чешская Республика, в соответствии с законом № 246/1992 Coll. о защите животных от жестокого обращения. Все животные были лечение и уход в соответствии с руководство по уходу и использования лабораторных животных, 8-е издание, опубликована издательством национальных академий, 2011. Все процедуры были выполнены согласно стандартным ветеринарных конвенций и по завершении каждого исследования, был принесен в жертву животное и патанатомия выполнена. Из-за подходящих анатомии, пять здоровых гибридных женский свиньи (Sus scrofa domestica) до 6 месяцев были включены в этом эксперименте. Их средний вес был 66 ± 20 кг в день сбора данных.
1. Общая анестезия
- После 1 день поста инициировать анестезии администрацией внутримышечное введение мидазолама (0,3 мг/кг) и кетамина гидрохлорид (15-20 мг/кг) в ягодичной области.
- Вставьте периферические канюли в Вену маргинальных уха для внутривенного применения.
- Администрировать внутривенного болюсов пропофол (2 мг/кг) и морфина (0,1 - 0,2 мг/кг).
- Обеспечить животных с кислородом через маски и заранее orotracheal интубация с манжетами эндотрахеальной трубки диаметром 6,5-7,5 мм.
- Продолжить общее внутривенной анестезии сочетанием пропофола (6-12 мг/кг/ч), мидазоламом (0,1 - 0,2 мг/кг/ч) и морфин (0,1 - 0,2 мг/кг/ч), регулировки дозы согласно индивидуальных ответов - подавить спонтанного дыхания, роговицы рефлексы, и опорно ответ. Защитите глаза животного с мазь для предотвращения сухости.
- Управлять механической вентиляции автоматическое устройство замкнутого цикла, набор для вентиляции адаптивной поддержки для поддержания целевых конца Приливные CO2 38-42 мм рт.ст и насыщенность адекватного гемоглобин 95-99%. Мониторинг всех жизненно важных функций, особенно сердечного ритма и температуру тела.
- Прикрепите животного, обеспечение ее ноги нежно к таблице операции в лежачем положении.
- Применять антибиотики широкого спектра - 1 g Цефазолин внутривенно через канюлю вен уха.
2. желудочковая свинца имплантации
- Найдите хирургических сайтов и брить кожу должным образом с помощью бритвы (1) югулярной региона выше ключично мышц и (2) одностороннее паравертебральных региона на задней стороне шеи животного.
- С помощью УЗИ сосудистого зонда, визуализировать внешней яремной вены и Марк его расположение на коже. Найдите сонной артерии, а также во избежание его повреждения.
- После дезинфекции кожи широкий, используя повидон йод накройте стерильные хирургические портьера с отверстием над помеченной югулярной региона.
- Подготовить все необходимые инструменты для вживления ритмоводителя и держать их стерильными. Это важно для поддержания стерильную среду во всей процедуре.
- Вырезать кожу параллельных выше внешней яремной вены, мелкие подкожные карман в мягких тканей не более 10 мм глубиной. Не допускайте каких-либо крупных судов.
- Из нижней части предварительно карман вставьте внешней яремной вены, используя стандартный метод Seldinger оболочкой. Во-первых вставьте soft наконечник проволочного проводника через 12G прокола иглой и затем над проволочного ввести 7-французский слезоточивый пластиковых прочь интродьюсер ножнах с расширителя.
- Под руководством флюорографическая ввести 58 см, ходить через этот оболочка и положение его кончика к вершине правого желудочка. Затем извлеките футляр и зафиксировать кончик активного электрода в миокарде при помощи винтов из своей спирали.
- Тест стимуляции параметры - ведущий зондирования сигнал электрокардиограммы желудочков и импеданс должен быть стабильным, стимуляции порог должен быть ниже амплитудой 1 V с 0,4 мс длительностью импульса.
- Вытащить резиновую манжету на стимуляции свинца и исправить оба вместе, чтобы в нижней части предварительно югулярной подкожной карман, два потока швы не рассасывающиеся шовные плетеные. Главное должен быть вставлен достаточной длины, ходить свинца, учитывая возможного роста в будущем животного.
3. подкожной свинца туннелирование
- Переверните животное на его стороне и лечить боковой региона ранее бритой кожи к магистрали, а затем накрыть стерильные хирургические портьера с отверстием. Убедитесь, что югулярной подкожной карман и ведущим остаются стерильными.
- Разрезать боковым кожи к магистрали и образуют глубокий, просторные, подкожной карман. Использование тупой подготовки и остановить любые возможные кровотечения.
- Возьмите мягкий каучук удлинитель из стерильных инфузионных набор и отрезаны оба ее конца. С помощью инструмента туннелирования, преформ прямой подкожный туннель, соединяющий шейных и спинной подкожной карманы с этой удлинитель.
- Подключите свободный конец трубки к желудочковой свинца, потянув его на IS-1 разъема и привлечь ведущих через туннель преформированных в спинной карман подкожной дорзально вытягивая трубка. Это может быть полезным для безопасного соединения с шелковый галстук.
- Удалите средство туннелирования и расширение трубки, подвергая желудочков свинца из спинной карман подкожно.
4. Водитель сердечного ритма имплантации
- Настройка блока Кардиостимулятор имплантируемый двухкамерный сердца с «Y» соединяет часть. Подключение «Y» позволяет конвергентной связи как кардиостимулятор результатов анкет и соединены вместе для одного шага привести (рис. 1 и рис. 2). Этот параметр будет позднее предоставить широкий спектр шага частоты.
- После подключения ходить свинца, закрепите все винты соединения IS-1 в группе заголовок кардиостимулятора и соединения свинца «Y».
- Скройте весь электрокардиостимуляции в глубокая дорсальная подвесные системы. Там должно быть достаточно места, чтобы комфортно разместить блок кардиостимулятора и любые избыточные свинца.
- Проверьте окончательные параметры стимуляции. Убедитесь, что желудочков сердца электрокардиостимуляции возможен от обоих выходов кардиостимулятора.
- Промойте повидон йод и закрыть оба подкожной карманы. Использование рассасывающиеся плетеный поток шовные слои фиброзной ткани и не рассасывающиеся шовные для адаптации кожи.
5. послеоперационный уход
- До тех пор, пока он приходит в сознание достаточно внимательно наблюдать животных.
- Продолжить в широкий спектр внутривенного схемы антибиотикотерапии до заживления раны - Цефазолин 1 г каждые 12 ч. Администрирование анальгетиков в соответствующих дозирования, например, морфин 0,2 мг/кг каждые 6-12 ч в течение 3 дней подкожно. При необходимости, корректировать дозу надлежащим образом предотвратить боль.
- Поместите животное в комфортабельный, спокойный объекта при комнатной температуре. Разрешить свободный доступ к воде и подходящее питание.
- Платье раны с стерильных скрабы регулярно, чтобы сохранить чистый исцеления.
- Чтобы обеспечить отдых после хирургической процедуры, держите кардиостимулятор, тормозится родной сердечного ритма для по крайней мере 3 дней.
- Удаление кожи не рассасывающиеся швы при полностью исцелен, примерно 10-14 дней после процедуры.
6. ходить протокол
- Начните ходить протокол после достаточного периода покоя. Первоначально увеличьте темп сердечного ритма желудочков до 200 уд/мин, установив режим D00 Двухкамерный кардиостимулятор, 100 уд/мин и сопутствующе обстоятельств Настройка AV задержки до 300 мс (точно соответствовать ПАСЕ ПАСЕ интервал, см. таблицу 1). Выберите однополярного электрокардиостимуляции в обоих мероприятий.
- Шагам увеличьте темп сердечного ритма до 220 ударов/мин после 1 недели и 240 ударов/мин после 2 недель (рис. 3). Держите постоянно ходить на этой частоте, если только оно не переносится гемодинамически. Если ВЧ слишком быстро прогрессирует, снизить темп сердечных сокращений до повышения его снова после еще на неделю.
- Используйте аускультацию сердца, ЭКГ и кардиостимулятором допроса ежедневно для проверки частоты сердечных сокращений и постоянной электрокардиостимуляции параметров, включая батареи.
7. сердечная недостаточность индукции и мониторинг
- Обеспечение регулярного ухода специализированных ветеринаром и контролировать состояние общего здоровья животного. Клинические наблюдения увеличения собственного сердца и дыхания ставки, оценки периферийных пульсоксиметрии и сокращения в спонтанной физической активности или аппетит предоставляют сведения о ВЧ прогрессии.
- Использовать преимущества беспроводных чрескожной кардиостимулятор допроса и, если возможно, непрерывная запись ЭКГ - частые-поддерживается желудочковая тахикардия (VT) являются признаком прогрессирования тяжелых кв.
- Используйте эхокардиографические оценок раскрыть сердце структурные и функциональные изменения. Обратите внимание, чтобы найти окно оптимального изображения согласно свинину анатомии и дилатации сердца - для представления типичных 4 камеры, место датчика справа чуть ниже мечевидный и угол его шеи или левого плеча. Для представления короткий оси используйте межреберные windows. После нескольких недель должно быть заметно снижение фракции выброса желудочка в родной сердечного ритма и Атриовентрикулярная regurgitations.
Примечание: Существуют значительные межличностных различия высокий уровень желудочков ходить терпимости. Таким образом частый мониторинг и индивидуально адаптированы Настройка протокола стимуляции являются необходимыми.
Рисунок 1: сердце ходить блок схема. Двухкамерный кардиостимулятор (1), «Y» в форме адаптер (2) проведение конвергентно обоих выходов кардиостимулятор вместе для одного шага привести (3). Кончик провода зафиксированном в апикальной части RV полости (4). Этот параметр обеспечивает широкий спектр высоких частот ходить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Сердце электрокардиостимуляции исполнимых Рентген (A) и фотографии (B) двухкамерный Электрокардиостимулятор (1), «Y» в форме адаптер (2), и желудочковая электрокардиостимуляции привести (3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Желаемый HR | Стоимость установка кардиостимулятора | ПАСЕ ПАСЕ интервал |
| уд/мин | уд/мин | MS |
| 200 | 100 | 300 |
| 220 | 110 | 270 |
| 240 | 120 | 250 |
| 250 | 125 | 240 |
Таблица 1: параметры кардиостимулятор. Чтобы разрешить высокий уровень сердца, ходить с блоком имплантированных в дом-модифицированных Двухкамерный кардиостимулятор, в таблице нужный темп сердечных сокращений (HR) и сопоставления ПАСЕ ПАСЕ интервала значений. Кардиостимулятором должно быть присвоено D00 режим работы в размере половины желаемого HR, и AV задержки присвоено соответствующее ПАСЕ ПАСЕ интервал в миллисекундах.
Рисунок 3 : Электрокардиостимуляция протокол. Прогрессивные фаза индукции TIC начинается после отдыха продолжительностью 3 дня. Затем, кардиостимулятором устанавливается режим D00 с частотой 50% от требуемой частоты темп стимуляции, и AV задержки установлен соответствующий ПАСЕ ПАСЕ интервал (см. таблицу 1). Благодаря «Y» в форме адаптер оба выхода кардиостимулятор проводятся один ходить свинца. BPM = ударов в минуту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тестирование модели: После того, как признаки декомпенсированной хронической ВЧ стали видными, искусственной вентиляции и анестезии вводили снова после принципы, описанные выше, но дозирования была скорректирована ввиду низкого сердечного вывода27. Из-за возможных кардиодепрессивний эффекты анестетиков необходим тщательный интенсивный мониторинг жизненно важных функций.
Животное был прикреплен в лежачем положении и все инвазивные подходов началось. Бедренной вены и артерии и яремной вены были пункцию и внутрисосудистого подходов обеспечивается стандартная перкутанная внутрипросветная влагалищ. Хирургически подвергаются правой сонной артерии и подключичных артерий и близлежащих ультразвуковые датчики потока надлежащих размеров были прикреплены, позволяя получение непрерывного крови поток измерения28.
Центральное венозное давление (CVP) был измерен через яремной вены, используя стандартный инвазивный метод с датчика давления, заполненные жидкостью, но давление высок чувствительности датчика оборудованы катетер в грудной аорты была использована для системного артериального давления измерения. Региональные ткани кислородом контролируются ближней инфракрасной спектроскопии с датчиков, размещенных на голове и правого предплечья, представляющие мозга и периферических тканей кислородом насыщения уровней (РЮО2)29. Трансторакальная эхокардиографические зонд был использован для 2D и цветной допплер изображений. Данные ЭКГ, ЧСС, пульс оксиметрии, давление крови, capnometry и ректальной температуры были централизованы на кровати стороне монитора для непосредственного контроля. Баллонного катетера Swan-Ganz была введена через оболочка бедренной вены легочной артерии позволяя производными чтений термодилюции непрерывной сердечного выброса (CO)30 и смешанной венозной гемоглобина насыщения (SvO-2). Через клапан аорты катетер давления объем (PV) был введен в retrogradely полость LV. Этот катетер проводимости PV включена регистрация мгновенный объем и давление в LV палата31,,3233,34, и ее устойчивое положение руководствуется рентгеноскопии и эхокардиография для получения оптимального цикла морфология PV (рис. 4 и Рисунок 5). Измеряемые параметры LV включены конечного диастолического давления и объема (EDP и EDV), конец систолический объем (ESV), LV пиковое давление (LV PP) и максимальные позитивные изменения давления LV, определяется как первая производная давления LV нормированы EDV (dP/dtМакс / EDV), который затем представляет преднагрузки независимых индекс LV сократимости35,36. Дополнительные рассчитанные параметры были ударный объем (SV = EDV - ESV), фракция выброса левого желудочка (EF = SV / EDV), и в среднем артериальной потока в сонной артерии и подключичной артерии. C-руку на протяжении протокола были проведены флюорографическая руководство и рентгенография. После завершения экспериментальных измерений были исполнены эвтаназии внутривенного калия передозировки и вскрытие. Сердце было воздействию, вырезать из груди, очищены от крови, весил и исследованы структурные аномалии.
Все данные были приобретены в родной синусовый ритм, после быстрого желудочков ходить внезапно остановлено и было предоставлено время для стабилизации к условиям устойчивого состояния. Затем были записаны параметры и наборы данных в среднем от трех точек в конце выдоха время. Если он присутствует, преждевременной удары были опущены из анализа. Все значения выражаются как среднее ± стандартное отклонение.
Измерения результатов: Физическое обследование показало тяжелые клинические признаки хронической ВЧ у всех животных после 4-8 недель ходить протокол. Подробные результаты кратко излагаются в таблице 2.
Начальный средний сердца синусовый ритм составлял 100 ± 38 уд/мин, среднее давление аортальной крови достигла 47 ± 38 мм рт.ст и CVP 14 ± 4 мм рт.ст.. Рентген грудной клетки показали дилатация Тень сердца, с коэффициентом кардиоторакальной 0,64 ± 0.04 (Рисунок 5A). Это в соответствии с выводами Трансторакальная эхокардиография. Дилатация всех камер сердца, тяжелые систолической дисфункции обоих желудочков и значительные митрального и трикуспидального regurgitations были очевидны по эхокардиографии. Фракция среднее изгнания левого желудочка был ниже 30% всех животных, LV стены было судить не гипертрофическая с толщиной 7-10 мм и диссинхронии LV сокращение было очевидно (рис. 6).
Термодилюции измеряется сердечного выброса в отдыхая государство было 2,9 ± 0,8 Л/мин и смешанной венозной крови насыщения 62 ± 18% переписывался с неадекватным ткани доставки кислорода в этой модели. Средняя артериального кровотока в сонной артерии был 211 ± 144 мл/мин и подключичной артерии в 103 ± 108 мл/мин. Аналогичным образом региональные ткани насыщенность аутогенных Записанная на голове была только 57 ± 13%, и это было даже ниже на правом предплечье, 37 ± 13%.
Петля тома давления, полученные из PV катетер иллюстрирует подробные меры гемодинамики и работы, производимые механических активность левого желудочка в течение каждого сердечного цикла (рис. 4). Максимальное давление LV пик был сокращен до 49 ± 32 мм рт.ст., но EDP оставался низким в 7 ± 4 мм рт.ст.. Измеряемых объемов левого желудочка камеры были обусловлены его дилатация и систолической дисфункции. EDV была увеличена до 189 ± 59 мл и ESV 139 ± 37 мл. Усредненное SV был 51 ± 45 мл и средняя фракция изгнания LV был рассчитан на 25 ± 16%. Кроме того, преднагрузки независимых индекс LV сократимости может быть представлено dP/dtМакс / EDV отношение, которое было в среднем на 2,2 ± 1,7 мм рт.ст. / s/мл.
Вскрытие подтвердило кардиоторакальный (рис. 7) означает сердце весом 471 ± 127 g, который сформировал 0,7% от массы тела. Дилатация всех камер сердца и истончение LV стены были заявлены и жидкости коллекции были описаны в перикарда и перитонеального пространства. Не шунта или других сердечных аномалия был найден в любой из животных.
Рисунок 4: давления объем измерений. Образцы прямых левого желудочка PV петли (A-D) и схема среднем PV цикл всех субъектов TIC (E). LV PP = LV пиковое давление, ЭОД = конечного диастолического давления, EDV = конечного диастолического объема и SV = ударный объем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Флюорографию. Расширен Тень сердца (красная стрелка) и увеличение кардиоторакальной соотношение (A). Обратите внимание, ходить ведущий представил верхушки правого желудочка (1), катетера Swan-Ganz помещены в легочной артерии (2), и PV катетер с 5 электродов в левой вентрикулярной камеры (3). Для сравнения, грудной клетки нормального сердца со дня вживления ритмоводителя (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Трансторакальная эхокардиография. Представитель тахикардия индуцированной кардиомиопатия с тяжелой дилатация всех камер сердца (A) и аналогичное мнение, полученные до кардиостимулятором вживленный (B), для сравнения. В конце диастола были приняты оба приобретения. Обратите внимание на видимые кончик электрокардиостимуляции свинца в Апексе RV в (A). РВ = правый желудочек и LV = левый желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Фотографии открытые сердца. Кардиоторакальный (A) после индукции TIC. Нормальный свинину сердца образец для сравнения размеров (B) (весы в см). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Параметр | ТИЦ значение | Единицы | ||
| Обработка изображений | ||||
| CTR | 0,64 | ± | 0,04 | |
| LV EF | < 30 | % | ||
| LV ЭДД | 66 | ± | 3 | мм |
| RV EDD | 40 | ± | 6 | мм |
| AV-regurgitations | тяжелая | |||
| Параметры циркуляции | ||||
| HR | 100 | ± | 38 | уд/мин |
| КАРТА | 47 | ± | 38 | мм рт.ст. |
| CO | 2.9 | ± | 0,8 | Л/мин |
| Шереметьево2 | 62 | ± | 18 | % |
| Глава2 РЮО | 57 | ± | 13 | % |
| rSO2 правого предплечья | 37 | ± | 13 | % |
| Сонная потока | 211 | ± | 144 | Мл/мин |
| Подключичные потока | 103 | ± | 108 | Мл/мин |
| ХДНП | 14 | ± | 4 | мм рт.ст. |
| Давление объем приобретение | ||||
| LV PP | 49 | ± | 32 | мм рт.ст. |
| LV EDP | 7 | ± | 4 | мм рт.ст. |
| LV EDV | 189 | ± | 59 | mL |
| LV ESV | 139 | ± | 37 | mL |
| SV | 51 | ± | 45 | mL |
| LV EF | 25 | ± | 16 | % |
| dP/dtМакс / соотношение EDV | 2.2 | ± | 1.7 | мм рт.ст. / s/мл |
| Вскрытие | ||||
| Средний вес сердца | 471 | ± | 127 | g |
| кардиомегалией, дилатация камер сердца, LV стены истончение, перикарда жидкости коллекции | ||||
Таблица 2: численные результаты ТИЦ модель после прекращения электрокардиостимуляции протокол. Все значения, выраженные как среднее ± стандартное отклонение. CTR = кардиоторакальной соотношение, LV EF = фракция изгнания LV, LV Эдд / RV EDD = LV / RV конечного диастолического диаметр, AV regurgitations = предсердно клапан regurgitations, HR = частота сердечных сокращений, карта = среднее давление аорты, CO = сердечного выброса, SvO-2 = смешанной венозной насыщения гемоглобина, РЮО2 = региональных ткани насыщения, CVP = Центральное венозное давление, LV PP = пиковое давление LV, LV ЭОД / LV EDV = LV конечного диастолического давления/объем, LV ESV = конец систолический объем LV и SV = ударный объем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хронический ВЧ является основной проблемой здравоохранения, значительно способствует заболеваемости и смертности. Патогенез и прогрессирования ВЧ в организме человека является сложным, поэтому соответствующие животной модели имеет решающее значение для изучения основных механизмов и проверить Роман терапии, которые стремятся помешать с родной тяжелой болезни. Для изучения ее патогенеза, большие животные модели используются для экспериментального тестирования.
В общем хирургические модели хронической ВЧ тесно имитировать эту болезнь. По сравнению с модели острого HF, хронические ВЧ модели предлагают больше проницательности в патофизиологии, но за счет времени экспериментальной подготовки или более высокого уровня смертности. От различных известных хронический HF моделей мы имеем в виду соответствующие и легко управляемой модели, здесь представлен декомпенсированной хронической HF, вызванных темп тахикардия.
Тахикардия индуцированной кардиомиопатия как форма Дилатационная кардиомиопатия индуцибельной путем быстрого сердечной стимуляции. Электрод стимуляции могут быть расположены в желудочках или предсердия19,24. Мы опустили суправентрикулярной электрокардиостимуляции сайт, чтобы предотвратить проблемы, возможно, вызванные Атриовентрикулярная блокада во время высокой частоты стимуляции. Желудочков позиции также улучшена стабильность ходить свинца, зафиксированном в желудочковой Апекс по сравнению с предсердной позицию и уменьшить появление ее дислокации. Представлена методика разработан специально для легко производительности, использования оборудования, широко доступны и профилактики осложнений. Еще одна цель этого метода было легко контролировать прогрессирование хронических ВЧ путем титрования протокола стимуляции.
Бактериальные инфекции осложнений являются серьезной проблемой имплантатов в экспериментальных условиях. Генератор карман инфекций и инфекционного эндокардита, связанные с плохой прогнозы и сделает эксперимент бесполезным. Из-за свиного анатомии югулярной регион подвергается и если здесь размещался генератор ритмоводителя, исцеление и предотвращению загрязнения будет трудной задачей в Лонг выживание экспериментов. Использование подкожной туннелирование позволяет местоположение кармана генератор ритмоводителя спинной регион, который доступен и может храниться в гигиеническое состояние. Также, кардиостимулятором не в пределах досягаемости животных, что значительно улучшает заживление. Альтернативный подход может быть использование искусственного ритмоводителя генератора, прилагается к поверхности кожи, но эта тактика была показана механически уязвимой, если долгосрочная выживаемость животных был предназначен.
Все оборудование, необходимое для протокола описаны широко доступны, и этот метод воспроизводима базовые навыки, хирургические и катетеризации. Цель группы «Y» формы подключения является использование регулярных Двухкамерный кардиостимулятор, как она сходится оба своих мероприятий (предсердная и желудочковая) до кончика одного ходить свинца. Эти параметры позволяют широкий спектр высокой скорость шага частоты (200-300 ударов/мин, рис. 1 и Таблица 1).
Наиболее важным этапом является титрование шага частоты. Слишком высокий с самого начала приведет к острой декомпенсации, не время для адаптации механизмов для разработки; и наоборот титрования ходить слишком низким будет хорошо переносится и продлит ВЧ индукции.
По данным предыдущих публикаций22,,2537 и опыта авторов ходить протокол был определен и начал с электрокардиостимуляции скорость 200 уд/мин, который находится выше физиологических здоровых свиней в осуществлять или стресс. Впоследствии частота была эскалация и титруют между 200 и 240 ударов/мин в отношении отдельных ВЧ прогрессии13,-19. Ввиду межличностных различий в ответ на быстро ходить время, необходимое для производства хронического ВЧ с глубоким признаков декомпенсации варьируется от 4 до 8 недель. Проблема здесь может стать жизнь батареи, как таковой высокий уровень темпов роста энергетических потребностей. Особенно, когда возводится стимуляции порог, важное значение имеют регулярные допросы.
После стимуляции протокол, симптомы хронического ВЧ были видные последовательно в всех животных - тахипноэ, усталость, спонтанное тахикардия из > 150 уд/мин и систолическое шумы. После дальнейшего клинического расследования, асцит, перикарда и плеврального излияния, -поддерживается желудочковая тахикардия дилатация всех камер сердца, и значительные митрального и трикуспидального regurgitations были описаны. При отсутствии гемодинамики было указано артериальной гипотензии, бедных сократимости миокарда, низкий объем, и сердечного выброса, сокращен до примерно 50% здоровых животных ожидается нормальное значение38. Эта разработанная модель тахикардия индуцированной кардиомиопатия, соответствует хорошо плохо компенсацию Дилатационная кардиомиопатия и также сохранился после прекращения стимуляции21,,3940.
Тот факт, что систолической функции по-прежнему серьезно ухудшилось после прекращения ходить делает модель отличным выбором для изучения ВЧ в родной синусовый ритм. Ранее показано, что тахикардия индуцированной систолической дисфункции по крайней мере частично обратимо на этапе так называемой восстановления, но время, необходимое для того, чтобы улучшить или нормализовать значительно варьируется между людьми. Стимуляции протокол продолжительность и агрессивность скорость титрования может быть существенный вклад тоже, как постоянного ишемическая и фиброзных изменений производятся в миокарде22,,39-40,41 . Сохранением серьезных систолической дисфункции в представленной модели был протестирован по крайней мере за 12 ч после ходить прекратили4 и качества подготовленной модели, включая нейрогуморальные динамика, периферические сосудистые аномалии и сердечных дисфункции были обусловлены человеческой хронический кв14.
Представленные результаты свидетельствуют резко ухудшилось гемодинамики, оба клиническое исследование и измеренные значения указывают индукции ВЧ синдрома. Кардиоторакальный последовательно наблюдалось, диспансеризация, изображений и вскрытие. Сердечный ритм синусовый ритм после прекращения быстрых темпов возведен от нормального отдыха частоты, но мы предполагаем, что влияние эффектов кардиодепрессивний анестезии может ограничить это спонтанное тахикардия. Аорты давления Показать глубокой гипотензии42 и ХДНП был повышен.
Функциональные отражение затем является отсутствие циркуляции и ткани гипоперфузии. Прежде всего они вызваны нарушениями сокращение миокарда, как указано на долю низкого выброса левого желудочка. Обоих желудочков были расширены без расширения толщины стенки, и этот Ремоделирование сердца является основанием для прогрессивного Атриовентрикулярная regurgitations и как следствие низкого сердечного выброса. Как не анатомические шунтов были найдены посмертных, сердечного выброса было одинаково низкие, в систематической, а также в легочной циркуляции, и поэтому термодилюции производного измерения сердечного выброса в легочной артерии были использованы для калибровки объем цикла PV характеристики.
Плечевая и мозг насыщение кислородом региональных ткани, а также региональные крови поток в подключичной и сонной артерии предлагает централизации кровообращения. Их низкие значения показывают сильно сниженным ткани перфузии в периферийных устройств также как и жизненно важных органов, который был подтвержден низкой SvO2 по сравнению с ожидаемым нормальное значение по меньшей мере 65%42. Общая низкая ткани перфузии был в соответствии с измерениями низкого сердечного выброса.
Гемодинамики и механическая работа в течение каждого сердечного цикла левого желудочка был хорошо задокументированы схеме PV, полученной от PV катетер мгновенного измерения. Бедные миокарда прочность было обозначено максимальное пиковое давление LV во время систолы и dP/dtМакс / коэффициент EDV, преднагрузки независимых индекс LV сократимости. Объемы камер LV были расширены в течение всего цикла, таким образом изображение Дилатационная кардиомиопатия. Конец диастолическое давление LV не был увеличен как высокий, как и следовало ожидать в кардиогенным шоком. LV, давление наполнения остается низким, наиболее вероятно из-за высокого соответствия LV тонкой стенки миокарда43.
В подавляющем большинстве предыдущих исследований TIC свиней и собак модели были используется19. Однако быстрые темпы может использоваться побудить кардиомиопатия в других видов, даже в мелких животных. Несколько исследований продемонстрировали метаболические эффекты острого ИТК в крыс44 или нарушения сократимости миокарда после долгосрочного быстро ходить в кроликов45.
Хотя эта модель является достаточно надежной, она имеет некоторые ограничения. Non поддерживается желудочковая тахикардия являются признаком успешного ВЧ индукции, но длительное VT производят риск внезапной сердечной смерти. Во время анестезии один из животных требует реанимации и дефибрилляции. Широкий разброс результатов был отчасти из-за разницы в весе тела животного. Кроме того необходимость анестезии должен приниматься в рамках рассмотрения при представлении результатов, особенно ее влияния на сердечный ритм и кровяное давление. Свинину специфических маркеров в крови может быть полезным для оценки степени Ремоделирование сердца, но доказательств на этом фронте до сих пор отсутствует. Поскольку большинство из этих методов измерения инвазивных и таким образом неповторимым, мы не представила базового или фиктивный предмет измерения.
Модель прогрессивного хронической сердечной недостаточности может производиться в представленной методологии. Этот метод легко выполнять с широко имеющееся оборудование, и результаты являются надежными и воспроизводимость. Этот тахикардия индуцированной кардиомиопатия предлагает ценный объект для дальнейших экспериментальных исследований гемодинамики, исследование механизмов болезни и последствия применяемых процедур.
| срабатываний | негативы |
| синдром хронической сердечной недостаточности с системными адаптации | много времени модель подготовки |
| простое управление прогрессирования заболевания | тщательный мониторинг необходимые |
| туннелирование свинца предотвращает инфекционные осложнения | риска свинца дислокации |
| сделано с basic хирургические и cathetrization навыки | риск злокачественных аритмии |
| потенциально переданы различные виды животных |
Таблица 3: Обзор резюме позитивы и негативы представленные методологии для тахикардия индуцированной кардиомиопатия в свином как модель хронической сердечной недостаточности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Карлова университета научно-исследовательских грантов GA Великобритании № 538216 и GA Великобритании № 1114213.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medication | |||
| midazolam | Roche | Dormicum | anesthetic |
| ketamine hydrochloride | Richter Gedeon | Calypsol | anesthetic |
| propofol | B.Braun | Propofol | anesthetic |
| cefazolin | Medochemie | Azepo | antibiotic |
| Silver Aluminium Aerosol | Henry Schein | 9003273 | tincture |
| povidone iodine | Egis Praha | Betadine | disinfection |
| morphine | Biotika Bohemia | Morphin 1% inj | analgetic |
| Tools | |||
| Metzenbaum scissors, lancet with #22 blade, DeBakey forceps, needle driver | basic surgical equipment | ||
| cauterizer | |||
| 2-0 Vicryl | Ethicon | V323H | absorbable braided suture |
| 2-0 Perma-Hand Silk | Ethicon | A185H | silk tie suture |
| 2-0 Prolene | Ethicon | 8433H | non-absorbable suture |
| Diagnostic devices | |||
| ESP C-arm | GE Healthcare | ESP | X-ray fluoro C-arm |
| Acuson x300 | Siemens Healthcare | ultrasound system | |
| Acuson P5-1 | Siemens Healthcare | echocardiographic probe | |
| Acuson VF10-5 | Siemens Healthcare | sonographic vascular probe | |
| 3PSB, 4PSB and 6PSB | Transonic Systems | perivascular flow probes | |
| TS420 | Transonic Systems | perivascular flow module | |
| TruWave | Edwards Lifesciences | T001660A | fluid-filled pressure transducer |
| 7.0F VSL Pigtail | Transonic Systems | pressure sensor catheter | |
| INVOS 5100C Cerebral/Somatic Oximeter | Somanetics/Medtronic | near infrared spectroscopy | |
| CCO Combo Catheter | Edwards Lifesciences | 744F75 | Swan-Ganz pulmonary artery catheter |
| Vigillace II | Edwards Lifesciences | VIG2E | cardiac output monitor |
| 7.0F VSL Pigtail | Transonic Systems | pressure-volume catheter | |
| ADV500 | Transonic Systems | pressure-volume system | |
| LabChart and PowerLab | ADInstruments | data acquisition and analysis system | |
| Prism 6 | GraphPad | statistical analysis software | |
| Pacing devices | |||
| ICS 3000 | Biotronic | 349528 | pacemaker programmer |
| ERA 3000 | Biotronic | 128828 | external pacemaker |
| Effecta DR | Biotronic | 371199 | dual-chamber pacemaker |
| Tendril STS | St. Jude Medical | 2088TC/58 | ventricular pacing lead |
| Lead permanent adapter | Osypka | Article 53422 | convergent "Y" connecting part |
| Lead permanent adapter | Osypka | Article 53904 | convergent "Y" connecting part |
| Tear-Away Introducer 7F | B.Braun | 5210593 | tear away introducer sheath |
| Split Cath Tunneler | medComp | AST-L | tunneling tool |
| infusion line | MPH Medical Devices | 2200045 | connecting line |
References
- Ostadal, P., et al. Direct comparison of percutaneous circulatory support systems in specific hemodynamic conditions in a porcine model. Circ Arrhythm Electrophysiol. 5 (6), 1202-1206 (2012).
- Ostadal, P., et al. Increasing venoarterial extracorporeal membrane oxygenation flow negatively affects left ventricular performance in a porcine model of cardiogenic shock. J Transl Med. 13, 266 (2015).
- Shen, I., et al. Left ventricular dysfunction during extracorporeal membrane oxygenation in a hypoxemic swine model. Ann Thorac Surg. 71 (3), 868-871 (2001).
- Hala, P., et al. Regional tissue oximetry reflects changes in arterial flow in porcine chronic heart failure treated with venoarterial extracorporeal membrane oxygenation. Physiol Res. 65 (Supplementum 5), S621-S631 (2016).
- Church, J. T., et al. Normothermic Ex-Vivo Heart Perfusion: Effects of Live Animal Blood and Plasma Cross-Circulation. ASAIO J. , (2017).
- Bavaria, J. E., et al. Changes in left ventricular systolic wall stress during biventricular circulatory assistance. Ann Thorac Surg. 45 (5), 526-532 (1988).
- Shen, I., et al. Effect of extracorporeal membrane oxygenation on left ventricular function of swine. Ann Thorac Surg. 71 (3), 862-867 (2001).
- Ostadal, P., et al. Novel porcine model of acute severe cardiogenic shock developed by upper-body hypoxia. Physiol Res. 65 (4), 711-715 (2016).
- Ostadal, P., et al. Noninvasive assessment of hemodynamic variables using near-infrared spectroscopy in patients experiencing cardiogenic shock and individuals undergoing venoarterial extracorporeal membrane oxygenation. J Crit Care. 29 (4), e611-e695 (2014).
- Mlcek, M., et al. Hemodynamic and metabolic parameters during prolonged cardiac arrest and reperfusion by extracorporeal circulation. Physiol Res. 61 (Suppl 2), S57-S65 (2012).
- Tarzia, V., et al. Extracorporeal life support in cardiogenic shock: Impact of acute versus chronic etiology on outcome. J Thorac Cardiovasc Surg. 150 (2), 333-340 (2015).
- Howard, R. J., Stopps, T. P., Moe, G. W., Gotlieb, A., Armstrong, P. W. Recovery from heart failure: structural and functional analysis in a canine model. Can J Physiol Pharmacol. 66 (12), 1505-1512 (1988).
- Moe, G. W., Armstrong, P. Pacing-induced heart failure: a model to study the mechanism of disease progression and novel therapy in heart failure. Cardiovasc Res. 42 (3), 591-599 (1999).
- Power, J. M., Tonkin, A. M. Large animal models of heart failure. Aust N Z J Med. 29 (3), 395-402 (1999).
- Trahanas, J. M., et al. Achieving 12 Hour Normothermic Ex Situ Heart Perfusion: An Experience of 40 Porcine Hearts. ASAIO J. 62 (4), 470-476 (2016).
- Gossage, A. M., Braxton Hicks, J. A.
- Whipple, G. H., Sheffield, L. T., Woodman, E. G., Theophilis, C., Friedman, S. Reversible congestive heart failure due to chronic rapid stimulation of the normal heart. Proceedings of the New England Cardiovascular Society. 20 (1), 39-40 (1962).
- Spinale, F. G., Grine, R. C., Tempel, G. E., Crawford, F. A., Zile, M. R. Alterations in the myocardial capillary vasculature accompany tachycardia-induced cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 87 (1), 65-79 (1992).
- Shinbane, J. S., et al. Tachycardia-induced cardiomyopathy: a review of animal models and clinical studies. J Am Coll Cardiol. 29 (4), 709-715 (1997).
- Moe, G. W., Stopps, T. P., Howard, R. J., Armstrong, P. W. Early recovery from heart failure: insights into the pathogenesis of experimental chronic pacing-induced heart failure. J Lab Clin Med. 112 (4), 426-432 (1988).
- Takagaki, M., et al. Induction and maintenance of an experimental model of severe cardiomyopathy with a novel protocol of rapid ventricular pacing. J Thorac Cardiovasc Surg. 123 (3), 544-549 (2002).
- Tomita, M., Spinale, F. G., Crawford, F. A., Zile, M. R. Changes in left ventricular volume, mass, and function during the development and regression of supraventricular tachycardia-induced cardiomyopathy. Disparity between recovery of systolic versus diastolic function. Circulation. 83 (2), 635-644 (1991).
- Schmitto, J. D., et al. Large animal models of chronic heart failure (CHF). J Surg Res. 166 (1), 131-137 (2011).
- Spinale, F. G., et al. Chronic supraventricular tachycardia causes ventricular dysfunction and subendocardial injury in swine. Am J Physiol. 259 (1 Pt 2), H218-H229 (1990).
- Chow, E., Woodard, J. C., Farrar, D. J. Rapid ventricular pacing in pigs: an experimental model of congestive heart failure. Am J Physiol. 258 (5 Pt 2), H1603-H1605 (1990).
- Howard, R. J., Moe, G. W., Armstrong, P. W. Sequential echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular remodelling and mitral regurgitation during evolving experimental heart failure. Cardiovasc Res. 25 (6), 468-474 (1991).
- Roberts, F., Freshwater-Turner, D. Pharmacokinetics and anaesthesia. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 7 (1), 25-29 (2007).
- Carter, B. S., Farrell, C., Owen, C. Microsurgical clip obliteration of middle cerebral aneurysm using intraoperative flow assessment. J Vis Exp. (31), (2009).
- Wolf, M., Ferrari, M., Quaresima, V. Progress of near-infrared spectroscopy and topography for brain and muscle clinical applications. J Biomed Opt. 12 (6), 062104 (2007).
- Mateu Campos, M. L., et al. Techniques available for hemodynamic monitoring. Advantages and limitations. Med Intensiva. 36 (6), 434-444 (2012).
- Baan, J., et al. Continuous measurement of left ventricular volume in animals and humans by conductance catheter. Circulation. 70 (5), 812-823 (1984).
- Ellenbroek, G. H., et al. Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction. J Vis Exp. (116), (2016).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. J Vis Exp. (111), (2016).
- van Hout, G. P., et al. Admittance-based pressure-volume loops versus gold standard cardiac magnetic resonance imaging in a porcine model of myocardial infarction. Physiol Rep. 2 (4), e00287 (2014).
- Kass, D. A., et al. Comparative influence of load versus inotropic states on indexes of ventricular contractility: experimental and theoretical analysis based on pressure-volume relationships. Circulation. 76 (6), 1422-1436 (1987).
- Glower, D. D., et al. Linearity of the Frank-Starling relationship in the intact heart: the concept of preload recruitable stroke work. Circulation. 71 (5), 994-1009 (1985).
- Hendrick, D. A., Smith, A. C., Kratz, J. M., Crawford, F. A., Spinale, F. G. The pig as a model of tachycardia and dilated cardiomyopathy. Lab Anim Sci. 40 (5), 495-501 (1990).
- Wyler, F., et al. The Gottinger minipig as a laboratory animal. 5. Communication: cardiac output, its regional distribution and organ blood flow (author's transl). Res Exp Med (Berl). 175 (1), 31-36 (1979).
- Cruz, F. E., et al. Reversibility of tachycardia-induced cardiomyopathy after cure of incessant supraventricular tachycardia. J Am Coll Cardiol. 16 (3), 739-744 (1990).
- Umana, E., Solares, C. A., Alpert, M. A. Tachycardia-induced cardiomyopathy. Am J Med. 114 (1), 51-55 (2003).
- Dixon, J. A., Spinale, F. G. Large animal models of heart failure: a critical link in the translation of basic science to clinical practice. Circ Heart Fail. 2 (3), 262-271 (2009).
- Xanthos, T., et al. Baseline hemodynamics in anesthetized landrace-large white swine: reference values for research in cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation models. J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (5), 21-25 (2007).
- Little, W. C. Diastolic dysfunction beyond distensibility: adverse effects of ventricular dilatation. Circulation. 112 (19), 2888-2890 (2005).
- Montgomery, C., Hamilton, N., Ianuzzo, C. D. Effects of different rates of cardiac pacing on rat myocardial energy status. Mol Cell Biochem. 102 (2), 95-100 (1991).
- Qin, F., Shite, J., Mao, W., Liang, C. S. Selegiline attenuates cardiac oxidative stress and apoptosis in heart failure: association with improvement of cardiac function. Eur J Pharmacol. 461 (2-3), 149-158 (2003).
