Summary
休止状態とアクティブな癌細胞の表現型は、定量的な位相画像を用いた特徴付けられました。細胞の増殖、移行、および形態の試金を統合し、1 つの単純な方法で分析します。
Abstract
血管新生形質の獲得は腫瘍休眠からの脱出の重要なコンポーネントです。これらのメソッドは時間を調査し、非血管新生と血管新生細胞の表現型を特徴付けるいくつかのクラシックの in vitroアッセイ (例えば増殖、移行、および他の人) と体内のモデルが開発されているが労働集約的なと、多くの場合高価な試薬、機器と専門的な技術を必要とします。最近の研究で血管新生と血管新生以外のひと骨肉腫 KHOS 細胞の時間経過およびラベリング-無料の特徴づけを行う新規定量位相イメージング (QPI) を使用しました。細胞の形態・増殖・運動を含む携帯電話のパラメーターのパネルは、定量的に測定したし、QPI を用いています。この小説と定量的アプローチは、継続的に、非侵襲的シンプルで統一された方法で関連する細胞プロセス、動作、およびがん細胞の特性および他の細胞型を勉強する機会を提供します。このレポートでは、セルの準備、QPI 集録、データ分析など当社の実験プロトコルについて説明します。
Introduction
開発・進行固形腫瘍の初期のチェックポイントの 1 つは、血管新生形質、がんの特徴の習得です。この進行には、様々 な生化学的・分子過程1,2,3が含まれます。腫瘍の進行のこの重要なステップにおける技術的な課題は、継続的かつ定量的評価し、公平な方法で生きているがん細胞の血管新生と血管新生以外の表現型を区別するためのツールの欠如です。通常血管新生と非血管新生細胞の細胞の挙動を調査するために使用されている伝統的な試金は高価な試薬・機器を必要とする、たとえば、細胞増殖・遊走アッセイ4,5、 6,7,8,9,10、11,12,13,14か高い専門性と集中を必要とすると同様に相補的な生体内評価4,5,6,8,15,16、時間と労働消費。
最近では、定量位相イメージング (QPI) は、様々 な細胞形態および動作パラメーター17,18,19,の時間経過およびラベリング無料評価を可能にする手法として浮上しています。20,21,22. 従来の光学顕微鏡とは異なり QPI を定量化位相差画素ごとのバリエーション光、光物体を通り抜けるし、変換の光学的厚さとボリューム、自筆を再構築後、直通ができ生きているセル、次の機能の解析: (4) 同時多重パラメーター イメージング (3) ラベル無料画像、(2) 非侵襲とタイムラプス イメージング (1) 定量的イメージング。これらの機能は、QPI に評価し、細胞レベルで病態を理解するための強力なツールを作る。
最近の研究で我々 は定量的評価し、血管新生を区別する QPI を利用 KHOS A および体系的かつ定量的に、細胞形態の分析を組み合わせることでひと骨肉腫細胞の非血管新生 KHOS N の表現型増殖、および運動23。血管新生と血管新生以外のひと骨肉腫細胞の細胞形態および行動のパラメーターを比較した定量的画像解析ソフト、パネルを使用して、5 つの特徴的な違いは、これらの 2 つの識別されました。表現型。この手法は、さまざまな生物学的に関連する細胞の特性を評価するため統合と定量的なプラットフォームを提供します。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、ボストン子供病院制度バイオ セーフティ委員会によって承認されています。
1. セル準備
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KHOS A を融解し、-n 個のセル
- ウォーム アップ培地、すなわち、ダルベッコ修飾イーグル培 10% (巻/巻) 牛胎児血清 (FBS) と 1% (巻/巻) ペニシリン/ストレプトマイシン。
- 液体窒素タンクからセルのセラム チューブを取る、暖かい水 37 ° C の水浴中にバイアルの底を浸し、解凍処理を加速するセラム チューブを軽く振る。汚染を避けるために水へのお問い合わせからセラム チューブのふたを保ちます。細胞を解凍すると、すぐに、70% エタノール溶液を噴霧し、バイアルを拭く、セラムを滅菌します。
- 層流フードの極低温バイアルから細胞懸濁液をすぐに吸引し、優しく温めて 10 mL 培養液 (1.1.1 で説明) で中断します。5-7 分の約 200 x g で細胞を懸濁液を遠心します。
- 培地 10 mL を温めて、細胞ペレットを再懸濁します、T75 フラスコに移します。軽く均等に 10 mL のピペットを使用してセルを中断する数回をピペットします。
- 5% (巻/巻) CO2と加湿雰囲気 37 ° C の定温器にフラスコを配置します。細胞の少なくとも 12 時間の接続を許可します。
- 80-100% 合流まで約 3-7 日間細胞を孵化させなさい。2-3 日毎の培養培地を変更します。
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KHOS A を分割し、-n 個のセル
- フラスコから文化メディアを削除します。
- 洗浄 5 mL 滅菌 PBS のセル (1 x) カルシウムとマグネシウム、非付着性のセルまたは分数を削除するなし。
- フラスコ、1 mL 0.05% トリプシン EDTA 溶液を追加し、簡単にトリプシン-EDTA が均等に分散されるようにフラスコを旋回します。
- 37 ° C の定温器で 2 〜 3 分または室温で 3-5 分のフラスコを孵化させなさい。セルは切り上げし、切り離されたことを確認する約 400 倍の倍率での顕微鏡の下のセルを確認します。
- セルを取り外したら、一度培地 10 mL を追加し、そっとピペット 10 mL のピペットを使用して単一細胞懸濁液に細胞集塊を破るために数回上下中。
- 細胞カウンターを使用してセルをカウントします。2 × 10 の6セルの密度または 1:4 の比率で新しい T75 フラスコに細胞懸濁液をシードします。
- QPI 実験のため播種する前に 80-100% の合流点に成長する細胞を許可します。
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KHOS A シードと QPI の - n 個のセル
- シード KHOS A とセル カウンター カウント後培地 5 mL を 50,000 300,000 細胞/ウェルの密度で 6 ウェル プレートで - n 個のセル。
注: 播種密度は細胞増殖率およびイメージングの期間に依存するために < 100% 取得、イメージング中に合流。 - 添付ファイルを許可するように少なくとも 12 時間のセルを孵化させなさい。
- QPI を行う前に新鮮なメディア媒体を変更します。
- シード KHOS A とセル カウンター カウント後培地 5 mL を 50,000 300,000 細胞/ウェルの密度で 6 ウェル プレートで - n 個のセル。
2. QPI 買収
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カバー スリップを設定
- 脱イオン水を実行して数回の洗浄によってカバー スリップをきれいにし、カバー スリップを入れ乾燥滅菌層流フード 15 分の浸漬で 75% エタノール溶液で消毒します。
- 明白な泡を避けるために 6 ウェル プレート カバー スリップを慎重に配置します。カバー スリップの下が文化メディア (最小 5 mL/ウェル) に没頭していることを確認します。
- (37 ° C、5% CO2、および加湿雰囲気) 少なくとも 15 分平衡にインキュベーターにプレートを配置します。カバー スリップ上に霧を形成、それをきれいに拭くため滅菌綿棒を使用します。
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顕微鏡で細胞のイメージング
- 露出時間、パターン コントラスト、およびホログラム ノイズの自己校正を含むシステムを初期化するソフトウェアを開きます。値が許容される (緑または黄色の範囲で表示) を確認します。
- QPI 顕微鏡のステージ上に 6 ウェル プレートを配置します。
- 「Live Capture"をクリックしてし「ソフトウェア フォーカス」で「手動」を選択「顕微鏡の設定」の作業距離を調整することによって細胞の位相画像を粗く集中位相画像のセルのアウトラインを取得しますします。「ソフトウェア フォーカス」で、「自動」に変更します。
- 「新しい実験」をクリックして新しいテストを作成します。テンキー、マウスまたは矢印キーを使用してイメージの取得位置の選択を開始します。各選択した後「保存」をクリックします。通常の各サンプルに対して 3-5 場所が選択されます。
- 「タイムラプス」セクションのイメージの間隔と期間を設定します。
注: がん細胞を明確に追跡するには、間隔が 5 分 48 時間は組み合わせ QPI 分析の期間として設定より短いでする必要があります。 - 「キャプチャ」をクリックして自動的に焦点を当て、設定の時点で画像を取得する実験を開始します。
3. データ分析
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細胞の形態解析
- 「細胞を識別」をクリックバック グラウンド ノイズからのセル領域が分離できるように、「背景のしきい値」の数値の設定を調整します。「オブジェクト サイズ」の設定数を調整それぞれセルに 1 つの核を確認しますします。比較する必要がある最終的な面積と体積の測定に影響を与える可能性がありますこれらのサンプルのための一貫したパラメーターを維持します。手動で必要な場合、「手動で変更、」を使用して、セル セグメントを変更します。
- ソフトウェアの「データの分析」関数を使用して、セル分析。「新分析」をクリックしてして新しいデータ解析をを開始します。セル領域 (2μ m)、光学膜厚 (μ m)、ボリューム (μ3) すべての個々 のセルに対してなど「ソース フレーム」タブと細胞形態のパラメーターに選択した画像をドラッグします。表や図としての散布図のプロットやヒストグラム モードとエクスポート データを選択します。
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細胞増殖の解析
- (例えば初期、12 h、24 h、36 h、および 48 h) 興味の別の時間ポイントの少なくとも 5 枚の画像を選択します。ソフトウェアによって提供されるレコードの携帯番号。
- 倍加時間を推定するには、初期の番号の正規化後細胞数をプロットし、指数関数的成長曲線にフィットします。
-
細胞運動解析
- ソフトウェアの「細胞を追跡する」関数を使用します。「新分析」をクリックして新しいデータ分析を開始します。(例えば、24 時間培養後 4 h)、「ソース フレーム」タブに選択した時間帯のイメージのドラッグ シリーズ ランダムに「セルを追加」選択モード下のセルをクリックしてして 10-30 セルを選択します。エッジとそれらのビューのフィールドの外に移動セルを除外します。
- 一連の画像でトラッキングを入念にチェックします。システムはセルのトラックを失うまたは誤ったセルを追跡、こと手動でセルの位置を変更するのには「選択」モードの下で追跡携帯を調整細胞を識別するために「識別する」をクリックするか、「場所の変更」をクリック。
- 「プロット運動」におけるセル軌道バラ プロットまたは移行率直さ、移行 (μ m) (μ m) の運動運動速度 (μ m/h) などの「印刷機能」で、そのほかの運動関連パラメーターのプロットを選択します。データを表や図としてエクスポートします。
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Representative Results
図 1は、典型的な細胞形態特性を示しています。画像は、ホログラフィー (図 1 aB) と 2次元画像 (図 1D) として掲載されています。(屈折率と光路長から計算) 光学セルの厚さは線またはセル全体の測定で定量化しました。散布図の面積と厚み KHOS A と図 1E-g、これらの 2 つの表現型が異なる分布を表示されるように、セル全体を測定 KHOS N セルがプロットされました。ヒストグラム (図 1 HM) またはエクスポートされたファイルからの平均の数字を示した KHOS A 細胞細胞領域が小さいと KHOS N 細胞より大きい厚さがあること。
細胞カウンター機能を使用すると、細胞増殖のプロファイル (図 2) が得られました。これらは KHOS A 間に有意差を示さなかったと - n 個のセル。さらに、細胞倍加時間は増殖曲線 (すなわち24-26 h)、また有意差は見られなかったから推定できます。
図 3AD KHOS A の典型的な追跡と非指向性 (ランダム) に - n 個のセル動作モードと対応する軌道。平均細胞運動 (図 3E-F)、運動速度(図 3-H)、移行距離(図 3 iJ)、および移行率直(図 3 K-L)と録音時間をプロットしました。KHOS A 細胞 KHOS N 細胞と比較して、運動速度、運動と移動の長距離で結果を示した。
図 1: 細胞形態解析します。(B)KHOS A (A)および-n 細胞(B)定量的なの代表的なホログラフィー位相イメージングです。スケール バーは、191.4 μ m くぼみ右下隅に画像の青い線の光学的厚さの定量的ライン プロファイルが表示です。(C ・ D)代表 QPI KHOS A (C)と -N 細胞(D)のセル分割の画像。スケール バーでは 100 μ m の範囲セル端は定量化のため除外されました。(E ・ G)KHOS A (E)および-n 細胞(F)内の各セルの面積と厚みを測定。各ドットは、個々 のセルを表します (n = 200-300)。重複プロット(G) KHOS の大幅に異なる分散パターンを示しています- と - n 個のセル。(H ・ M)セル厚のヒストグラム(H-私)、KHOS A (H、J、L) 、N (J K)、面積と体積(L ・ M)分布細胞(I, K, M)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 細胞の増殖特性。上部のパネルは、セルの番号をカウントするための代表的なセル分割を示しています。スケール バーは、100 μ m です。下のパネルは、対応する計算された細胞増殖率を示しています。データは、平均 ± 標準偏差として提示されます。スチューデントの t 検定 (ペア、2 尾) は、統計分析に使用されました。テストの結果が重要と見なされるときp < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 細胞運動解析します。(B)代表的な細胞追跡画像 KHOS A (A)と -N (B)細胞。スケール バーでは 100 μ m の範囲選択したセルが異なる色で記載されています。細胞運動の記録 4 h の期間対応する色の線が表示されます。(C ・ D)原点 (0, 0) の点から KHOS A (C)と-n (D)セルのセルの軌跡がプロットされます。それぞれの行は、個々 のセルを表します。KHOS A 細胞は KHOS N 細胞と比較してより分散したパターンを示した (n = 10)。(E L)定量的パラメーターを記録した細胞運動 KHOS A の調査の期間中に(E、G、I、K) -N (F、H、J、L)を含む細胞細胞運動(E ・ F)、運動速度(G ・ H)、移行距離(私の J と)、および移行率直さ(K L)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究生体外で、非侵襲的、無料のラベルを用いた QPI ひと骨肉腫細胞の血管新生と血管新生以外の表現型を特徴づける定量的をについて説明します。増殖率、倍加時間、移行の率直さ、運動速度、移行と運動細胞容積、セル厚セル領域を含むこの統合、ハイスループット法による細胞の複数のパラメーターを同時に分析されています。
細胞の形態や細胞の挙動を評価する従来法と比較して, このメソッドだけでなく、時間と労力を節約できますより正確で詳細な情報も提供します。たとえば、QPI システム (セル インキュベーター) 内の場所は、周囲環境 (部屋の温度と雰囲気)23で撮影するなどの環境変化から障害を低減します。さらに、光学セル厚及び位相シフトから変換されたボリュームを取得でした QPI とセル領域のみが伝統的な細胞イメージング プロセスによって測定される一方。QPI のこの機能は、異なる細胞の表現型の量的な比較のためのより詳細な情報を生成します。
興味のセルの適切な播種密度は現在の方法で重要です。イメージング買収段階で細胞のイメージング買収可能性がありますのみ実行されること 1 つの焦点のパネルは、z の部分の情報を失う可能性がありますこのコヒーレント QPI 技法の制限によりコンフルエント単層よりも少ないことが期待されて方向 (すなわち、オーバーレイされるセル)。さらに、QPI を使用して特徴は細胞外マトリックスの z 方向に細胞浸潤に最適ではない 2 D の形式に限定されます。複数のプリセット焦点距離将来 QPI の方法論の開発が必要です。
セルのカウントに加えて、QPI イメージングはまた追加ラベル21,23,24なし細胞の有糸分裂を調査するための有益な画像を提供します。細胞分裂は、セル面積と体積の明白な減少によって簡単に認識された、客観的・定量的定義し、単一細胞の細胞周期の段階を区別する機能はまだ確立します。この機能は、細胞解析、幹細胞の分化、薬剤応答、細胞周期の停止に関して研究を大幅に促進するでしょう。
定量的、ラベル無料、使いやすいという利点のため有用な臨床アプリケーション25,26,27,28,29,30 をこのメソッドがあります。.たとえば、このシステムは、ひと腫瘍における休眠とアクティブなセルを含む異種細胞集団の特性で利用できます。休止状態とアクティブな癌細胞間特徴付けられるセルの形態学的および行動の違いは、ひとがんで腫瘍休眠の分子メカニズムを解読する可能性があります使用できます。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
作者は感謝して乳房がん研究振興財団と高度な医療研究財団のサポートを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T75 flask | Corning, NY, USA | 353136 | |
| 6-well plates | Corning, NY, USA | 3506 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals, GA, USA | S11550 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 10010023 | |
| Beckman Z1 Coulter counter | Beckman Coulter, IN, USA | Z1 | |
| HoloMonitor M4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | M4 | Microscope |
| Hololid | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | PHI 8020 | |
| HStudioM4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | HStudioM4 | Software |
References
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Harper, J., Moses, M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS. (96), 223-268 (2006).
- Naumov, G. N., et al. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).
- Fang, J., et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).
- Almog, N., et al. Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype. Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).
- Hu, J., et al. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).
- Harper, J., et al. Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24. Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).
- Jia, D., et al. Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo. Blood. 121 (4), 707-715 (2013).
- Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).
- Almog, N., et al. Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).
- Almog, N., et al. Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype. PloS One. 7 (8), e44001 (2012).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PloS One. 7 (9), e44395 (2012).
- Almog, N., et al. Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190. Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).
- Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).
- Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).
- Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw-Hill: New York. (2011).
- Lee, K., et al. Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
- Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G.
- Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information. Scientific Reports. 3, 2369 (2013).
- Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells. PloS One. 9 (9), e106546 (2014).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PloS One. 9 (2), e89000 (2014).
- Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy. Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).
- Park, Y., et al. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).
- Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. Real time blood testing using quantitative phase imaging. PloS One. 8 (2), e55676 (2013).
- Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 5, 9976 (2015).
- Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, 34257 (2016).
- Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry. Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).
