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Cancer Research

एक समय चूक, लेबल मुक्त, मात्रात्मक और सक्रिय मानव कैंसर कोशिकाओं के गुणात्मक चरण इमेजिंग अध्ययन

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/57035
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School and Boston Children's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

निष्क्रिय और सक्रिय कैंसर कोशिका phenotypes मात्रात्मक चरण इमेजिंग का उपयोग विशेषता थे । सेल प्रसार, प्रवास, और आकृति विज्ञान परख एकीकृत और एक सरल विधि में विश्लेषण किया गया ।

Abstract

angiogenic phenotype के अधिग्रहण ट्यूमर निद्रा से बचने का एक आवश्यक घटक है । हालांकि इन विट्रो परख (जैसे, प्रसार, प्रवास, और अंय) में कई क्लासिक और vivo में मॉडल की जांच करने के लिए विकसित किया गया है और angiogenic और गैर angiogenic सेल phenotypes की विशेषता है, इन तरीकों समय है और गहन श्रम, और अक्सर महंगी एजेंट और उपकरणों की आवश्यकता है, साथ ही महत्वपूर्ण विशेषज्ञता । हाल के एक अध्ययन में, हमने angiogenic और गैर-angiogenic मानव ऑस्टियो खोस कोशिकाओं के समय-चूक और लेबलिंग-फ़्री characterizations का संचालन करने के लिए एक उपंयास मात्रात्मक चरण इमेजिंग (QPI) तकनीक का उपयोग किया । सेल आकृति विज्ञान, प्रसार, और गतिशीलता सहित सेलुलर मापदंडों का एक पैनल, मात्रात्मक मापा और QPI का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । इस उपंयास और मात्रात्मक दृष्टिकोण को लगातार और गैर इनवेसिव प्रासंगिक सेलुलर प्रक्रियाओं, व्यवहार का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है, और कैंसर की कोशिकाओं और एक सरल और एकीकृत तरीके से अंय प्रकार के सेल के लक्षण । यह रिपोर्ट हमारे प्रायोगिक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है, जिसमें सेल तैयारी, QPI अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण शामिल है ।

Introduction

एक ठोस ट्यूमर के विकास और प्रगति में सबसे जल्द चौकियों में से एक angiogenic phenotype, कैंसर की एक बानगी के अधिग्रहण है । इस प्रगति जैव रासायनिक और आणविक प्रक्रियाओं की एक किस्म शामिल है1,2,3। ट्यूमर प्रगति में इस महत्वपूर्ण कदम के अध्ययन में एक तकनीकी चुनौती उपकरण की कमी के लिए लगातार और मात्रात्मक विशेषताएं और angiogenic और गैर angiogenic phenotypes के बीच एक निष्पक्ष तरीके से जीवित कैंसर कोशिकाओं के अंतर है । पारंपरिक परख के सेलुलर व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा angiogenic और गैर angiogenic कोशिकाओं को आम तौर पर महंगी रिएजेंट और उपकरणों की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, सेल प्रसार/5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 या vivo मूल्यांकन4,5,6,8,15,16, साथ ही महत्वपूर्ण विशेषज्ञता और गहन की आवश्यकता में पूरक समय और श्रम की खपत ।

हाल ही में, मात्रात्मक चरण इमेजिंग (QPI) सेल आकृति विज्ञान और व्यवहार मापदंडों की एक किस्म का समय चूक और लेबलिंग मुक्त मूल्यांकन में सक्षम बनाता है कि एक उपंयास तकनीक के रूप में उभरा है17,18,19, 20 , 21 , 22. पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के विपरीत, एक ऑप्टिकल वस्तु के माध्यम से प्रकाश गुजरता के बाद पिक्सेल द्वारा चरण shift पिक्सेल के QPI quantifies रूपांतरों, और परिवर्तित ऑप्टिकल मोटाई और मात्रा के साथ एक हाथ को खंगाला, इस प्रकार प्रत्यक्ष सक्षम लाइव कोशिकाओं और निम्नलिखित सुविधाओं का विश्लेषण: (1) मात्रात्मक इमेजिंग, (2) गैर इनवेसिव और समय चूक इमेजिंग, (3) लेबल मुक्त इमेजिंग, और (4) एक साथ बहु-पैरामीटर इमेजिंग. इन सुविधाओं QPI एक शक्तिशाली उपकरण का आकलन करने और सेलुलर स्तर पर रोग प्रक्रियाओं को समझने के लिए बनाते हैं ।

हाल के एक अध्ययन में, हम QPI उपयोग के लिए मात्रात्मक विशेषताएं और angiogenic खोस के बीच अंतर-एक और गैर angiogenic खोस-N एक व्यवस्थित और मात्रात्मक तरीके से मानव phenotypes कोशिकाओं के ऑस्टियो, कोशिका आकृति विज्ञान के विश्लेषण के संयोजन, प्रसार, और गतिशीलता23। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, सेल रूपात्मक और व्यवहार मापदंडों का एक पैनल का उपयोग मात्रात्मक angiogenic और गैर angiogenic मानव ऑस्टियो कोशिकाओं के बीच तुलना में थे और पांच विशिष्ट अंतर इन दोनों के बीच की पहचान की गई phenotypes । यह उपंयास दृष्टिकोण जैविक रूप से प्रासंगिक सेलुलर विशेषताओं की एक किस्म का आकलन करने के लिए एक एकीकृत और मात्रात्मक मंच प्रदान करता है ।

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Protocol

यहां बताई गई सभी विधियों को बोस्टन चिल्ड्रन अस्पताल की संस्थागत सी-सेफ्टी कमेटी ने मंजूरी दे दी है ।

1. सेल की तैयारी

  1. गल खोस-ए और एन कोशिकाओं
    1. संस्कृति माध्यम गर्म, यानी, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% (vol/भ्रूण बछड़ा सीरम (FBS) और 1% (vol/) पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक ।
    2. तरल नाइट्रोजन टैंक से कोशिकाओं के क्रायोजेनिक शीशियों लो, एक ३७ ° c पानी स्नान में गर्म पानी में शीशियों के नीचे विसर्जित, और धीरे से गल प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए क्रायोजेनिक शीशियों हिला । जल से संपर्क करने से क्रायोजेनिक शीशियों का ढक्कन रखें ताकि संदूषण से बचा जा सके । जैसे ही कोशिकाएं गल जाती हैं, ७०% इथेनॉल समाधान का छिड़काव करके क्रायोजेनिक शीशी को निष्फल कर शीशी को पोंछते हैं ।
    3. एक लामिना फ्लो हुड में, तुरंत क्रायोजेनिक शीशी से सेल निलंबन महाप्राण, और धीरे से 10 मिलीलीटर गर्म संस्कृति मध्यम में निलंबित (1.1.1 में वर्णित) । 5-7 मिनट के लिए लगभग २०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
    4. 10 मिलीलीटर गर्म संस्कृति माध्यम से सेल गोली reसस्पेंड, और एक T75 कुप्पी में स्थानांतरण । धीरे से कई बार पिपेट समान रूप से एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए ।
    5. एक ३७ ° c मशीन में कुप्पी प्लेस 5% (vol/CO2 और humidified वातावरण के साथ । कक्षों को कम से 12 h के लिए अनुलग्न करने की अनुमति दें ।
    6. ८० तक लगभग 3-7 दिनों के लिए गर्मी कोशिकाओं-१००% धाराप्रवाह । संस्कृति माध्यम को हर 2-3 दिन में बदलें ।
  2. विभाजन खोस-A और-N कक्ष
    1. संस्कृति मीडिया को कुप्पी से हटा दें ।
    2. गैर अनुयाई कोशिकाओं या अंश को दूर करने के लिए, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना 5 मिलीलीटर बाँझ पंजाबियों (1x) के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    3. 1 मिलीलीटर ०.०५% जोड़ें Trypsin-कुप्पी में EDTA समाधान है, और संक्षेप में कुप्पी भंवर को सुनिश्चित करना है कि Trypsin-EDTA समान रूप से फैलाया है ।
    4. कमरे के तापमान पर एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन या 3-5 मिनट में 2-3 मिनट के लिए कुप्पी की मशीन । कोशिकाओं को गोल और अलग कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए लगभग 400x आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें.
    5. एक बार कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, 10 मिलीलीटर संस्कृति मध्यम और धीरे से मध्यम ऊपर और नीचे कई बार पिपेट एक सेल में एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर निलंबन को तोड़ने के लिए जोड़ रहे हैं ।
    6. किसी कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्ष गिनना । बीज नई T75 कुप्पी में 2 × 106 कोशिकाओं या 1:4 के अनुपात के घनत्व पर सेल निलंबन ।
    7. QPI प्रयोग के लिए बीज बोने से पहले कोशिकाओं को ८०-१००% तक बढ़ने की अनुमति दें ।
  3. सीडिंग खोस-A and-N cells for QPI
    1. बीज खोस-a और-N कोशिकाओं में 6-well प्लेट्स ५०,००० के घनत्व पर-३००,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक सेल काउंटर के साथ गिनती के बाद 5 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम के साथ ।
      नोट: इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान < 100% संगम करने के लिए सीडिंग घनत्व कोशिका प्रसार दर, और इमेजिंग समय अवधि पर निर्भर है ।
    2. अनुलग्नक की अनुमति देने के लिए कम से 12 h के लिए कक्षों की मशीन ।
    3. QPI आयोजित करने से पहले ताजा मीडिया के साथ माध्यम बदलें ।

2. QPI अधिग्रहण

  1. कवर स्लिप सेट अप
    1. स्वच्छ पानी चल रहा है और 15 मिनट के लिए विसर्जन से ७५% इथेनॉल समाधान के साथ बंध्याकरण के साथ कई बार धोने के द्वारा कवर पर्ची साफ । एक बाँझ लामिना प्रवाह हुड में कवर पर्ची सूखी करने के लिए रखो ।
    2. ध्यान से एक 6-अच्छी तरह से प्लेट पर कवर स्लिप जगह स्पष्ट बुलबुले से बचने के लिए । यह सुनिश्चित करें कि कवर स्लिप के नीचे कल्चरल मीडिया में डूबे (न्यूनतम 5 एमएल/
    3. मशीन में प्लेट प्लेस (३७ ° c, 5% CO2, और humidified वातावरण) के लिए equilibrate करने के लिए ंयूनतम 15 मिनट । अगर कवर पर्ची पर कोहरे रूपों, एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए यह साफ पोंछ ।
  2. एक खुर्दबीन के साथ इमेजिंग कोशिकाओं
    1. सिस्टम को प्रारंभ करने के लिए सॉफ़्टवेयर खोलें, जिसमें एक्सपोज़र समय, प्रतिमान कंट्रास्ट, और होलोग्राम शोर के अंशांकन शामिल हैं । सुनिश्चित करें कि मान स्वीकार्य है (हरी या पीली श्रेणी में दिखाया गया है) ।
    2. 6-खैर प्लेट को QPI माइक्रोस्कोप के स्टेज पर रखें ।
    3. "लाइव कैप्चर" पर क्लिक करें और "मैन्युअल" में सॉफ़्टवेयर फ़ोकस चुनें. मोटे चरण छवियों में कोशिकाओं के लिए रूपरेखा प्राप्त करने के लिए "माइक्रोस्कोप सेटिंग" में काम दूरी का समायोजन करके कोशिकाओं के चरण छवियों को ध्यान केंद्रित. "सॉफ़्टवेयर फ़ोकस" में "स्वचालित" में परिवर्तित करें ।
    4. नया प्रयोग बनाने के लिए "नया प्रयोग" पर क्लिक करें । माउस या संख्यात्मक पैड पर तीर कुंजियों का उपयोग कर छवि अधिग्रहण पदों के चयन के साथ शुरू करो । प्रत्येक चयन के बाद "याद रखें" क्लिक करें । सामान्य रूप से प्रत्येक नमूने के लिए 3-5 स्थान चयनित हैं.
    5. "डीकॉक" खंड में इमेजिंग अंतराल और समय अवधि सेट करें ।
      नोट: कैंसर कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से ट्रैक करने के लिए, अंतराल से कम होना चाहिए 5 min. ४८ घंटे संयोजन QPI विश्लेषण के लिए समय अवधि के रूप में सेट किया गया है.
    6. "कैप्चर" पर क्लिक करके प्रयोग शुरू करें, जो स्वचालित रूप से ध्यान केंद्रित करेगा और सेटिंग समय बिंदुओं पर छवियों को प्राप्त करेंगे ।

3. डेटा विश्लेषण

  1. कक्ष आकृति विज्ञान विश्लेषण
    1. "कक्षों को पहचानें" क्लिक करें । "पृष्ठभूमि थ्रेशोल्ड" के लिए संख्यात्मक सेटिंग समायोजित करें ताकि कक्ष क्षेत्र पृष्ठभूमि शोर से अच्छी तरह से अलग हो जाएँ. प्रत्येक कक्ष एक नाभिक है सुनिश्चित करने के लिए "ऑब्जेक्ट आकार" के लिए सेटिंग संख्या समायोजित करें । नमूनों की तुलना करने की आवश्यकता के लिए संगत पैरामीटर बनाए रखें, क्योंकि ये अंतिम क्षेत्र और वॉल्यूम माप को प्रभावित कर सकते हैं । यदि आवश्यक हो, तो "मैंयुअल परिवर्तन" का उपयोग करके कक्ष खंडों को मैंयुअली संशोधित करें ।
    2. कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर में "विश्लेषण डेटा" समारोह का उपयोग करें. "नया विश्लेषण" पर क्लिक करके एक नया डेटा विश्लेषण प्रारंभ करें. चयनित छवियों को "स्रोत फ़्रेम" टैब में ड्रैग करें और कक्ष आकृति विज्ञान पैरामीटर्स सहित सेल क्षेत्र (µm2), ऑप्टिकल मोटाई (µm), और प्रत्येक व्यक्ति कक्ष के लिए वॉल्यूम (µm3) । स्कैटर प्लॉट या हिस्टोग्राम मोड चुनें और डेटा को तालिकाओं या आंकड़ों के रूप में निर्यात करें.
  2. सेल प्रसार विश्लेषण
    1. ब्याज के विभिन्न समय बिंदुओं (उदा., प्रारंभिक, 12 h, 24 h, ३६ h, और ४८ h) के लिए कम से कम 5 छवियों का चयन करें । सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए कक्ष क्रमांक रिकॉर्ड करना ।
    2. दोहरीकरण समय का अनुमान करने के लिए, प्रारंभिक संख्या के साथ सामांय और घातीय वृद्धि curves के साथ फिट के बाद भूखंड सेल नंबर ।
  3. सेल प्रस्ताव विश्लेषण
    1. सॉफ्टवेयर में "ट्रैक सेल" समारोह का प्रयोग करें । नया डेटा विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए "नया विश्लेषण" क्लिक करें । खींचें एक चयनित समय अवधि के लिए छवियों की श्रृंखला (उदा, 4 एच के बाद 24 एच मशीन) "स्रोत फ्रेम" टैब में । "कक्ष जोड़ें" चयन मोड के अंतर्गत कक्षों पर क्लिक करके 10-30 कक्षों को बेतरतीब ढंग से चुनें. किनारों पर कोशिकाओं और देखने के क्षेत्र से बाहर जाने वालों को छोड़ दें ।
    2. ध्यान से छवियों की श्रृंखला में ट्रैकिंग की जांच करें । घटना में है कि सिस्टम एक सेल का ट्रैक खो देता है या गलत सेल पटरियों, मैंयुअल रूप से ट्रैकिंग सेल पर क्लिक करके "पहचान" कक्षों की पहचान करने या कक्ष स्थान को संशोधित करने के लिए "का चयन करें" मोड के अंतर्गत "संशोधित स्थान" पर क्लिक करके समायोजित करें ।
    3. "प्लॉट की सुविधा" में अन्य गति से संबंधित मापदंडों के लिए "साजिश आंदोलन" या साजिश में सेल पथ के गुलाब भूखंड चुनें, जैसे गतिशीलता गति (µm/एच), गतिशीलता (µm), माइग्रेशन (µm), और माइग्रेशन निर्देश । डेटा को तालिकाओं या आंकड़ों के रूप में निर्यात करें ।

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Representative Results

चित्र 1 एक विशिष्ट कक्ष आकृति विज्ञान के लक्षण चित्रण को दर्शाया गया है । छवियां holographs (चित्र 1a-B) और 2d छवियां (चित्र 1C-D) के रूप में प्रस्तुत की गई हैं । ऑप्टिकल सेल मोटाई (अपवर्तन सूचकांक और ऑप्टिकल पथ लंबाई से गणना) लाइन प्रोफ़ाइल या एक पूरे सेल माप के माध्यम से quantified हैं । क्षेत्र और खोस की मोटाई-a और खोस-N एक पूरे सेल के लिए मापा कोशिकाओं के तितर बितर भूखंडों प्लॉट किए गए थे, के रूप में चित्रा 1E-जी, जहां इन दो phenotypes विभिंन वितरण पैटर्न प्रदर्शित । हिस्टोग्राम (चित्रA-M) या निर्यात की गई फ़ाइलों की औसत संख्याओं ने दर्शाया है कि खोस-A कक्षों में खोस-N कक्षों की तुलना में छोटे कक्ष क्षेत्र और अधिक मोटाई हैं ।

कक्ष काउंटर फ़ंक्शन का उपयोग करके, कक्ष प्रसार प्रोफ़ाइल (चित्र 2) प्राप्त किए गए थे । इन खोस-a और-N कक्षों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा । इसके अलावा, सेल दोहरीकरण समय प्रसार वक्र (यानी, 24-26 ज) से अनुमान लगाया जा सकता है, जो भी महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा था ।

चित्र 3 ए -डी गैर-दिशात्मक (यादृच्छिक) गति मोड और इसी पथ में खोस-A और-N कोशिकाओं की विशिष्ट ट्रैकिंग से पता चलता है. औसत सेल गतिशीलता (फिगर 3E-F), गतिशीलता स्पीड (फिगर 3जी-एच), माइग्रेशन दूरी (फिगर 3I-J), और माइग्रेशन डायरेक्टर (फिगर 3K-L) रिकॉर्डिंग समय बनाम साजिश रची गई । खोस-N कोशिकाओं की तुलना में, खोस-एक कोशिकाओं को अधिक से अधिक गतिशीलता गति दिखाया, अब गतिशीलता और प्रवास दूरी में जिसके परिणामस्वरूप ।

Figure 1
चित्र 1: कक्ष आकृति विज्ञान लक्षण वर्णन. (A-B) खोस-a (a) और-N कक्षों के प्रतिनिधि holographs (B) मात्रात्मक चरण इमेजिंग द्वारा । स्केल बार सही नीचे कोने में १९१.४ µm. unpresets है नीले रंग की रेखा छवियों में तैयार के लिए ऑप्टिकल मोटाई के मात्रात्मक रेखा प्रोफ़ाइल दिखाओ । (सी-डी) प्रतिनिधि QPI खोस-A (C) और-N कक्षों के लिए कक्ष विभाजन की छवियां (D)। स्केल बार १०० µm है । किनारों पर कक्षों को ठहराव के लिए बहिष्कृत कर दिया गया था. (E-G) मापा मोटाई बनाम क्षेत्र खोस के व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए-A (E) और-N कक्ष (F)। प्रत्येक बिंदु एक व्यक्तिगत कक्ष (n = २००-३००) का प्रतिनिधित्व करता है । अधिव्याप्त प्लॉट (G) खोस-A और-N कक्षों के लिए काफी भिंन फैलाव प्रतिमान दिखाता है । (एच-एम) सेल मोटाई के हिस्टोग्राम (एच-I), क्षेत्र (जम्मू-कश्मीर), और खंड (एल-एम) खोस के लिए वितरण-A (एच, जे, एल) और-N कोशिकाओं (मैं, कश्मीर, एम)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल प्रसार लक्षण वर्णन. ऊपरी पैनल कक्ष संख्या गिनती के लिए प्रतिनिधि सेल विभाजन से पता चलता है । स्केल बार १०० µm है । नीचे पैनल इसी गणना सेल प्रसार दर से पता चलता है । डेटा मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया है । छात्र का टी टेस्ट (ख़राब, दो पूंछ) सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था । परीक्षण परिणाम महत्वपूर्ण माने गए थे जब p < 0.05 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल प्रस्ताव लक्षण वर्णन. (A-B) प्रतिनिधि सेल ट्रैकिंग छवियां खोस-a (a) और-N (B) कक्षों के लिए । स्केल बार १०० µm है । चयनित कक्ष भिंन रंगों के साथ बाह्यरेखांकित किए गए हैं । सेल गतिशीलता एक 4 ज समय अवधि में दर्ज की इसी रंग की रेखा के साथ प्रस्तुत किया है । (सी-डी) खोस की कोशिका पथ-A (C) और-N (D) कक्षों की मूल बिंदु से प्लॉट की गई (0, 0) । प्रत्येक पंक्ति एक अलग कक्ष का प्रतिनिधित्व करती है । खोस-एक कोशिकाओं खोस-n कोशिकाओं (n = 10) के साथ तुलना में अधिक फैलाया पैटर्न दिखाया. (ई-एल) खोस की सेल गति के लिए जांच की समय अवधि के दौरान मात्रात्मक मापदंडों दर्ज-एक (ई, g, I, K) और-N (F, h, J, L) कक्ष, जिनमें सेल गतिशीलता (E-F), गतिशीलता गति (G-h), माइग्रेशन दूरी (I-J ), और माइग्रेशन निर्देशन (K-L)। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम एक इन विट्रो, गैर इनवेसिव, और लेबल मुक्त विधि QPI का उपयोग करने के लिए मात्रात्मक angiogenic और मानव ऑस्टियो कोशिकाओं के गैर angiogenic phenotypes की विशेषता का वर्णन । एकाधिक सेलुलर मापदंडों इस एकीकृत, उच्च प्रवाह विधि, सेल क्षेत्र, सेल मोटाई, सेल मात्रा, प्रसार दर, दोहरीकरण समय, माइग्रेशन डायरेक्टर, गतिशीलता गति, प्रवासन, और गतिशीलता सहित द्वारा एक साथ विश्लेषण किया गया है ।

पारंपरिक परख कि सेल आकृति विज्ञान और सेल व्यवहार का आकलन के साथ तुलना में, इस विधि न केवल समय और परिश्रम की बचत होती है, लेकिन यह भी अधिक सटीक और विस्तृत जानकारी प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, QPI प्रणाली के स्थान (कक्ष मशीन के अंदर) एक परिवेश वातावरण में फोटो खिंचवाने जैसे पर्यावरण परिवर्तन से गड़बड़ी कम कर देता है (कमरे के तापमान और वातावरण)23। इसके अलावा, ऑप्टिकल सेल मोटाई और मात्रा, चरण पाली से परिवर्तित, QPI के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जबकि केवल सेल क्षेत्र पारंपरिक सेल इमेजिंग प्रक्रिया द्वारा मापा जाता है । QPI की यह सुविधा विभिन्न कोशिका phenotypes की मात्रात्मक तुलना के लिए अधिक विस्तृत जानकारी उत्पन्न करती है.

ब्याज की कोशिकाओं का उचित बीज घनत्व वर्तमान पद्धति में महत्वपूर्ण है । इमेजिंग अधिग्रहण चरण के दौरान, कोशिकाओं को एक धाराप्रवाह monolayer इस सुसंगत QPI तकनीक की कमी के कारण है कि इमेजिंग अधिग्रहण केवल एक फोकस पैनल है, जो z में आंशिक जानकारी खो सकते है के साथ किया जा सकता है की वजह से कम होने की उंमीद कर रहे है दिशा (अर्थात, मढ़ा हुआ कोशिकाएँ). इसके अलावा, characterizations QPI का उपयोग कर 2 डी प्रारूप है, जो extracellular मैट्रिक्स में जेड दिशा में सेल आक्रमण के लिए इष्टतम नहीं है तक ही सीमित हैं । कई पूर्व निर्धारित फोकल लंबाई भविष्य QPI पद्धति विकास के लिए आवश्यक हैं ।

सेल गिनती के अलावा, QPI इमेजिंग भी अतिरिक्त लेबलिंग21,23,24के बिना सेल बँटवारा का अध्ययन करने के लिए जानकारीपूर्ण चित्र प्रदान करता है । जबकि कोशिका विभाजन आसानी से सेल क्षेत्र और मात्रा में स्पष्ट कमी के द्वारा मांयता प्राप्त था, की क्षमता को निष्पक्ष और मात्रात्मक परिभाषित करने और एकल कोशिकाओं के लिए सेल चक्र चरणों अंतर अभी तक स्थापित किया जाना है । यह क्षमता काफी स्टेम सेल विभेद, दवा की प्रतिक्रिया के लिए सेल विश्लेषण के संबंध में अनुसंधान की सुविधा होगी, और सेल साइकिल की गिरफ्तारी ।

मात्रात्मक, लेबल मुक्त, और प्रयोग करने में आसान होने के फायदे के कारण, इस विधि भी उपयोगी नैदानिक अनुप्रयोगों हो सकता है25,26,27,28,29,30 . उदाहरण के लिए, इस प्रणाली विषम कोशिका आबादी, मानव ट्यूमर में निष्क्रिय और सक्रिय कोशिकाओं सहित के लक्षण वर्णन में उपयोग किया जा सकता है । विशेषता कोशिका रूपात्मक और निष्क्रिय और सक्रिय कैंसर कोशिकाओं के बीच व्यवहार मतभेदों को संभावित आणविक मानव कैंसर में निहित ट्यूमर निद्रा तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

लेखक कृतज्ञता स्तन कैंसर अनुसंधान फाउंडेशन और उंनत चिकित्सा अनुसंधान फाउंडेशन के समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T75 flask Corning, NY, USA 353136
6-well plates  Corning, NY, USA 3506
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 11965092
Fetal bovine serum (FBS)  Atlanta Biologicals, GA, USA S11550
Penicillin Streptomycin Thermo Fisher Scientific, MA, USA 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 10010023
Beckman Z1 Coulter counter Beckman Coulter, IN, USA Z1 
HoloMonitor M4 Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden M4 Microscope
Hololid Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden PHI 8020
HStudioM4 Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden HStudioM4 Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. J. Vis. Exp. (132), e57035, doi:10.3791/57035 (2018).

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