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Cancer Research

시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/57035
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School and Boston Children's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

휴면 및 활성 암 세포 고기 양적 위상 이미징 사용 하 여 특징 이었다. 셀 확산, 마이그레이션, 및 형태 분석 통합 되었고 한 간단한 방법을 분석.

Abstract

신생 표현 형의 인수 종양 휴면에서 탈출의 필수적인 구성 요소입니다. 여러 클래식 체 외에서 분석 실험 (예를들면, 확산, 마이그레이션, 등)와 모델 vivo에서 조사 하 고 신생 및 비 신생 셀 고기 특성화 개발 되었습니다 있지만이 메서드는 시간 노동 집약적인, 그리고 종종 필요한 상당한 전문 지식 뿐만 아니라 비싼 시 약 및 악기. 최근 연구에서 우리 신생 및 비 신생 인간 다리 KHOS 셀의 시간 경과 및 라벨 무료 characterizations을 소설 양적 위상 이미징 (QPI) 기법을 사용. 셀 형태, 운동 성, 확산, 등 세포 매개 변수 패널 양적 측정 되었다 고 QPI를 사용 하 여 분석. 이 소설과 양적 접근 지속적으로 및 비 접촉 관련 세포 프로세스, 행동, 그리고 암 세포의 특성 및 다른 세포 유형 간단 하 고 통합 된 방식으로 공부 하는 기회를 제공 합니다. 이 보고서에서는 셀 준비, QPI 수집 및 데이터 분석을 포함 하 여 우리의 실험 프로토콜을 설명 합니다.

Introduction

개발 및 단단한 종양의 진행 초기 검사점 중 신생 표현 형, 암 홀 마크의 인수입니다. 이 진행 포함 다양 한 생 화 학적 및 분자 프로세스1,2,3. 종양 진행이 키 단계 연구에서 기술 도전 도구를 지속적으로 하 고 양적 특성화 고 편견으로 라이브 암 세포의 신생 및 비 신생 고기 구별의 부족 이다. 보통 신생 및 비 신생 세포의 세포질 행동을 조사 하는 데 사용 되는 전통적인 분석 필요 비싼 시 약 및 기기, 예를 들어 셀 확산/마이그레이션 분석4,5, 실험 6,7,,89,10,11,12,13,14 또는 상당한 전문성과 집중을 요구 뿐만 아니라 보완 vivo에서 평가4,5,6,8,,1516, 시간과 노동 소비입니다.

최근, 양적 위상 이미징 (QPI) 다양 한 세포 형태 및 동작 매개 변수17,18,19, 의 시간 경과 및 라벨 무료 평가 가능 하 게 소설 기법으로 떠오르고 있다 20 , 21 , 22. 기존의 광학 현미경과 달리 QPI 단정 위상 변화에 의해 픽셀의 빛 광 개체를 통해 전달 되 고 변환 된 광학 두께와 볼륨, 자필을 재구성 한 후 직접 활성화 라이브 셀 및 다음 기능 분석: (1) 양적 이미징, (2) 비-침략 적 및 시간 경과 영상, (3) 라벨 무료 이미징, 및 (4) 동시 다중 매개 변수 영상. 이러한 기능을 평가 하 고 세포 수준에서 병 적인 프로세스를 이해 하는 강력한 도구 QPI를 확인 합니다.

최근 연구에서 활용 하는 양적 특성 및 신생 구별 QPI KHOS A 및 세포 형태학의 분석을 결합 하 여 체계적이 고 정량적으로 인간의 다리 셀의 비 신생 KHOS N 고기 확산, 그리고 운동 성23. 이미지 분석 소프트웨어, 패널을 사용 하 여 셀 형태학과 행동의 매개 변수가 양적 신생 및 비 신생 인간 다리 셀 사이의 비교 했다 그리고 5 특성 차이이 두 사이 발견 했다 고기입니다. 이 새로운 접근 방식을 다양 한 세포 생물학 관련 특성을 평가 하기 위한 통합 및 양적 플랫폼을 제공 합니다.

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Protocol

여기 설명 하는 모든 방법은 보스턴 어린이 병원 기관 Biosafety 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 세포 준비

  1. 녹고 KHOS-A 및-N 셀
    1. 따뜻한 문화 매체, 즉, 최대 Dulbecco의 10% (vol/vol) 태아 종 아리 혈 청 (FBS)와 1% (vol/vol) 페니실린/스 보충이 글 중간 수정.
    2. 액체 질소 탱크에서 세포의 극저온 튜브를가지고, 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 물에 튜브의 하단을 담가 그리고 부드럽게 녹고 프로세스를 가속 화 하기 위해 극저온 병을 흔들어. 오염을 방지 하기 위하여 물 접촉에서 극저온 튜브의 뚜껑을 유지. 최대한 빨리 셀은 해 동, 70% 에탄올 솔루션을 분사 하 고 유리병을 닦는 여 극저온 유리병을 소독.
    3. 층 류 두건에서 즉시 극저온 유리병에서 세포 현 탁 액을 발음 하 고 부드럽게 따뜻하게 10 mL의 배양 (1.1.1에서 설명)에 일시 중단 합니다. 5-7 분 약 200 x g에서 셀 정지 원심
    4. 예 열 10 mL 문화 매체와 셀 펠 릿 resuspend 그리고 T75 플라스 크로 전송. 부드럽게 균등 하 게 10 mL를 피펫으로 사용 하 여 셀 중단 여러 번 플라스틱.
    5. 5% (vol/vol) CO2 와 습도 분위기 37 ° C 배양 기에 플라스 크를 놓습니다. 셀 12 h 이상에 대 한 연결을 허용 합니다.
    6. 80-100% 합칠 때까지 약 3-7 일에 대 한 셀을 품 어. 2-3 일 마다 문화 매체를 변경 합니다.
  2. 분할 KHOS-A 및-N 셀
    1. 플라스 크에서 문화 미디어를 제거 합니다.
    2. 5 mL 살 균 PBS로 세포 세척 (1x) 칼슘과 마그네슘, 비 부착 셀 또는 제거 없이.
    3. 플라스 크에 1 mL 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션을 추가 하 고 간단히 트립 신-EDTA 균등 하 게 분산 되도록 플라스 크를 소용돌이.
    4. 37 ° C 배양 기에서 2-3 분 또는 실 온에서 3-5 분에 대 한 플라스 크를 품 어. 에 셀은 반올림 하 고 분리 되도록 약 400 배 확대 현미경으로 세포를 확인 합니다.
    5. 세포 분리는 일단 10 mL 문화 매체를 추가 하 고 부드럽게 헤어 10ml 피펫으로 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀 집계 여러 번 왔다 갔다 매체 플라스틱.
    6. 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 2 × 106 세포의 밀도 또는 1: 4의 비율에서 새로운 T75 플라스 크에 세포 현 탁 액을 시드하십시오.
    7. QPI 실험에 뿌리기 전에 80-100% 합류에 성장 하는 셀 수 있습니다.
  3. 시드 KHOS-A 및-N QPI 셀
    1. 씨 KHOS-A 및-N 셀의 50000-300000 셀/셀 카운터로 계산 후 5 mL 문화 매체와 밀도에서 6 잘 플레이트에
      참고: 시드 밀도에 따라 달라 집니다 셀 확산 속도 이미징 기간 하려면 < 이미징 수집 하는 동안 100% 합류.
    2. 첨부 파일을 허용 하도록 적어도 12 h에 대 한 셀을 품 어.
    3. QPI를 수행 하기 전에 신선한 미디어와 매체를 변경 합니다.

2. QPI 수집

  1. 커버 슬립 설정
    1. 커버 슬립 이온 물로 여러 번 헹 궈 서 깨끗 하 고 건조 살 균 층 류 두건으로 커버 슬립을 넣어 15 분에 대 한 침수에 의해 75% 에탄올 용액으로 소독.
    2. 신중 하 게 커버 슬립을 분명 거품을 피하기 위해 6-잘 접시에 놓습니다. 커버 슬립의 하단 문화 미디어 (최소 5 mL/음)에 몰입 됩니다 확인 하십시오.
    3. (37 ° C, 5% CO2, 그리고 습도 분위기) 적어도 15 분 동안 equilibrate 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 커버 슬립에 안개 형성 하는 경우에 멸 균 면봉을 사용 하 여 그것을 깨끗 하 게 닦아.
  2. 현미경으로 세포 이미징
    1. 노출 시간, 패턴 대비 및 홀로그램 잡음의 자기 보정을 포함 하 여 시스템을 초기화 하기 위해 소프트웨어를 엽니다. 값은 허용 (녹색 또는 노란색 범위에 표시 된) 다는 것을 확인 하십시오.
    2. 6 잘 플레이트 QPI 현미경의 스테이지에 배치 합니다.
    3. "라이브 캡처," 클릭 하 고 "소프트웨어 초점."에서 "수동"을 선택 개의 "현미경 설정"에서 작업 거리를 조정 하 여 셀의 위상 이미지를 초점 셀 단계 이미지에 대 한 개요를 얻을. "소프트웨어 초점."에서 "자동"으로 변경
    4. "새로운 실험"를 클릭 하 여 새 실험 만들기를. 숫자 패드에 마우스 또는 화살표 키를 사용 하 여 이미지 수집 위치의 선택으로 시작 합니다. 각 선택 후 "저장"을 클릭 합니다. 일반적으로 3-5 위치 각 샘플에 대 한 선택 됩니다.
    5. "Timelapse" 섹션에서 이미징 간격 및 기간을 설정 합니다.
      참고: 명확 하 게 암 세포를 추적, 간격 이어야 한다 짧은 보다 5 분 48 시간 조합 QPI 분석 기간으로 설정 됩니다.
    6. 자동으로 집중 하 고 설정 시간 지점에서 이미지를 "캡처"를 클릭 하 여 실험을 시작 합니다.

3. 데이터 분석

  1. 셀 형태 분석
    1. "셀을 식별 합니다." 클릭 셀 영역 배경 잡음 으로부터 잘 구분 되는 "배경 임계값"에 대 한 숫자 설정을 조정 합니다. "개체 크기"에 대 한 설정을 조정할 각 셀 한 핵에 있는지 확인 합니다. 이 마지막 지역 및 볼륨 측정에 영향을 미칠 수 있습니다 비교 될 필요가 있는 샘플에 대 한 일치 매개 변수를 유지 합니다. 필요한 경우 수동으로 "수동 변경,"를 사용 하 여 셀 세그먼트 수정 합니다.
    2. 셀을 분석 하는 소프트웨어에서 "데이터 분석" 함수를 사용 합니다. "새로운 분석."를 클릭 하 여 새로운 데이터 분석 시작 선택 된 이미지는 "소스 프레임" 탭 및 세포 형태학 매개 변수 셀 영역 (µ m2), 광학 두께 (µ m), 및 모든 개별 셀에 대 한 볼륨 (µ m3)을 포함 하 여 끕니다. 분산형 플롯 또는 히스토그램 모드 및 내보내기 데이터를 테이블 또는 그림을 선택 합니다.
  2. 세포 확산 분석
    1. 다른 시간 포인트 (예, 초기, 12 h, 24 h, 36 h 및 48 h) 적어도 5 이미지를 선택 합니다. 소프트웨어에 의해 제공 되는 레코드 셀 번호.
    2. 배로 시간을 추정, 초기 숫자 정상화 후 핸드폰 번호를 플롯 하 고 지 수 성장 곡선에 맞게.
  3. 셀 모션 분석
    1. 소프트웨어에 "셀 추적" 기능을 사용 합니다. "새로운 분석"을 클릭 하 여 새로운 데이터 분석을 시작 하. 선택한 기간 동안 (예를 들어, 24 h 부 화 후 4 h) "소스 프레임" 탭에는 이미지의 드래그 시리즈는 임의로 "셀 추가" 선택 모드에서 셀을 클릭 하 여 10-30 셀을 선택 합니다. 가장자리와 보기의 필드 밖으로 이동에 셀을 제외 합니다.
    2. 신중 하 게 이미지의 시리즈에서 추적을 확인 하십시오. 시스템 셀의 트랙을 잃거나 잘못 된 셀을 추적는 수동으로 조정 추적 셀 셀을 식별 하기 위해 "확인"을 클릭 하거나 "위치 수정"을 클릭 하 여 셀 위치를 수정 하려면 "선택" 모드.
    3. "플롯 운동" 셀 궤적의 장미 줄거리 또는 줄거리는 다른 모션 관련 매개 변수에 대 한 운동 속도 (µ m/h), 운동 (µ m), 마이그레이션 (µ m), 및 마이그레이션 똑 바 름 같은 "플롯 기능"에서 선택 하십시오. 테이블 또는 수치 데이터를 내보냅니다.

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Representative Results

그림 1 전형적인 세포 형태학 특성 묘사. 이미지는 holographs (그림 1A-B)와 2D 이미지 (그림 1C-D)로 표시 됩니다. 광 셀 두께 (계산 고 굴절률 광학 경로 길이에서) 라인 프로 파일 또는 전체 셀 측정을 통해 정량은. KHOS-A의 두께 면적의 점도 그림 1E-G,이 두 고기 다른 배포 패턴을 표시 하는 위치에서 KHOS N 셀 전체 셀 측정 표시 했다. 히스토그램 (그림 1 H-M) 또는 내보낸된 파일에서 평균 숫자 KHOS-A 셀 작은 셀 영역 및 KHOS N 셀 보다 큰 두께 설명 했다.

셀 카운터 함수를 사용 하 여 셀 확산 프로 파일 (그림 2)를 획득 했다. 이러한 KHOS-A 사이 상당한 차이가 표시 되지 않았다 및-N 세포. 또한, 시간을 두 배로 셀은 또한 큰 차이가 나타나지 않았다 (즉, 24-26 h), 확산 곡선에서 추정 될 수 있습니다.

그림 3A -D KHOS A의 일반적인 추적을 표시 하 고 비 방향 (무작위)-N 셀 모션 모드, 해당 궤도. 평균 세포 운동 성 (그림 3E-F), 운동 속도 (그림 3G-H), (그림 3I마이그레이션 거리-J), 및 마이그레이션 똑 바 름 (그림 3 K-L) 녹화 시간 대 표시 했다. KHOS-N 셀에 비해, KHOS-A 셀 큰 운동 속도를, 운동 성 및 더 긴 거리의 결과로 나타났다.

Figure 1
그림 1: 세포 형태학 특성. (A-B) KHOS-A (A) 와 앤 셀 (B) 양적 대표 holographs 이미징 단계. 스케일 바는 191.4 µ m. 너비 오른쪽 하단 모서리에 이미지에 그려진 파란색 라인에 대 한 광학 두께의 양적 선 프로 파일을 표시 합니다. (C-D) KHOS-A (C) 와 앤 셀 (D)에 대 한 셀 세분화의 대표 QPI 이미지. 눈금 막대는 100 µ m. 셀 가장자리는 정량화에 대 한 제외 했다. (E-G) KHOS-A 및-N (E) 세포 (F)의 개별 셀에 대 한 지역 대 측정된 두께입니다. 각 점 개별 셀을 나타냅니다 (n = 200-300). 오버랩 플롯 (G) KHOS에 대 한 다른 분산 패턴을 보여줍니다-A 및-N 세포. (H-M) 히스토그램 셀 두께의 (H-나), 지역 (J-K), 그리고 볼륨 (L M) 배포 (H, J, L) KHOS-A 및-N (I, K, M)세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 세포 확산 특성. 상단 패널 셀 숫자를 계산에 대 한 대표적인 셀 분할을 보여 줍니다. 눈금 막대는 100 µ m. 하단 패널은 해당 계산된 셀 확산 속도를 보여줍니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. 학생의 t 시험 (홀, 양측) 통계 분석을 위해 사용 되었다. 테스트 결과 고려 되었다 중요 한 때 p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 동작 특성을 셀. (A-B) 대표 셀 추적 세포 (B) (A) KHOS-A 및-N에 대 한 이미지. 눈금 막대는 100 µ m. 선택한 셀에 서로 다른 색상으로 개설 된다. 세포 운동 성 기간 4 h에 기록 된 해당 색된 선으로 표시 됩니다. (C-D) KHOS-A 및-N (C) (D) 셀의 셀 궤적 플롯 원점 (0, 0)에서. 각 줄은 개별 셀을 나타냅니다. KHOS-A 셀 KHOS-N 세포에 비해 더 분산된 패턴을 보였다 (n = 10). (E-L) KHOS-A의 셀 동작에 대 한 조사 기간 동안 양적 매개 변수를 기록 (E, G, I, K) -N (F, H, J, L) 포함 하 여 셀 세포 운동 성 (E-F), 운동 속도 (G-H), 이동 거리 (나-J ), 및 마이그레이션 똑 바 름 (K-L). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 연구에서 우리는 생체 외에서비-침략 적, 레이블 없는 방법과 양적 특성 인간 다리 세포의 신생 및 비 신생 고기 QPI를 사용 하 여 설명 합니다. 여러 세포 매개 변수는이 메서드에서 통합, 높은 처리량, 확산 속도, 시간, 마이그레이션 똑 바 름, 운동 속도, 마이그레이션, 및 운동 성을 두 배로, 셀 볼륨, 셀 간격, 셀 영역을 포함 하 여 동시에 분석 되었습니다 했습니다.

셀 형태학 및 세포 행동을 평가 하는 기존의 분석 실험에 비해,이 방법은 뿐만 아니라 저장 시간과 노동, 하지만 또한 더 정확 하 고 자세한 정보를 제공 합니다. 예를 들어 (내부 셀 인큐베이터) QPI 시스템의 위치 주변 환경 (실내 온도 분위기)23에 촬영 하는 등 환경 변화에서 소요를 감소 시킨다. 또한, 광학 셀 두께 볼륨, 위상 변화에서 변환 수으로 얻을 수 QPI, 반면만 셀 영역 전통적인 세포 이미징 프로세스에 의해 측정 됩니다. QPI의이 기능은 다른 셀 고기의 양적 비교에 대 한 자세한 정보를 생성합니다.

관심사의 세포의 적절 한 시드 밀도 현재 방법에 중요 합니다. 영상 수집 단계 셀이 일관 된 QPI 기술 그 수집 이미징만 수행할 수 1 포커스 패널, z에 일부 정보를 잃을 수 있습니다의 제한으로 인해 confluent 단층 보다 작을 것으로 예상 된다 방향 (즉, 중첩된 셀). 또한, characterizations QPI를 사용 하는 세포 외 매트릭스에서 z 방향에서 셀 침공에 대 한 최적의 2D 형식으로 제한 됩니다. 미래 QPI 방법론 개발을 위한 여러 개의 미리 설정 된 초점 길이 필요 합니다.

셀 계산, QPI 이미징 또한 제공 합니다 유익한 이미지를 추가 라벨21,,2324없이 세포 유사 분열을 공부. 세포 분열 셀 영역 및 볼륨의 확실 한 감소에 의해 쉽게 인식 되었다, 하는 동안 능력을 객관적으로 그리고 양적 정의 하 고 단일 셀에 대 한 세포 주기 단계 차별화 아직 설정할 수 있다. 이 기능은 셀 줄기 세포 분화, 약물 반응 및 세포 주기 검거에 대 한 분석에 관하여 연구를 용이 하 게 크게 것 이다.

양적, 레이블, 자유롭고 사용 하기 쉬운의 장점으로 인해이 방법 또한 유용한 임상 응용25,26,,2728,29,30 있을 수 있습니다. . 예를 들어이 시스템 인간의 종양에 휴면 하 고 활성 셀을 포함 하 여 다른 유형의 세포 인구의 특성에 이용 될 수 있습니다. 휴면 및 활성 암 세포 간의 특징이 셀 형태학 및 행동 차이 기본 인간 암에 있는 종양 휴면 하는 분자 메커니즘을 해독 잠재적으로 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언.

Acknowledgments

저자는 유방암 연구 재단 및 고급 의료 연구 재단의 지원을 인정 하는 기꺼이.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T75 flask Corning, NY, USA 353136
6-well plates  Corning, NY, USA 3506
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 11965092
Fetal bovine serum (FBS)  Atlanta Biologicals, GA, USA S11550
Penicillin Streptomycin Thermo Fisher Scientific, MA, USA 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 10010023
Beckman Z1 Coulter counter Beckman Coulter, IN, USA Z1 
HoloMonitor M4 Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden M4 Microscope
Hololid Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden PHI 8020
HStudioM4 Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden HStudioM4 Software

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References

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