Summary
Fenótipos de célula dormente e ativo câncer foram caracterizados utilizando imagens de fase quantitativa. Ensaios de proliferação, migração e morfologia celular foram integrados e analisados em um método simples.
Abstract
A aquisição do fenótipo angiogênico é um componente essencial da fuga da letargia do tumor. Embora vários clássicos em vitro ensaios (por exemplo, proliferação, migração e outros) e na vivo modelos foram desenvolvidos para investigar e caracterizar angiogênico e não-angiogênico fenótipos de célula, estes métodos são tempo trabalho intensivo e muitas vezes requerem reagentes caros e instrumentos, bem como competências significativas. Em um estudo recente, costumávamos uma novela fase quantitativa de imagem técnica (QPI) para realizar caracterizações de lapso de tempo e sem rotulagem de células KHOS humana osteossarcoma angiogênico e não-angiogênico. Um painel de parâmetros celulares, incluindo a morfologia celular, proliferação e motilidade, quantitativamente foram medidos e analisados usando QPI. Este romance e abordagem quantitativa fornece a oportunidade estudar continuamente e de forma não-invasiva relevantes processos celulares, comportamentos e características das células cancerosas e outros tipos de células de uma forma simples e integrada. Este relatório descreve nosso protocolo experimental, incluindo a preparação da pilha, QPI aquisição e análise de dados.
Introduction
Um dos primeiros postos de controlo no desenvolvimento e progressão de um tumor sólido é a aquisição do fenótipo angiogênico, marca registrada do câncer. Esta progressão envolve uma variedade de processos bioquímicos e moleculares1,2,3. Um desafio técnico no estudo desta etapa chave na progressão do tumor é a falta de ferramentas de forma contínua e quantitativamente caracterizar e diferenciar entre fenótipos angiogênico e não-angiogênico das células de câncer ao vivo de forma imparcial. Os ensaios tradicionais sendo usados para investigar os comportamentos celulares das células angiogênico e não-angiogênico geralmente exigem instrumentos e reagentes caros, por exemplo, os ensaios de proliferação/migração celular4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 ou complementares na vivo avaliações4,5,6,8,15,16, bem como exigindo intensiva e competências significativas consumo de tempo e mão de obra.
Recentemente, a fase quantitativa de imagem (QPI) surgiu como uma nova técnica que permite a avaliação de lapso de tempo e sem rotulagem de uma variedade de celular morfologia e comportamento parâmetros17,18,19, 20 , 21 , 22. ao contrário de microscopia óptica convencional, QPI quantifica o variações de mudança de fase pixel por pixel depois a luz passa através de um objeto óptico e reconstrói um holograma com espessura ótica convertida e volume, possibilitando assim o direto análise de células vivas e as seguintes características: (1) quantitativa de imagem, imagem (2) não-invasiva e lapso de tempo, (3) livre de etiqueta de imagem e (4) simultânea de imagem multi-parâmetros. Estas características fazem QPI uma ferramenta poderosa para avaliar e compreender os processos patológicos em nível celular.
Em um recente estudo, utilizamos o QPI para quantitativamente caracterizar e diferenciar entre angiogênico KHOS-A e fenótipos de KHOS-N não-angiogênico das células de osteossarcoma humana de forma sistemática e quantitativa, combinando análises da morfologia celular, proliferação e motilidade23. Usando software de análise de imagem, um painel de células morfológica e comportamento parâmetros quantitativamente foram comparados entre as células de osteossarcoma humana angiogênico e não-angiogênico e identificaram-se cinco características diferenças entre estes dois fenótipos. Esta nova abordagem fornece uma plataforma integrada e quantitativa para avaliar uma variedade de características celulares biologicamente relevantes.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Comissão de biossegurança institucional Hospital infantil de Boston.
1. preparação da pilha
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Thawing KHOS-A e células -N
- Aquecer o meio de cultura, ou seja, Dulbecco modificado suplementado águia com 10% de soro fetal bezerro (vol/vol) (FBS) e 1% (vol/vol) penicilina/estreptomicina.
- Levar os frascos criogênicos de células do tanque de nitrogênio líquido, o fundo dos frascos o mergulhe em água morna em banho maria a 37 ° C e agite-os frascos criogênicos para acelerar o processo de descongelação. Manter a tampa dos frascos criogênicos de entrar em contato com a água para evitar a contaminação. Assim que as células são descongeladas, esterilize o frasco criogênico pulverizar solução de etanol 70% e limpando o frasco.
- Em uma capa de fluxo laminar, aspirar imediatamente a suspensão de eritrócitos do frasco criogênico e suspender suavemente em meio de cultura de 10ml aquecido (descrito em 1.1.1). Centrifugue suspensões celulares em aproximadamente 200 x g, durante 5-7 min.
- Ressuspender as células com meio de cultura de 10ml aquecido e transferir para um balão de T75. Pipete suavemente várias vezes para suspender células uniformemente com uma pipeta de 10 mL.
- Coloque o frasco em uma incubadora de 37 ° C com 5% (vol/vol) CO2 e ambiente umidificado. Permitir que as células anexar pelo menos 12 h.
- Incube as células por aproximadamente 3-7 dias até 80-100% de Confluencia. Altere o meio de cultura a cada 2-3 dias.
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Divisão KHOS-A e células -N
- Retire o balão, os meios de cultura.
- Lavar as células com 5 mL de PBS estéril (1x) sem cálcio e magnésio, para remover as células não aderentes ou fração.
- Adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA 0,05% para o balão, e brevemente, agite o frasco para assegurar que a tripsina-EDTA é dispersa uniformemente.
- Incube o frasco para 2-3 min em uma incubadora de 37 ° C ou 3-5 min à temperatura ambiente. Verifique as células sob um microscópio ampliação de aproximadamente 400 x para certificar-se que as células são arredondadas e desanexadas.
- Uma vez que as células são desanexadas, adicionar 10 mL de meio de cultura e pipetar suavemente o meio subindo e descendo várias vezes para quebrar agregados de células em uma suspensão de célula única usando uma pipeta de 10 mL.
- Contar as células usando um contador de célula. As sementes da suspensão celular novo T75 balões em uma densidade de 2 × 106 células ou um rácio de 1:4.
- Permitir que as células a crescer a confluência de 80-100% antes da semeadura para o experimento QPI.
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Células -N para QPI e semeadura KHOS-A
- Sementes KHOS-A e -N células em placas de 6-poços na densidade de 50.000-300.000 células/poço com 5 mL de meio de cultura depois de contar com um contador de célula.
Nota: A densidade de semeadura é dependente da taxa de proliferação celular e o período de tempo a imagem para ter < confluência de 100% durante a aquisição de imagem. - Incube as células pelo menos 12 h permitir a fixação.
- Mude o meio com mídia fresco antes de conduzir QPI.
- Sementes KHOS-A e -N células em placas de 6-poços na densidade de 50.000-300.000 células/poço com 5 mL de meio de cultura depois de contar com um contador de célula.
2. QPI aquisição
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Lamínula, configurar
- Limpe a lamínula enxaguando-se várias vezes com água desionizada e esterilizar com solução de etanol 75% por imersão durante 15 min. colocar a lamínula em uma capa de fluxo de laminar estéril para secar.
- Coloque cuidadosamente o deslizamento da tampa em uma placa de 6-bem para evitar bolhas de óbvias. Certifique-se de que a parte inferior da lamínula está imerso nos meios de cultura (mínimo de 5 mL/poço).
- Coloque a placa em incubadora (37 ° C, 5% de CO2e umidificada atmosfera) para equilibrar pelo menos 15 min. Se formas de nevoeiro na lamínula, use um cotonete estéril para limpar.
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Imagem de células com um microscópio
- Abra o software para inicializar o sistema, incluindo auto calibração de tempo de exposição e contraste padrão ruído de holograma. Certifique-se que os valores são aceitáveis (mostrado na faixa verde ou amarela).
- Coloque a placa de 6 para o palco do microscópio QPI.
- Clique em "Captura dinâmica" e selecione "Manual" em "Foco Software." Grosseiramente, focar as imagens de fase de células, ajustando a distância de trabalho em "Configuração de microscópio" obter contornos para células em imagens de fase. Mudar para "Automático" em "Foco Software."
- Clique em "Nova experiência" para criar uma nova experiência. Começa com a seleção das posições de aquisição de imagem usando o mouse ou as teclas de seta no teclado numérico. Clique em "Remember" depois de cada seleção. Normalmente 3-5 locais para cada amostra são selecionados.
- Configurar os intervalos de imagem e o período de tempo na seção "Timelapse".
Nota: Para rastrear as células cancerosas, claramente, os intervalos devem ser menores do que 5 min. 48 horas é definido como o período de tempo para a combinação de análise QPI. - Inicie o experimento, clicando em "Capturar", que automaticamente irá concentrar-se e adquirir as imagens nos pontos de tempo de ajuste.
3. análise de dados
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Análise de morfologia celular
- Clique em "Identificar células." Ajuste a configuração numérica para "Limiar de fundo", para que áreas de célula são separadas bem do ruído de fundo. Ajustar o número de configuração para o "Tamanho do objeto" para certificar-se de que cada célula tem um núcleo. Manter parâmetros consistentes para amostras que precisam ser comparados, como estas podem afetar as medidas de área e volume finais. Modificar manualmente os segmentos de pilha usando "Alterações manuais", se necessário.
- Use a função "Analisar os dados" no software para analisar as células. Começar uma nova análise de dados, clicando em "Nova análise". Arraste imagens selecionadas para os "Quadros de fonte" guia e célula morfologia parâmetros incluindo área celular (µm2) espessura ótica (µm) e volume (µm3) para cada célula individual. Escolha dispersão enredo ou histograma modo e exportar dados como tabelas ou figuras.
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Análise da proliferação de células
- Selecione pelo menos 5 imagens para os tempo diferentes pontos de interesse (por exemplo, inicial, 12h, 24h, 36h e 48 h). Número de células de registro que é fornecido pelo software.
- Para estimar o tempo de duplicação, plotar o número de células após normalizar com os números iniciais e se encaixam com as curvas de crescimento exponencial.
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Análise de movimento de célula
- Use a função "Localizar células" no software. Clique em "Nova análise" para iniciar uma nova análise de dados. Série de arraste de imagens por um período de tempo selecionado (por exemplo, 4 h após incubação de 24h) na guia "Quadros de fonte" escolhe aleatoriamente 10-30 células clicando em células sob o modo de seleção "Adicionar células". Exclua as células com as bordas e os mover-se fora do campo de visão.
- Verifique cuidadosamente o acompanhamento de uma série de imagens. No caso em que o sistema perde o controle de uma célula ou faixas na cela errada, ajuste manualmente a célula de controle clicando em "Identificar" para identificar células ou clicando em "Modificar localização" sob a modalidade "Select" para modificar a localização da célula.
- Escolha rosa trama de trajetórias de célula em "Movimento de trama" ou trama para os outros parâmetros relacionados ao movimento em "Recursos de plotagem," como velocidade de motilidade (µm/h), motilidade (µm), migração (µm) e franqueza de migração. Exporte dados como tabelas ou figuras.
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Representative Results
A Figura 1 retrata uma caracterização da morfologia típica célula. Imagens são apresentadas como holografias (figura 1A-B) e imagens 2D (Figura 1-D). Espessuras de célula óptica (calculadas a partir do índice de refração e comprimento do percurso óptico) são quantificadas através do perfil de linha ou uma medição de célula inteira. Dispersão plota da área e espessura de KHOS-A e células KHOS-N medidas para uma célula inteira foram plotadas, como na Figura 1E-G, onde estes dois fenótipos exibido padrões de distribuição diferentes. Os números médios de histograma (Figura 1 H-M) ou os arquivos exportados demonstraram que células KHOS-A tem áreas de células menores e maiores espessuras de células KHOS-N.
Usando a função de contador de célula, perfis de proliferação celular foram obtidas (Figura 2). Estas não apresentaram diferença significativa entre KHOS-A e células -N. Além disso, a célula tempo de duplicação pode ser estimada a partir da curva de proliferação (ou seja, 24-26 h), que também não mostrou diferenças significativas.
Figura 3A -D mostra o acompanhamento típico de KHOS-A e células -N em não-direcional (aleatório) movimento modo e as trajetórias correspondentes. A motilidade celular média (Figura 3E-F), velocidade de motilidade (Figura 3-H), distância de migração (Figura 3I-J)e a franqueza de migração (Figura 3 K-L) foram plotados versus tempo de gravação. Em comparação com células KHOS-N, KHOS-A células mostraram maior velocidade de motilidade, resultando em longa distância de motilidade e migração.
Figura 1: caracterização da morfologia da pilha. (A-B) Holografias representativas das células (A) e -N KHOS-A (B) por quantitativa fase de imagem. Barra de escala é que 191,4 µm. inserções no canto inferior direito mostram o perfil quantitativo de linha de espessura ótica para a linha azul desenhada nas imagens. (C-D) Imagens de QPI representante de segmentação celular para KHOS-A (C) e -N células (D). Barra de escala é de que 100 µm. células nas bordas foram excluídas para a quantificação. (E-G) Medida de espessura versus área para células individuais de KHOS-A (E) e -N células (F). Cada ponto representa uma célula individual (n = 200-300). O enredo de sobreposição (G) mostra dispersão significativamente diferentes padrões para KHOS-A e células -N. (H-M) Histogramas de espessura de célula (H-eu), área (J-K)e o volume de distribuição (L-M) para KHOS-A (H, J, L) e -N células (I, K, M). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: caracterização de proliferação de células. O painel superior mostra a segmentação de célula representativo para a contagem do número de células. Barra de escala é de 100 µm. O painel inferior mostra a correspondente taxa de proliferação de célula calculada. Dados são apresentados como média ± desvio-padrão. Teste t de Student (não pareado, bicaudal) foi usado para análises estatísticas. Resultados do teste foram considerados significativos quando p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: caracterização do movimento de célula. (A-B) Rastreamento de celular representante imagens para KHOS-À (A) e -N (B) células. Barra de escala é de 100 µm. Selected células alinham-se com cores diferentes. Motilidade celular, gravada em um 4 h, período de tempo é apresentada com a linha colorida correspondente. (C-D) Trajetórias de célula de KHOS-A (C) e -N (D) células plotagem do ponto de origem (0,0). Cada linha representa uma célula individual. KHOS-A células mostraram um padrão mais disperso, em comparação com células KHOS-N (n = 10). (E-L) Gravado parâmetros quantitativos durante o período de tempo investigado para movimento de célula de KHOS-A (E, G, I, K) e -N (F, H, J, L) de células, incluindo células de motilidade (E-F), velocidade de motilidade (G-H), distância de migração (I-J )e a franqueza de migração (K-L). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, descrevemos um em vitro, não-invasivo e sem rótulo método usando QPI para caracterizar quantitativamente os fenótipos angiogênico e não-angiogênico das células humanas de osteossarcoma. Vários parâmetros celulares foram analisados simultaneamente por esse método integrado de alta produtividade, incluindo área de célula, espessura de célula, volume das células, taxa de proliferação, dobrando o tempo, franqueza de migração, velocidade de motilidade, migração e mobilidade.
Em comparação com os ensaios convencionais que avaliam a morfologia da célula e a célula comportamentos, esse método não só economiza tempo e mão de obra, mas também fornece informações mais precisas e detalhadas. Por exemplo, a localização do sistema QPI (dentro da incubadora de célula) reduz os distúrbios de mudanças ambientais tais como fotografar em um ambiente (temperatura e atmosfera)23. Além disso, espessura ótica célula e volume, convertido de mudança de fase, poderiam ser obtidas com QPI, Considerando que apenas a área de célula é medida pela célula tradicional processo de imagem. Esta característica do QPI gera informações mais detalhadas para comparações quantitativas dos fenótipos de célula diferente.
Densidade de semeadura adequada das células de interesse é fundamental para o método atual. Durante a fase de aquisição de imagens, as células são esperadas para ser menor do que uma monocamada confluente devido à limitação desta técnica de QPI coerente que aquisição de imagem só poderia ser realizada com painel de um foco, que pode perder informações parciais na z direção (ou seja, células sobrepostas). Além disso, caracterizações usando QPI limitam-se ao formato 2D, que não é o ideal para a invasão da célula na direção z na matriz extracelular. Múltiplos predefinidos focais são necessários para o desenvolvimento de metodologia QPI futuro.
Além de contagem de células, imagem latente QPI também fornece imagens informativas para estudar mitose celular sem adicionais rotulagem21,23,24. Enquanto a divisão celular foi reconhecida facilmente pela óbvia diminuição no volume e área da célula, a capacidade objectiva e quantitativamente definir e diferenciar as fases do ciclo celular para células individuais ainda tem que ser estabelecido. Esta capacidade significativamente facilitaria a pesquisa no que diz respeito a análise de células para a diferenciação de células-tronco, resposta de droga e detenção do ciclo celular.
Devido às vantagens de ser quantitativa, rótulo-livre e fácil de usar, esse método também pode ter aplicações clínicas úteis25,26,,27,28,29,30 . Por exemplo, este sistema poderia ser utilizado na caracterização de populações de células heterogêneas, incluindo células dormentes e ativas em tumores humanos. As diferenças morfológicas e comportamentais de célula caracterizada entre as células cancerosas dormentes e ativo potencialmente podem ser usadas para decifrar os mecanismos moleculares subjacentes a letargia do tumor em cânceres humanos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores reconhecem com gratidão o apoio da Fundação de pesquisa do câncer de mama e a Advanced Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T75 flask | Corning, NY, USA | 353136 | |
| 6-well plates | Corning, NY, USA | 3506 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals, GA, USA | S11550 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 10010023 | |
| Beckman Z1 Coulter counter | Beckman Coulter, IN, USA | Z1 | |
| HoloMonitor M4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | M4 | Microscope |
| Hololid | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | PHI 8020 | |
| HStudioM4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | HStudioM4 | Software |
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