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Developmental Biology

Trichostatin ए और विटामिन सी के संयोजन उपचार दैहिक कोशिका परमाणु हस्तांतरण द्वारा चूहों क्लोनिंग की दक्षता में सुधार

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57036
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1,5
1Division of Biological Science, Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute and Department of Zoology, University of Cambridge, 4Laboratory of Reproductive Biology, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, 5Institute of Advanced Technology, Kindai University

Summary

हम trichostatin ए, विटामिन सी, और विज्ञानी गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन का उपयोग करके माउस क्लोनिंग के लिए एक नाटकीय रूप से बेहतर विधि का वर्णन करते हैं । हम एक सरल, reproducible प्रोटोकॉल है कि क्लोन भ्रूण के कुशल विकास का समर्थन करता है दिखाते हैं । इसलिए, इस विधि माउस क्लोनिंग के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया बन सकता है ।

Abstract

दैहिक कोशिका परमाणु अंतरण (SCNT) एक अद्वितीय को सीधे एक दाता सेल से एक क्लोन जानवर का उत्पादन अवसर प्रदान करता है, और यह निपुण तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, क्लोनिंग की क्षमता कम बनी हुई है, विशेष रूप से पशुओं, खासकर चूहों के सफल उत्पादन के बाद से । क्लोनिंग दक्षता में सुधार करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं, और trichostatin एक (TSA), एक हिस्टोन deacetylase अवरोध करनेवाला, व्यापक रूप से क्लोनिंग की दक्षता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहां, हम चूहों में एक नाटकीय रूप से बेहतर क्लोनिंग विधि की रिपोर्ट । इस दैहिक कोशिका परमाणु हस्तांतरण विधि जापान लिफाफा (एचवीजे-E), जो आसान हेरफेर सक्षम बनाता है की Hemagglutinating वायरस के उपयोग शामिल है । इसके अलावा, दो छोटे अणुओं का उपयोग कर उपचार, TSA और विटामिन सी (कुलपति), के साथ एल्ब्युमिन गोजातीय सीरम (dBSA), अत्यधिक भ्रूण के विकास के लिए प्रभावी है । इस दृष्टिकोण न तो अतिरिक्त इंजेक्शन और न ही आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है, और इस तरह व्यावहारिक उपयोग के लिए एक सरल, उपयुक्त विधि प्रस्तुत करता है । इस पद्धति के शोधकर्ताओं के लिए एक तकनीकी रूप से व्यवहार्य दृष्टिकोण बन सकता है संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं से आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं का उत्पादन । इसके अलावा, यह क्लोनिंग के जरिए लुप्तप्राय जानवरों के बचाव के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है ।

Introduction

SCNT प्रौद्योगिकी क्लोन पशुओं के उत्पादन केवल एक दैहिक कोशिका या एक नाभिक का उपयोग करके एक enucleated oocyte को हस्तांतरित करने के लिए सक्षम बनाता है । SCNT तकनीक के प्रयोजनों में से एक क्लोन भ्रूण से परमाणु हस्तांतरण भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (NT-ESCs) लाइनों के व्युत्पत्ति है । १९९८ में, वाकायामा एट अल, पहली बार1के लिए Cumulina नामक एक सफलतापूर्वक क्लोन माउस के उत्पादन की सूचना दी । तब से, चूहों की क्लोनिंग व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है, और दैहिक नाभिक के परमाणु reprogramming में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्राप्त किया गया है । दूसरी ओर, इस तकनीक कई micromanipulation कदम है जो काफी गुरु के लिए मुश्किल है के साथ है, अधिक से अधिक 3 महीने के2के गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है ।

क्लोन चूहों का उत्पादन SCNT का उपयोग कर मूल होनोलूलू विधि1से विकसित किया गया है, electrofusion विधि3, सेल फ्यूजन विधि से जापान के Hemagglutinating वायरस (एचवीजे)4. हालांकि, cytomembrane के माध्यम से एक सेल नाभिक के प्रत्यक्ष इंजेक्शन हानिकारक oocyte अस्तित्व को प्रभावित करने के लिए जाता है । electrofusion क्षमता में कम है, के बाद से प्रत्येक कोशिका झिल्ली अलग कठोरता है, यह मुश्किल एक इष्टतम स्थिति निर्धारित करने के लिए बना । एचवीजे की हैंडलिंग श्रमसाध्य है क्योंकि यह शोधकर्ताओं और प्रयोगशाला पशुओं की सुरक्षा के लिए विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता है । हाल ही में, दाता सेल और oocyte कोशिका द्रव्य फ्यूज करने के लिए, एचवीजे-E 5 इस्तेमाल किया गया है । एचवीजे-E केवल प्रफलन या वायरस की संक्रामक क्षमता के बिना झिल्ली फ्यूज करने की क्षमता है । एचवीजे-ए में एचवीजे के जीनोमिक RNAs पूरी तरह से निष्क्रिय हैं । एचवीजे का उपयोग-E इस प्रकार SCNT के दौरान सेल फ्यूजन के आसान हैंडलिंग का समर्थन करता है ।

कई रिपोर्टों से पता चला है कि TSA, एक हिस्टोन deacetylase अवरोध करनेवाला के साथ SCNT भ्रूण के उपचार, काफी से कम 1% से लाइव पिल्ले की उत्पादन क्षमता में सुधार ६.५%6,7। TSA उपचार SCNT भ्रूण में हिस्टोन के निशान को संशोधित करने के माध्यम से reprogramming में तेजी8। हाल ही में, विशेष mRNAs के इंजेक्शन, हिस्टोन lysine demethylase उपपरिवार 4 (KDM4) है, जो हिस्टोन H3 lysin 9 (H3K9) trimethylation भ्रूण में, विशेष रूप से reprograming-प्रतिरोधी क्षेत्रों में, निकाल दिया गया है क्लोन के विकास को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है माउस भ्रूण9। इस बीच, उपकुलपति, जो एक हिस्टोन संशोधक के रूप में भी कार्य करता है, H3K910के trimethylation में कमी आई है । इसके अलावा, कुलपति सुअर का SCNT 10 में भ्रूण विकास को बढ़ाता है । यह बताया गया है कि SCNT भ्रूण में dBSA के इंजेक्शन भ्रूण विकास के सुधार की ओर जाता है11.

हम पहले से पाया गया है कि छोटे अणुओं, अर्थात् TSA और कुलपति के संयोजन, साथ में dBSA, नाटकीय रूप से SCNT भ्रूण के विकास को बढ़ाकर12। यहाँ, हम विस्तार से चूहों के लिए पहले रिपोर्ट SCNT विधि, जो अत्यधिक कुशल और सरल क्लोनिंग प्रक्रियाओं12का प्रतिनिधित्व करता है. हम एचवीजे-ए की हैंडलिंग का भी वर्णन करते हैं । ये विकास और प्रजनन जीवविज्ञान के क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं मदद करने के लिए आनुवंशिक संसाधनों को बनाए रखने या इस SCNT विधि के माध्यम से आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं का उत्पादन कर सकते हैं ।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए Kindai विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों के अनुरूप ।

1. कल्चरल मीडिया तैयार करना

  1. भ्रूण संस्कृति के लिए संशोधित KSOM (mKSOM) माध्यम तैयार करें, जिसमें ९५ एमएम NaCl, २.५ एमएम KCl, ०.३५ एमएम KH2पीओ4, ०.२ एमएम MgSO4 · 7H2O, १.७१ mM CaCl2 · 2H2O, ०.२ mM D (+)-ग्लूकोज, ०.२ मिमी सोडियम पाइरूवेट, १.० मिमी एल-Glutamine, १.० g/l Polyvinylpyrrolidone (PVP), २५.०७ मिमी NaHCO3, 10 मिमी सोडियम डीएल-स्तनपान कराने वाली, ०.०५ जी/l पेनिसिलिन, और ०.०५ ग्राम/l Streptomycin बाँझ पानी में.
  2. भ्रूण हेरफेर के लिए Hepes बफर CZB (HCZB) मध्यम तैयार, ८१.५ mm NaCl, ४.८ mm KCl, १.७ mm CaCl2 से मिलकर · 2H2O, १.१८ mM MgSO4 · 7H2O, १.१८ मिमी KH2पो4, ०.११ mm EDTA · 2Na, ३६.१ मिमी सोडियम डीएल-स्तनपान कराने वाली, ५.५५ मिमी डी (+)-ग्लूकोज, ०.०२५ ग्राम/एमएल पेनिसिलिन, ०.०३५ ग्राम/एल Streptomycin, ०.०१४ मिमी Phenol लाल, १.० ग्राम/एल Polyvinyl शराब, ५.० मिमी NaHCO3, और २०.० mm Hepes सोडियम नमक बाँझ पानी में ।
  3. oocyte सक्रियण के लिए सक्रियण माध्यम तैयार करें: mKSOM मध्यम ५० एनएम TSA, 2 मिमी EGTA, 5 µ जी/एमएल cytochalasin बी (सीबी), और 5 मिमी SrCl2के साथ पूरक ।

2. तैयार गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (dBSA) की तैयारी

  1. (12% की एक अंतिम एकाग्रता) कमरे के तापमान पर बाँझ पानी की 10 मिलीलीटर में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के १.२ जी भंग ।
  2. मिश्रित आयन के लगभग ०.१२ जी-विनिमय राल मोती के ऊपर तैयार 12% BSA के कोमल सरगर्मी के साथ कमरे के तापमान पर बाँझ पानी में जोड़ें ।
  3. जब मोती नीले हरे से सोने के लिए रंग बदलने के लिए, एक पिपेट का उपयोग कर supernatant समाधान की वसूली । फिर ताजे लोगों के साथ मोतियों की जगह (चित्रा 1) ।
    नोट: मोतियों का प्रतिस्थापन सामान्य रूप से केवल एक बार किया जाता है. यह संभवतः कुछ प्रतिस्थापन की आवश्यकता को पूरा करने के लिए । केवल एक गाइड के रूप में, अगर मोतियों का रंग नीले-हरे से सोने के लिए अपरिवर्तित रहता है, यह इंगित करता है कि आयन एक्सचेंज पूरा हो गया है ।
  4. पुष्टि करने के बाद समाधान पुनर्प्राप्त करें कि मोतियों में कोई रंग परिवर्तन नहीं है ।
    नोट: बरामद समाधान बादल बन जाता है, तो यह कॉलेस्ट्रॉल फिल्टर (१७५ एक्स जी, 5 मिनट) को रोकने के लिए केंद्रापसारक ।
  5. पूरक १०.५% NaHCO3के २५० µ एल के साथ समाधान बरामद.
    नोट: यह प्रक्रिया pH स्थिति को बेअसर करने के लिए dBSA समाधान के लिए अभिप्रेत है । हालांकि, NaHCO3 औषधालय किया जा सकता है ।
  6. एक ०.४५-µm फिल्टर का उपयोग कर supernatant निष्फल, और dBSA स्टॉक समाधान के रूप में-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

3. Oocyte संग्रह

नोट: सभी चूहों को हल्के नियंत्रित और वातानुकूलित कमरों में रखा गया था ।

  1. सुपर-ovulation प्रत्येक महिला B6D2F1 माउस (8-10 सप्ताह की आयु) की ७.५ IU के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा गर्भवती घोड़ी सीरम गोनॉडोट्रॉफिन (PMSG) और IU इंजेक्शन के बाद मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन (एचसीजी) ४८ एच के ७.५ PMSG ।
  2. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा इच्छामृत्यु प्रदर्शन 14-16 ज एचसीजी इंजेक्शन के बाद । Incise पेट मानक विच्छेदन तकनीक का उपयोग कर प्रजनन पथ का उपयोग करने के लिए13. संक्षेप में, त्वचा चुटकी और कैंची के साथ midline पर एक छोटे पार्श्व चीरा बनाते हैं । त्वचा को दृढ़ता से ऊपर और नीचे चीरा और सिर और पूंछ की ओर त्वचा खींच पकड़ो । कैंची का उपयोग कर, रास्ते से बाहर पेट के कुंडल धक्का और गर्भाशय, oviducts, और अंडाशय के दो सींग की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, योनि में कटौती ।
  3. Extirpate छोटे सीधे कैंची और चिमटी के साथ oviducts, सतह के बंद खून पोंछ करने के लिए फिल्टर कागज के एक पत्रक पर जगह है । खनिज तेल में oviducts सेट करें । फिर, विच्छेदन सुई का उपयोग कर ओवीडक्ट के कलसा में कटौती, और ०.१% कलसा के साथ ओवीडक्ट माध्यम के २०० µ एल बूंदों में HCZB के hyaluronidase से आ रही मेघपुंज-oocyte परिसरों चाल । एक वार्मिंग थाली पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    चेतावनी: ०.१% hyaluronidase के साथ HCZB माध्यम में 10 मिनट से अधिक की एक जोखिम अंडाणुओं के लिए हानिकारक होगा ।
  4. पुष्टि करें कि मेघपुंज कक्ष मेघपुंज-oocyte परिसरों से एक stereomicroscope के अंतर्गत जारी किए जाते हैं, दूसरी meiotic metaphase (मिि) चरण अंडाणुओं कुछ शेष मेघपुंज कक्षों के साथ mKSOM मध्यम से ०.३% dBSA । फिर, बाकी mKSOM कोशिकाओं को अलग करने के लिए ०.३% dBSA युक्त मेघपुंज माध्यम में (< 100 µm इनर व्यास के एक पिपेट का उपयोग करके) ऊपर और नीचे pipetting करके मिि चरण अंडाणुओं चार बार धोएं ।
    नोट: एक छोटे पिपेट के उपयोग मेघपुंज कोशिकाओं की टुकड़ी की सुविधा ।
  5. mKSOM मध्यम में ०.३% dBSA से युक्त Mll चरण अंडाणुओं में ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% कं2 मशीन enucleation तक ।
    नोट: oocyte की तुलना में थोड़ा बड़ा है कि एक व्यास के साथ एक छोटे से पिपेट की सिफारिश की है.

4. परमाणु अंतरण के लिए दाता कोशिकाओं की तैयारी

  1. कदम ३.३-३.५ के बाद, नंगा अंडाणुओं मेघपुंज-oocyte परिसरों से अलग कर रहे हैं । HCZB माध्यम में hyaluronidase माध्यम से 6% HCZB के साथ dBSA माध्यम में मेघपुंज-oocyte परिसरों से फैलाई गई शेष मेघपुंज कोशिकाओं की एक छोटी राशि (लगभग 2 µ l) का अंतरण ।
  2. SCNT के लिए जरूरत होने तक ३७ डिग्री सेल्सियस पर वार्मिंग की थाली पर 6% dBSA के साथ HCZB माध्यम में मेघपुंज कोशिकाओं रखें ।
    नोट: जब fibroblast कोशिकाओं (जैसे, murine भ्रूण fibroblast कोशिकाओं) दाता कोशिकाओं के रूप में उपयोग किया जाता है, एक ऊतक संस्कृति पकवान से अलग कोशिकाओं और उंहें एक गोली में केंद्रापसारक । 6% dBSA युक्त HCZB माध्यम में कोशिकाओं की गोली reसस्पेंड ।

5. Enucleation का अंडाणुओं

  1. 10 मिलीलीटर HCZB माध्यम को ०.९ जी PVP जोड़कर 9% pvp माध्यम तैयार करते हैं, रात भर रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में रखने के लिए, और फिर यह एक ०.४५ µm फिल्टर का उपयोग कर निष्फल ।
  2. सीबी स्टॉक समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता) dimethyl sulfoxide (DMSO) के 5 मिलीलीटर सीबी के 5 मिलीग्राम जोड़कर तैयार करते हैं । HCZB माध्यम के साथ सीबी स्टॉक समाधान पतला (5 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता) और enucleation समाधान के रूप में उपयोग करें ।
  3. µ (अंदर व्यास: १५० enucleation से २०० exhaling) के माध्यम से श्वास द्वारा 5 पिपेट जी/एमएल सीबी (µm सॉल्यूशन) युक्त HCZB माध्यम के 20 µ l में Mll स्टेज अंडाणुओं को धोएं । वाशिंग प्रक्रिया को पांच बार दोहराएं । enucleation प्रक्रिया शुरू करने से पहले enucleation समाधान में वार्मिंग थाली पर लगभग 10 मिनट रुको ।
  4. enucleation कक्ष को चित्र 2aमें दर्शाए अनुसार तैयार करें । Mll अंडाणुओं श्वास और exhaling पिपेट (अंदर व्यास: १५० µm से २०० µm) का उपयोग करके enucleation कक्ष में स्थानांतरण; enucleation समाधान के 4 µ एल प्लेस और खनिज तेल के साथ चैंबर को कवर किया ।
    नोट: एक चैंबर के बजाय, एक ६० mm पेट्री डिश का कवर किया जा सकता है ।
  5. कमरे के तापमान पर एक माइक्रोस्कोप (400X) के तहत मिि चरण oocyte के धुरी और गुणसूत्रों की पहचान करें । ओरिएंट Mll चरण oocyte स्पष्ट पहले ध्रुवीय शरीर के साथ, इतना है कि धुरी और गुणसूत्र की स्थिति 3 या 9 बजे है (चित्रा 2 बी) एक होल्डिंग पिपेट और micropipette का उपयोग कर स्थिति ।
    नोट: इस्तेमाल माइक्रोस्कोप कुल में 400X आवर्धन के लेंस है । इसके अलावा, उद्देश्य लेंस एन. ए है 5x/0.12 और 40X/0.55 । पिपेट के पीजो पल्स ड्राइविंग zona pellucida की तेजी से ड्रिलिंग परमिट । इसके अलावा, एक लेजर प्रणाली (जैसे, XYClone) पीजो ड्राइविंग प्रणाली के स्थान पर zona pellucida की ड्रिलिंग के लिए भी प्रयोग करने योग्य है ।
  6. 3-6 करने के लिए पीजो पल्स तीव्रता सेट करें, और पिपेट पल्स ड्राइविंग के साथ एक micromanipulation µm (7-8 पीजो भीतरी व्यास फ्लैट समाप्त टिप) का उपयोग कर pellucida zona करने के लिए ड्रिल. zona pellucida में छेद खोलने के बाद, पूरी तरह से कोशिका द्रव्य (चित्रा2c) की न्यूनतम मात्रा के साथ धुरी और गुणसूत्रों enucleate ।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान, अंडाणुओं को कसकर डिश नीचे या पिपेट के लिए संलग्न करने के लिए करते हैं बिना माध्यम के कारण BSA14. 10 मिनट के भीतर, enucleation प्रक्रिया को पूरा किया जाना चाहिए, और enucleated अंडाणुओं को मशीन को लौट जाने की जरूरत है । अंडाणुओं कि एक enucleation में हेरफेर किया जा सकता है की उचित संख्या 10 और 20 के बीच है । अंडाणुओं के बड़े बैचेस के लिए, enucleation कार्यविधि दोहराया जाता है ।
  7. दृश्यमान प्रकाश के अंतर्गत कोशिका द्रव्य में गुणसूत्रों के अभाव की पुष्टि करें (चित्र2c मध्य), फिर enucleated अंडाणुओं mKSOM माध्यम में अच्छी तरह से धो ०.३% dBSA कमी सीबी । ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% सह सेल फ्यूजन तक2 पर मशीन के लिए पकवान परिचय ।
    नोट: enucleation के बाद, ooplasm से निकाले गए कोशिका द्रव्य में धुरी और गुणसूत्र होते हैं ।

6. एक दाता कोशिका का फ्यूजन और एक Enucleated Oocyte

  1. एचवीजे-ए की तैयारी
    1. बर्फ के २६० µ एल जोड़ें-शीत एचवीजे-e निलंबन समाधान lyophilized एचवीजे-e (किट से, सामग्री की तालिकादेखें) और पूरी तरह से निलंबित जब तक पिपेट ऊपर और नीचे ।
      नोट: lyophilized एचवीजे-e की उचित मात्रा एक बोतल में तैयार की जाती है, और २६० µ l एचवीजे-e सस्पेंशन सॉल्यूशन को किट में शामिल किया जाता है ।
    2. एचवीजे-E समाधान के 5 µ l aliquots तैयार करें, और फिर सेल फ्यूजन तक-८० ° c पर स्टोर ।
      सावधानी: ध्यान से बर्फ पर एचवीजे-E का इलाज, क्योंकि यह तापमान के प्रति संवेदनशील है । प्रयोग के पूरा होने के बाद, उचित रूप से वायरस के घटकों को निष्क्रिय करने के लिए एचवीजे-E सामग्री और कंटेनरों आटोक्लेव ।
  2. सेल फ्यूजन
    1. का उपयोग करने से पहले तुरंत सेल फ्यूजन बफर के 20 µ एल के साथ एचवीजे-E समाधान के 5 µ एल पतला । बर्फ पर पतला एचवीजे-ई समाधान जगह का उपयोग करें जब तक ।
      नोट: सेल फ्यूजन बफर एचवीजे-E किट में शामिल है ।
    2. सेल फ्यूजन चैंबर तैयार के रूप में चित्रा 3ए में दिखाया गया है । पिपेट (व्यास के अंदर: १५० µm से २०० µm) का उपयोग कर सेल फ्यूजन चैंबर पर HCZB माध्यम को enucleated अंडाणुओं स्थानांतरण; प्रत्येक समाधान के 4 µ एल प्लेस (HCZB 6% युक्त मध्यम-दाता कोशिकाओं के लिए BSA, एचवीजे-E समाधान, HCZB माध्यम, HCZB माध्यम में 9% PVP) और खनिज तेल की लगभग 1 मिलीलीटर के साथ चैंबर कवर ।
      नोट: एक सेल फ्यूजन प्रक्रिया के दौरान हेरफेर के लिए चैंबर में स्थानांतरित कर रहे हैं कि enucleated अंडाणुओं की उचित संख्या 5 से 30 के लिए है. अंडाणुओं के बड़े बैचों के लिए, सेल फ्यूजन प्रक्रिया दोहराया है । चैंबर के बजाय, एक ६० मिमी पेट्री डिश कवर इस्तेमाल किया जा सकता है, अगर उपलब्ध है ।
    3. 400X magnificationat कमरे के तापमान पर एक खुर्दबीन के नीचे HCZB माध्यम में enucleated अंडाणुओं रखें । महाप्राण micromanipulation पिपेट (6-7 µm भीतरी व्यास फ्लैट समाप्त टिप) का उपयोग कर दाता कोशिकाओं, और एचवीजे-E निलंबन समाधान में कोशिकाओं को निष्कासित ।
    4. फिर एचवीजे-E सस्पेंशन समाधान के साथ एक के बाद एक महाप्राण मेघपुंज कोशिकाओं को समान रूप से एक दूसरे से अलग हो, धारावाहिक सेल संलयन सक्षम करने से । एक होल्डिंग पिपेट का उपयोग करते हुए HCZB माध्यम में enucleated अंडाणुओं रखें । ड्रिल के साथ zona pellucida micromanipulation पिपेट के साथ पीजो पल्स (3-6 की तीव्रता, 2-3 की गति).
    5. zona pellucida में छेद खोलने के बाद, एचवीजे झिल्ली के माध्यम से जाने के बिना एक मेघपुंज कोशिका की मात्रा 5 बार एक खंड के साथ oocyte-E निलंबन समाधान के साथ, oocyte झिल्ली को कसकर एक मेघपुंज सेल जगह है ।
      नोट: मेघपुंज कोशिकाओं के लिए micromanipulation पिपेट की 6-7 µm इनर व्यास फ्लैट समाप्त सुझावों को तैयार करें । पिपेट चिकनी सेल रिलीज को बनाए रखने के लिए नियमित रूप से 9% PVP माध्यम का उपयोग कर धोया जाना चाहिए । कदम 6.2.3-6.2.5 10 मिनट के भीतर समाप्त किया जाना चाहिए, या सेल फ्यूजन की क्षमता कम हो जाएगा । एचवीजे के झिल्ली संलयन गतिविधि-ई autoclaving, डिटर्जेंट, या ७०% इथेनॉल के साथ उपचार द्वारा निष्क्रिय है । प्रयोग के बाद, एचवीजे-E समाधान का उचित निपटारा किया जाना चाहिए ।
    6. सेल फ्यूजन के हेरफेर के बाद, तुरंत mKSOM मध्यम ०.३% dBSA युक्त करने के लिए अंडाणुओं हस्तांतरण, और एक मशीन के लिए कदम के तहत ३७ ° c 5% CO2 के लिए 1 एच ।

7. Trichostatin एक और विटामिन सी के साथ खंगाला अंडाणुओं और उपचार के सक्रियकरण

  1. तैयारी के TSA
    1. 3 µ l aliquots में 5 मिमी TSA समाधान वितरण, और-20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान.
    2. जोड़ें २.५ µ 5 मिमी TSA शेयर समाधान के DMSO के 1 मिलीलीटर (१२.५ µ मीटर की एकाग्रता) ।
    3. सक्रियकरण मध्यम और mKSOM मध्यम (५० एनएम के एक अंतिम एकाग्रता) के 2 मिलीलीटर में १२.५ µ एम TSA स्टॉक समाधान के 8 µ एल पतला ।
  2. वीसी की तैयारी
    1. जोड़ें 1 बाँझ endotoxin के 1 मिलीलीटर में कुलपति के मिलीग्राम-नि: शुल्क पानी, और दुकान पर-20 ° c.
    2. mKSOM मध्यम (10 µ g/एमएल) के अंतिम एकाग्रता के लिए कुलपति स्टॉक समाधान जोड़ें ।
  3. खंगाला गया अंडाणुओं का सक्रियकरण
    1. सेल फ्यूजन के बाद एक घंटे, एक खुर्दबीन (400X) का उपयोग कर खंगाला अंडाणुओं (चित्र बी) में समयपूर्व गुणसूत्र संघनित्र (पीसीसी) की जांच करें ।
    2. अंडाणुओं (चरण १.३) युक्त TSA, और 6 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% कं2 में हवा में (आंकड़ा 3सी) के तहत मशीन के लिए सक्रियण मध्यम स्थानांतरण । SCNT भ्रूण में प्रो-नाभिक के गठन का निरीक्षण करें, तो ०.३% dBSA (चित्रा 2c) युक्त mKSOM माध्यम में TSA उपचार के 2 अधिक घंटे लागू होते हैं ।
  4. mKSOM मध्यम कुलपति और 7 एच के लिए मशीन के साथ पूरक के लिए TSA इलाज भ्रूण स्थानांतरण, के रूप में चित्रा 3 डीमें दिखाया गया है ।
  5. कुलपति उपचार के 7 ज के बाद, mKSOM मध्यम ०.३% dBSA युक्त, और 4 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% कं हवा में2 में मशीन के साथ कुलपति का इलाज भ्रूण स्थानांतरण ।
    नोट: क्लोन चूहों का उत्पादन करने के लिए, एक योनि प्लग पाया जाता है जब दिन पर छद्म गर्भवती महिला चूहों (एमसीएच (ICR)) के oviducts में आकृति विज्ञान सामान्य 2-सेल स्टेज भ्रूण हस्तांतरण (pseudopregnancy के दिन ०.५) 15. १९.५ दिनों के बाद सीजेरियन सेक्शन के बाद प्रत्यारोपण स्थलों और नवजात शिशुओं की संख्या में गिरावट दर्ज की गई है ।

Representative Results

क्लोन माउस भ्रूण का उत्पादन करने के लिए, मेघपुंज कोशिकाओं और भ्रूण fibroblast कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया । oocyte सक्रियण के बाद 2-कक्ष चरण को खंगाला अंडाणुओं और विकास की संख्या तालिका 1में दिखाए जाते हैं । परमाणु गठन की एक बहुत ही उच्च दर (८९ से १००%) और 2 के लिए विकास-सेल स्टेज (७७ करने के लिए ८९%) सभी शर्तों के तहत मनाया गया । क्लोन भ्रूण, जो मेघपुंज कोशिकाओं से प्राप्त की और 2 सेल चरण के लिए विकसित किए गए थे में से कुछ, छद्म गर्भवती महिलाओं के oviducts को हस्तांतरित किया गया । ७२ हस्तांतरित भ्रूण से छह क्लोन वंश तीन गर्भवती महिलाओं से TSA और कुलपति के धारावाहिक उपचार (चित्रा 4) द्वारा उत्पादित किया गया । लगभग 15% क्लोन भ्रूण को इस SCNT प्रक्रियाओं का पालन करके अवधि के लिए विकसित करने के लिए सूचित किया गया है12। इसके अतिरिक्त, क्लोन 2 के हस्तांतरण-अंय संस्थानों में सेल भ्रूण 9 से 15% जीवित वंश है, जो क्लोन भ्रूण पर एकल TSA उपचार से बेहतर विकास का प्रतिनिधित्व हासिल किया है । इसके अलावा, TSA और कुलपति के साथ उपचार काफी इन विट्रो भ्रूण विकास ब्लास्टोसिस्ट चरण (तालिका 2, P < 0.05, छात्र के t-परीक्षण) के लिए में की दक्षता में सुधार । इन विट्रो में विकास के आंकड़ों का प्रदर्शन है कि TSA और कुलपति का सकारात्मक प्रभाव न तो माउस उपभेदों और न ही सेल प्रकार के द्वारा सीमित है । इन परिणामों का सुझाव है कि इस SCNT विधि क्लोन भ्रूण के विकास की क्षमता की सुविधा ।

Figure 1
चित्रा 1: dBSA की तैयारी ।
dBSA समाधान तैयार करने के लिए चरण दर चरण प्रक्रियाएं दर्शाई गई हैं । आयन एक्सचेंज की हद तक मोतियों का रंग बदलने से ंयाय किया जा सकता है । ऊपरी बाएँ आंकड़ा BSA के १.२ ग्राम कमरे के तापमान पर बाँझ पानी की 10 मिलीलीटर में भंग कर रहा है कि पता चलता है. बाद BSA भंग है, आयन विनिमय राल मोतियों (ऊपरी दाएँ) जोड़ रहे हैं. जब आयन के साथ BSA समाधान के मिश्रण-विनिमय राल मोती नीले-हरे से सोने के लिए रंग बदलने के लिए (नीचे सही), ताजा लोगों के साथ मोतियों की जगह । नीचे-बाएं चित्रा से पता चलता है कि मोतियों का रंग नीला-हरा रहता है, और आयन एक्सचेंज समाप्त हो गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Enucleation प्रक्रियाओं ।
(क) enucleation कक्ष का चित्रण. अंडाणुओं के Enucleation सीबी के साथ HCZB माध्यम में किया जाता है । पीजो ड्राइविंग सिस्टम के लिए, 9% PVP माध्यम के एक स्थान enucleation के लिए ग्लास पिपेट तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है । धब्बे खनिज तेल द्वारा कवर कर रहे हैं । (ख) एक आरेख और एक micrograph enucleation से पहले धुरी और गुणसूत्रों की स्थिति को दिखाते हैं । काले ऐरोहेड: धुरी और गुणसूत्रों । Red ऐरोहेड: पहले ध्रुवीय शरीर । (ग) सफल enucleation दिखाने के लिए एक आरेख और एक micrograph । काले ऐरोहेड: धुरी और गुणसूत्रों । Red arrowhead: पहले ध्रुवीय शरीर । ब्लू arrowhead: zona pellucida में छेद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल फ्यूजन प्रक्रियाओं और SCNT भ्रूण की संस्कृति हालत ।
(A) सेल फ्यूजन चैंबर का एक उदाहरण । सेल फ्यूजन 6% dBSA युक्त HCZB माध्यम में किया जाता है । 9% PVP माध्यम की एक जगह सेल फ्यूजन के लिए ग्लास पिपेट तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है । धब्बे खनिज तेल द्वारा कवर कर रहे हैं । (B) एक आरेख और समयपूर्व गुणसूत्र संघनित्र के एक micrograph ने सेल फ्यूजन (black arrowhead) के बाद एक घंटे का गठन किया । (ग) एक आरेख और एक micrograph परमाणु संरचना के गठन के छह घंटे के बाद सक्रियण (black ऐरोहेड) । (घ) SCNT भ्रूण के लिए TSA, कुलपति, और dBSA उपचार की योजना । हरा तीर TSA के साथ उपचार का प्रतिनिधित्व करता है, ०.३% dBSA (नीला तीर) के साथ युक्त mKSOM माध्यम के तहत कुलपति (पीला तीर) के साथ मशीन द्वारा पीछा किया । तीर सिर मध्यम बदलने के लिए समय का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: क्लोन वंश सिर्फ गर्भावस्था के १९.५ दिनों के बाद सीजेरियन अनुभाग के बाद मेघपुंज कोशिकाओं से व्युत्पंन ।
वहां ऊपर पंक्ति में अपरा हैं । क्लोन वंश यहां दिखाया तीन पालक माताओं से एक परमाणु अंतरण प्रयोग में उत्पंन किया गया । अपरा आकार १.५ से 2 बार था उन विट्रो निषेचन में द्वारा उत्पादित उन के आकार से भी बड़ा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समूह दाता कोशिका प्रकार माउस तनाव नहीं. इस्तेमाल अंडाणुओं की नहीं. अंडाणुओं से जुड़े नहीं. अंडाणुओं के समयपूर्व गुणसूत्र संघनित्र दिखा रहा है नहीं. का अंडाणुओं दिखा pronuclei गठन (%) नहीं. की pronuclei-गठित अंडाणुओं कि विकसित
2-सेल भ्रूण (%)
TSA, कुलपति मेघपुंज C57BL/6 × DBA/ ८४ ८२ ८२ ८१ (९९) ७२ (८९)
इलाज मेघपुंज C57BL/6 × DBA/ ८४ ८२ ८२ ८२ (१००) ६८ (८३)
TSA, कुलपति भ्रूण fibroblast एमसीएच (ICR) × एमसीएच (ICR) २०२ १७१ १६९ १५१ (८९) १२४ (८२)
इलाज भ्रूण fibroblast एमसीएच (ICR) × एमसीएच (ICR) २०१ १७१ १४७ १४२ (९७) १०९ (७७)

तालिका 1: पर TSA और कुलपति उपचार के प्रभाव इन विट्रो 2-सेल चरण के लिए क्लोन माउस भ्रूण का विकास ।

समूह दाता कोशिका प्रकार माउस तनाव नहीं. 2-सेल भ्रूण का इस्तेमाल किया नहीं. प्रत्येक चरण के लिए विकसित 2-सेल भ्रूण (%)
4-सेल मोरूला ब्लास्टोसिस्ट
TSA, कुलपति मेघपुंज C57BL/6 × DBA/ १५२ १५२ (१००) १४९ (९८) १३५ (८९) अ
इलाज मेघपुंज C57BL/6 × DBA/ ८३ ४७ (५७) ४१ (४९) ३२ (३९) ख
TSA, कुलपति भ्रूण fibroblast एमसीएच (ICR) × एमसीएच (ICR) १२४ ११० (८९) १०१ (८१) ८८ (७१) ग
इलाज भ्रूण fibroblast एमसीएच (ICR) × एमसीएच (ICR) १०९ ५४ (५०) ४५ (४१) 29 (27) d
a-b, c-d एक ही दाता कोशिकाओं के भीतर अलग सुपरस्क्रिप्ट महत्वपूर्ण अंतर का प्रतिनिधित्व करते हैं (P < ०.०५)

तालिका 2: पर TSA और कुलपति उपचार के प्रभाव इन विट्रो ब्लास्टोसिस्ट चरण के लिए क्लोन माउस भ्रूण का विकास ।

Discussion

अंत में, इन परिणामों का सुझाव है कि प्रस्तुत SCNT विधि तकनीकी कठिनाइयों को कम कर सकता है, और आनुवंशिक संशोधनों और mRNA पूरकता की आवश्यकता के बिना SCNT की क्षमता में वृद्धि (तालिका 1, तालिका 2), और सुनिश्चित क्लोन भ्रूण के स्थिर उत्पादन । इस विधि हमें बेहतर अस्तित्व दर और सरलीकृत प्रोटोकॉल के कारण पारंपरिक तरीकों से अधिक SCNT भ्रूण पुनर्निर्माण के लिए सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल में, एक महत्वपूर्ण कदम सेल फ्यूजन है । सफलतापूर्वक क्लोन चूहों का उत्पादन करने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि एचवीजे की उचित मात्रा ई प्रोटोकॉल में वर्णित सेल संलयन प्रक्रिया के दौरान बनाए रखा है और अंडाणुओं के लिए कदम 6.2.3-6.2.5 के दौरान 10 मिनट के भीतर मशीन को लौट जाने की जरूरत है । चूंकि 20 से 30 दाता कोशिकाओं को एक साथ एचवीजे-E हेरफेर पिपेट में एक समय में aspirated जा सकता है, एक आपरेशन द्वारा प्राप्त अंडाणुओं की संख्या मौजूदा पद्धति की तुलना में बड़ा है । अंत में, हम के बारे में उत्पादन कर सकते है 20 से 30 फिर से 10 मिनट के भीतर अंडाणुओं का निर्माण किया । यहां तक कि जब अंडाणुओं (१०० या अधिक) के एक बड़े बैच के साथ काम कर रहे हैं, सेल फ्यूजन प्रक्रिया एक घंटे या उससे कम कदम 6.2.3-6.2.5 दोहराने से लेना चाहिए । विधि और यहां प्रस्तुत तकनीक सरल तकनीकी आवश्यकताओं के साथ कुशल प्रोटोकॉल के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

वर्तमान में, आणविक SCNT भ्रूण के विकास अंतर्निहित तंत्र अभी भी अस्पष्ट है । यह सुधार SCNT विधि भी ऐसे reprogramming तंत्र का अध्ययन करने के लिए योगदान देता है, क्योंकि इस विधि केवल एक प्रयोग में कई क्लोन भ्रूण का उत्पादन कर सकते हैं । इस विधि सेल फ्यूजन के लिए बरकरार कोशिका झिल्ली के साथ दैहिक कोशिकाओं का उपयोग करता है । इस प्रकार, यह इस approach पूंछ युक्ति कक्ष16, sertoli कक्ष17, और भ्रूण स्टेम (ES) कक्ष18जैसे अंय कक्षों के लिए लागू करने के लिए संभव हो सकता है । जब पारंपरिक SCNT तरीके पूंछ टिप कोशिकाओं के रूप में अपेक्षाकृत बड़ी कोशिकाओं, इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाता है, सीधे oocyte कोशिका द्रव्य में, यह और भी तकनीकी रूप से रहते भ्रूण प्राप्त करने की मांग हो जाता है । इसके अलावा, अपेक्षाकृत कठिन कोशिकाओं, जैसे sertoli कोशिकाओं, इंजेक्शन के लिए pipetting द्वारा तोड़ने के लिए मुश्किल हैं । जब इन विभिंन प्रकार के सेल माना जाता है, सेल संलयन विधि का उपयोग एचवीजे-E सरल और प्रभावी है । हालांकि मूल्य और एचवीजे-e की सुरक्षा के कायल19,20का प्रदर्शन किया गया है, यह फिर से महत्वपूर्ण हो सकता है एचवीजे का उपयोग करने की व्यवहार्यता पर विचार-कृषि या जैव चिकित्सा प्रयोजनों के लिए क्लोन पशुओं के उत्पादन के लिए ई ।

इसके अलावा, हाल ही में एक समूह सफलतापूर्वक मूत्र कोशिकाओं21से व्युत्पंन क्लोन चूहों का उत्पादन किया । लुप्तप्राय स्तनधारी प्रजातियों से बचाव के लिए, इसके बाद से SCNT एक गैर इनवेसिव तरीके से एकत्र कोशिकाओं का उपयोग कर, जैसे मूत्र कोशिका, आदर्श हो जाएगा । हाल ही में, एक अंय समूह सीधे प्रतिजन-विशिष्ट CD4+ टी कोशिकाओं22का उपयोग कर चूहों क्लोन उत्पंन किया है । यह अगर इस विधि भी कुशलतापूर्वक ऐसी कोशिकाओं से चूहों क्लोन करने के लिए लागू होता है की जांच करने के लिए दिलचस्प होगा । इसके अलावा, Latrunculin एक enucleation और parthenogenetic SCNT के अंडाणुओं सक्रियण के दौरान actin बहुलकीकरण बाधा के लिए एक बेहतर विकल्प के रूप में सूचित किया गया है23। भविष्य के अध्ययन से पता चलता है कि Latrunculin एक उपचार, बजाय cytochalasin बी के, आगे क्लोन वंश की पीढ़ी में सुधार हो सकता है । इसके अतिरिक्त, TSA उपचार सफलतापूर्वक चूहों, सूअरों24में इस्तेमाल किया गया है, और25 खरगोशों उपचार के समय, अवधि, और एकाग्रता बदलकर । इसके अलावा, कुलपति न केवल सुअर का SCNT 10 में भ्रूण विकास को बढ़ाता है, लेकिन यह भी मानव और चूहों में आईपीएस सेल उत्पादन में सुधार 26. इस प्रकार, यह अटकलें है कि TSA और कुलपति उपचार भी अंय स्तनधारी प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है प्रशंसनीय है, और हम प्रत्येक प्रजातियों के लिए tsa और कुलपति के उपचार के समय का अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।

अंत में, इस विधि सरल प्रक्रियाओं के साथ दक्षता का एक व्यावहारिक स्तर के साथ क्लोन चूहों उत्पन्न करने के लिए यह संभव बनाना होगा. इसलिए, इस अध्ययन के परिणाम हमें दुर्लभ पशुओं के आनुवंशिक संसाधनों के संरक्षण के लिए SCNT प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए, और परमाणु reprogramming और जल्दी भ्रूण विकास के आणविक तंत्र को समझने के लिए नेतृत्व कर सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को JSPS KAKENHI ग्रांट नंबर्स JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 को बेसिक साइंस रिसर्च प्रोजेक्ट्स (१५०८१० से. एम.) के लिए सुमितोमो. एम. फाउंडेशन ग्रांट द्वारा सपोर्ट किया गया । Kindai यूनिवर्सिटी रिसर्च ग्रांट (15-आई-2 टू. एम. और एमए) । M.O. कैंसर रिसर्च यूके (C6946/A24843) और वेलकम ट्रस्ट (203144/z/16/z) द्वारा प्रदत्त मुख्य समर्थन स्वीकार करते हैं ।  हम सुश्री एन य्-Kamimura और श्री जे Horvat को प्रूफ रीडिंग के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich, Co., Lcc. 28-2270-5 For medium
KCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 169-03542 For medium
KH2PO4 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 165-04242 For medium
MgSO4 · 7H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 137-00402 For medium
CaCl2 · 2H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 039-00431 For medium
D(+)-Glucose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 041-00595 For medium
Sodium Pyruvate Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 199-03062 For medium
L-Glutamine Sigma-Aldrich, Co., Lcc. G3126 For medium
Polyvinylpyrrolidone Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 168-17042 For medium
NaHCO3 Nacalai tesque, Inc. 31213-15 For medium
Sodium DL-Lactate Nacalai tesque, Inc. 31605-72 For medium
Penicillin Meiji Seika Pharma Co., Ltd. 4987222637671 (GTIN-13) For medium
Streptomycin Meiji Seika Pharma Co., Ltd. 4987222665643 (GTIN-13) For medium
Sterile water, endotoxin free Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 196-15645 For medium
EDTA · 2Na Dojindo Lab. 345-01865 For medium
Phenol red Sigma-Aldrich, Co., Lcc. P0290 For medium
HEPES sodium salt Sigma-Aldrich, Co., Lcc. H3784 For medium
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich, Co., Lcc. P8136 For medium
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich, Co., Lcc. A3311 For medium
BT AG 501-X8 (D) Resin Bio-Rad Lab., Inc. 143-7425 For preparation of dBSA
Hyaluronidase Sigma-Aldrich, Co., Lcc. H3506 For collection of oocytes and cumulus cells
Cytochalasin B Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 034-17554 For enucleation and oocytes activation
Piezo micro manipulator Prime tech, Co., Ltd. PMM-150FU For micromanipulation
HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF Ishihara sangyo kaisha, Ltd. CF001 Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion
SrCl2 · 6H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 193-09442 For oocytes activation
EGTA Sigma-Aldrich, Co., Lcc. E8145 For oocytes activation
Dimethyl sulfoxide Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 045-24511 For solvent
Trichostatin A Sigma-Aldrich, Co., Lcc. T1952 For incubating with SCNT embryos
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich, Co., Lcc. A5960 For incubating with SCNT embryos
Mineral oil Sigma-Aldrich, Co., Lcc. M8410 For covering medium

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विकास जीवविज्ञान अंक १३४ दैहिक कोशिका नाभिकीय अंतरण हिस्टोन Deacetylase अवरोध करनेवाला Trichostatin ए हिस्टोन H3 Lysine 9 Trimethylation विटामिन सी विज्ञानी गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन माउस जापान लिफाफे का Hemagglutinating वायरस
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Azuma, R., Miyamoto, K., Oikawa, M., Yamada, M., Anzai, M. Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer. J. Vis. Exp. (134), e57036, doi:10.3791/57036 (2018).

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