Summary
Vi beskriver en dramatisk forbedret metode for musen kloning trichostatin A, vitamin C og deionisert bovin serum albumin. Vi viser en forenklet, reproduserbare protokoll som støtter effektiv utvikling av klonet embryo. Denne metoden kan derfor bli en standardisert prosedyre for musen kloning.
Abstract
Somatisk cell nuclear transfer (SCNT) tilbyr en unik mulighet til direkte produsere en klonet dyr fra en donor celle, og det krever bruk av dyktige teknikker. I tillegg har effektiviteten ved kloning vært lav siden vellykket produksjon av klonede dyr, spesielt mus. Det har vært mange forsøk på å effektivisere kloning, og trichostatin en (TSA), en histone deacetylase hemmere, har vært mye brukt til å forbedre effektiviteten av kloning. Her rapporterer vi dramatisk forbedret kloning metode i mus. Denne somatisk cell nuclear transfer metoden medfører behandling av Hemagglutinating virus Japan konvolutten (HVJ-E), som muliggjør enkel manipulering. Videre er behandling med to små molekyler, TSA og vitamin C (VC), med deionisert bovin serum albumin (dBSA), svært effektiv for embryonale utvikling. Dette krever ekstra injeksjon verken genetisk manipulasjon, og dermed presenterer en enkel, egnet metode for praktisk bruk. Denne metoden kan bli en teknisk mulig tilnærming for forskere å produsere genmodifiserte dyr fra kulturperler celler. Videre kan det være en nyttig måte for redning av truede via kloning.
Introduction
SCNT teknologien kan klonede dyr med bare én somatisk cell eller en kjerne skal overføres til en enucleated oocyte. En av hensiktene med SCNT teknikken er avledning av kjernefysiske overføringslinjene embryonale stamceller (NT-ESCs) fra klonet embryo. I 1998, Wakayama et al. rapportert produsere blitt klonet mus navngitt Cumulina for første gang1. Kloning av mus har blitt mye studert siden da, og mange viktige innsikter til kjernefysiske omprogrammering av somatiske kjerner er anskaffet. På den annen side, denne teknikken er ledsaget av tallrike micromanipulation skritt som er ganske vanskelig å mester, krever intensiv trening av mer enn 3 måneder2.
Produksjon av klonet mus med SCNT utviklet seg fra den opprinnelige Honolulu metode1, electrofusion metode3, til cellen smelting metoden av Hemagglutinating virus Japan (HVJ)4. Men direkte injeksjon av en cellekjernen gjennom cytomembrane tendens til å påvirke detrimentally oocyte overlevelse. Electrofusion er lav i effektivitet, siden hver celle membran har forskjellige hardhet, gjør det vanskelig å bestemme en optimal tilstand. Håndtering av HVJ er arbeidskrevende fordi det krever bestemt utstyr for sikkerhet forskere og forsøksdyr. Nylig for å sikring donoren cellen og oocyte cytoplasma, har HVJ-E vært brukt5. HVJ-E bare har evnen å fusjonere membraner uten proliferativ eller smittsomme evne til virus. Genomic RNAs av HVJ er helt deaktivert i HVJ-E. Bruken av HVJ-E støtter enkel håndtering av cellen fusion under SCNT.
Flere rapporter har vist at behandling av SCNT embryo med TSA, en histone deacetylase hemmere, forbedrer betraktelig produksjonen effektiviteten av live pups fra mindre enn 1% til 6,5%6,7. TSA behandling akselererer omprogrammering gjennom å endre histone merker i SCNT embryo8. Nylig injeksjon av bestemt mRNAs, histone lysin demethylase og 4 (KDM4), som fjerner histone H3 lysin 9 (H3K9) trimethylation i SCNT embryoer, spesielt på reprograming-resistente regioner, har vist seg å øke utviklingen av klonet musen embryo9. I mellomtiden har VC, som også serverer som histone modifier, redusert trimethylation H3K910. Videre forbedrer VC embryonale utvikling i svin SCNT10. Det har blitt rapportert at injeksjon av dBSA i SCNT embryo fører til forbedring av embryonale utvikling11.
Vi fant tidligere at kombinasjonen av små molekyler, nemlig TSA og VC, sammen med dBSA, dramatisk forbedret utviklingen av SCNT embryo12. Her, detalj vi tidligere rapporterte SCNT metoden for mus, som representerer svært effektiv og enkel kloning prosedyrer12. Vi beskriver også håndtering av HVJ-E. Disse kan hjelpe mange forskere innen utviklingsmessige og biologi bevare genetiske ressurser eller produsere genmodifiserte dyr gjennom denne SCNT metoden.
Protocol
Alle dyr prosedyrer likedannet retningslinjene i Kindai University og bruk av forsøksdyr.
1. utarbeidelse av kultur medier
- Forberede modifisert KSOM (mKSOM) medium embryoet kultur, bestående av 95 mM NaCl, 2,5 KCl, 0,35 mM KH2PO4, 0.2 mM MgSO4 · 7T2O, 1.71 mM CaCl2 · 2H2O, 0.2 mM D (+)-glukose, 0.2 mM natrium Pyruvate, 1.0 mM L-glutamin, 1.0 finans Polyvinylpyrrolidone (PVP), 25.07 mM NaHCO3, 10 mM natrium DL-laktat 0,05 finans Penicillin og 0,05 finans Streptomycin i sterilt vann.
- Forberede Hepes-bufret CZB (HCZB) medium embryoet manipulasjon, bestående av 81,5 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1,7 mM CaCl2 · 2H2O, 1,18 mM MgSO4 · 7T2O, 1,18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2Na, 36.1 mM natrium DL-laktat, 5.55 mM D (+)-glukose, 0.025 g/mL Penicillin, 0,035 finans Streptomycin, 0.014 mM fenol Red, 1.0 finans polyvinylalkohol, 5.0 mM NaHCO3og 20.0 mM Hepes natrium salt i sterilt vann.
- Forberede aktivering mediet oocyte aktivisering: mKSOM medium med 50 nM TSA, 2 mM EGTA, 5 µg/mL cytochalasin B (CB) og 5 mM SrCl2.
2. forberedelse av vaskebuffer Bovine Serum Albumin (dBSA)
- Løses 1,2 g av bovin serum albumin (BSA) i 10 mL av sterilt vann ved romtemperatur (en siste konsentrasjon av 12%).
- Tilsett ca 0,12 g blandet ionebytte harpiks perler til ovennevnte tilberedt 12% av BSA i sterilt vann ved romtemperatur med mild omrøring.
- Når perlene endre farge fra blågrønt til gull, gjenopprette den supernatant løsningen bruker en pipette. Deretter erstatte perler med friskt de (figur 1).
Merk: Utskifting av perler er normalt utføres én gang. Det krever muligens noen erstatninger fullstendig deionization. Bare som en guide, hvis fargen på perlene uendret fra blågrønt til gull, indikerer at ionebytte er fullført. - Gjenopprette løsningen etter bekrefter at det er ingen fargeendring i perler.
Merk: Hvis den gjenopprettede løsningen blir skyet, sentrifuge for å hindre tilstopping filteret (175 x g, 5 min). - Supplere den innhentede løsningen med 250 µL av 10,5% NaHCO3.
Merk: Denne prosessen er ment for det dBSA å nøytralisere pH tilstand. NaHCO3 kan imidlertid være unnværlig. - Sterilisere nedbryting bruke filtere 0.45-µm og lagre på 20 ° C som dBSA lager løsning.
3. oocyte samling
Merk: Alle mus ble opprettholdt i lys-kontrollerte og klimatiserte rom.
- Super-eggløsning hver kvinnelige B6D2F1 mus (alderen 8-10 uker) ved intraperitoneal injeksjon av 7,5 IE gravid mare serum gonadotropin (PMSG) og 7,5 IE humant choriongonadotropin (hCG) 48 timer etter PMSG injeksjon.
- Utføre euthanasia cervical forvridning 14-16 h etter hCG injeksjon. Incise magen til skjede bruker standard disseksjon teknikker13. Kort, klype i huden og gjør en liten lateral snitt på midtlinjen med saks. Holde huden fast over og under snittet og huden mot hodet og halen. Skjær peritoneum med saks, presse kveiler av tarmen ut av veien og bekrefte tilstedeværelse av to hornene av livmoren, oviducts og eggstokkene.
- Extirpate oviducts med liten rett saks og pinsett, sted på arket filter å tørke blodet av av overflaten. Angi oviducts i mineralolje. Deretter kuttet opp ampulla av oviduct over disseksjon pinner og flytte cumulus-oocyte komplekser kommer fra ampulla i oviduct i 200 µL dråper HCZB medium med 0,1% hyaluronidase. Inkuber i 5 min på en oppvarming plate.
Forsiktig: En eksponering av lengre enn 10 minutter i HCZB medium med 0,1% hyaluronidase ville være skadelig for oocytes. - Bekreft at cumulus cellene blir løslatt fra cumulus-oocyte komplekser under en stereomicroscope, overføring andre meiotic metaphase (MII) scenen oocytes med noen gjenværende cumulus celler til mKSOM medium med 0,3% dBSA. Deretter vaske MII scenen oocytes fire ganger av pipettering opp og ned (bruker en pipette for < 100 µm indre diameter) i mKSOM medium med 0,3% dBSA for å demontere de gjenværende cumulus cellene.
Merk: Bruk av en liten pipette forenkler avdeling av cumulus cellene. - Inkuber Mll scenen oocytes i mKSOM medium med 0,3% dBSA på 37 ° C under 5% CO2 inkubator til enucleation.
Merk: En liten pipette diameter som er litt større enn oocyte anbefales.
4. forberedelse av Donor cellene til Nuclear Transfer
- Etter trinn 3.3-3,5, er avdekt oocytes isolert fra cumulus-oocyte komplekser. Overføre en liten mengde (ca 2 µL) gjenværende cumulus cellene spres fra cumulus-oocyte komplekser i HCZB medium med 0,1% hyaluronidase til HCZB medium med 6% dBSA ved å bruke en pipette under en stereomicroscope.
- Plass cumulus cellene i HCZB medium med 6% dBSA på oppvarming plate på 37 ° C til nødvendig for SCNT.
Merk: Når fibroblast celler (f.eks., murine føtal fibroblast celler) er brukt som giver celler, koble cellene fra en vev kultur parabol og sentrifuge dem i pellets. Resuspend pellets celler i HCZB medium som inneholder 6% dBSA.
5. enucleation av Oocytes
- Forberede 9% PVP medium ved å legge til 0.9 g PVP 10 mL HCZB medium, holde i kjøleskapet over natten (4 ° C), og deretter sterilisere den med filtere 0,45 µm.
- Forberede CB lager løsninger (konsentrasjon av 1 mg/mL) ved å legge til 5 mg CB 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO). Fortynne CB lager løsningen med HCZB medium (en siste konsentrasjon av 5 µg/mL) og bruke som enucleation løsning.
- Vask Mll scenen oocytes i 20 µL av HCZB medium som inneholder 5 µg/mL CB (enucleation løsning) av inhaling og exhaling gjennom sterilisert Pipetter (innvendig diameter: 150 µm til 200 µm). Gjenta vask fem ganger. Vent ca 10 min på oppvarming plate i enucleation løsning før du starter enucleation prosessen.
- Forberede enucleation kammeret som vist i figur 2A. Overføre Mll oocytes til enucleation kammeret av inhaling og exhaling bruker Pipetter (innvendig diameter: 150 µm til 200 µm); Plasser 4 µL enucleation løsning og dekke til kammeret mineralolje.
Merk: I stedet for et kammer, en cover av en 60 mm Petriskål kan brukes. - Identifisere spindler og kromosomene av MII scenen oocyte under et mikroskop (400 X) i romtemperatur. Plasser Mll scenen oocyte med uttales første polar kroppen, slik at plasseringen av spindel og kromosom er 3 eller 9 o'clock (figur 2B) posisjon ved hjelp av en holder pipette og brønnene.
Merk: Mikroskopet brukes har linser av 400 X forstørrelse totalt. Også linsen N.A er 5 X / 0,12 og 40 X / 0.55. Piezo puls kjøring av pipette tillater rask boring av zona pellucida. I tillegg er en lasersystem (f.eksXYClone) også anvendelig for boring av zona pellucida i stedet for piezo kjøring systemet. - Angi piezo puls intensiteten til 3-6, og bore til zona pellucida bruker en micromanipulation pipette (7-8 µm indre diameter flat endte tips) med piezo pulsen kjøring. Etter åpning hull i zona pellucida, helt enucleate spindler og chromosomes med minimalt med cytoplasma (figur 2C).
Merk: Under denne prosessen oocytes pleier å tett feste til parabolen bunnen eller Pipetter på grunn av mediet uten BSA14. Enucleation prosessen må fullføres 10 min, og de enucleated oocytes må returneres til inkubator. Riktig antall oocytes som kan manipuleres i en enucleation er mellom 10 og 20. For større batcher av oocytes gjentas enucleation fremgangsmåten. - Bekrefte fravær av kromosomer i cytoplasma under synlig lys (figur 2C, midten), og vask enucleated oocytes i mKSOM medium med 0,3% dBSA mangler CB. Introdusere rett inkubatoren på 37 ° C under 5% CO2 til cellen smelting.
Merk: Etter enucleation, cytoplasma fjernet fra ooplasm inneholder spindler og kromosomer.
6. fusjon av en Donor celle og en Enucleated Oocyte
-
Utarbeidelse av HVJ-E
- Legge til 260 µL av iskalde HVJ-E suspensjonen løsning lyofilisert HVJ-E (fra settet, se Tabellen for materiale) og Pipetter opp og ned til fullt suspendert.
Merk: Riktig mengde lyofilisert HVJ-E er utarbeidet i en flaske, og 260 µL HVJ-E suspensjonen løsning er inkludert i pakken. - Forberede 5 µL dele HVJ-E-løsning, og deretter lagre på-80 ° C til cellen smelting.
Forsiktig: Behandle nøye HVJ-E på is, siden det er temperatur-sensitive. Etter ferdigstillelse av eksperimentet, riktig autoklav HVJ-E materialer og beholdere for å helt deaktivere virus komponenter.
- Legge til 260 µL av iskalde HVJ-E suspensjonen løsning lyofilisert HVJ-E (fra settet, se Tabellen for materiale) og Pipetter opp og ned til fullt suspendert.
-
Cellen Fusion
- Fortynne den 5 µL HVJ-E løsning med 20 µL av cellen smelting bufferen umiddelbart før bruk. Plass utvannet HVJ-E løsningen på is til bruk.
Merk: Cellen smelting bufferen er inkludert i HVJ-E kit. - Forberede cellen smelting kammeret som vist i figur 3A. Overføre enucleated oocytes til HCZB medium på cellen smelting kammeret bruker Pipetter (innvendig diameter: 150 µm til 200 µm); sted 4 µL av hver løsning (HCZB medium som inneholder 6% -BSA for giver celler, HVJ-E løsning, HCZB medium, 9% PVP i HCZB medium) og dekke til kammeret ca 1 mL av mineralolje.
NOTE Det aktuelle antallet enucleated oocytes som overføres til kammeret manipulering under én celle fusion prosedyren er fra 5 til 30. For større batcher av oocytes gjentas cellen smelting prosedyren. I stedet for kammer, kan en 60 mm Petriskål cover brukes, hvis tilgjengelig. - Plass de enucleated oocytes i HCZB medium under et mikroskop ved 400 X magnificationat. Sug opp donor cellene med micromanipulation Pipetter (6-7 µm indre diameter flat-slutt tip), og utvise celler i HVJ-E suspensjonen løsning.
- Deretter Sug opp cumulus celler ettall med HVJ-E suspensjon løsningen være like atskilt fra hverandre, aktivere føljetong cellen smelting. Vær de enucleated oocytes HCZB mediet bruker en holde pipette. Bore zona pellucida med micromanipulation pipette med piezo pulsen (intensitet av 3-6, hastigheten på 2-3).
- Etter åpning hullet i zona pellucida, Plasser en cumulus celle tett til oocyte membranen, sammen med HVJ-E suspensjonen løsning med volum 5 ganger volumet av en cumulus celle, uten å gå gjennom oocyte membran.
Merk: Forberede 6-7 µm indre diameter flat endte tips av micromanipulation Pipetter cumulus celler. Pipetter må vaskes regelmessig ved hjelp av 9% PVP medium for å opprettholde glatt celle utgivelsen. Trinn 6.2.3 - 6.2.5 må være ferdig innen 10 min, eller effektiviteten av cellen smelting blir lavere. Membran fusion aktivitet av HVJ-E er inaktivert av autoklavering, behandling med vaskemiddel eller 70% etanol. Etter eksperimentet, må HVJ-E løsningen riktig avhendes. - Etter manipulasjon av cellen fusion, raskt overføre oocytes til mKSOM medium med 0,3% dBSA, og flytte til en inkubator på 37 ° C under 5% CO2 1t.
- Fortynne den 5 µL HVJ-E løsning med 20 µL av cellen smelting bufferen umiddelbart før bruk. Plass utvannet HVJ-E løsningen på is til bruk.
7. aktivisering av rekonstruert Oocytes og behandling med Trichostatin A og C-Vitamin
-
Utarbeidelse av TSA
- Dispensere 5 mM TSA løsning i 3 µL dele og lagre løsningen på 20 ° C.
- Legge til 2,5 µL av 5 mM TSA lagerløsning 1 mL av DMSO (en konsentrasjon av 12.5 µM).
- Fortynne 8 µL av 12.5 µM TSA lagerløsning i 2 mL for aktivisering medium og mKSOM medium (en siste konsentrasjon av 50 nM).
-
Utarbeidelse av VC
- Legg 1 mg av VC i 1 mL steril endotoxin uten vann, og lagre på 20 ° C.
- Legge til VC lager løsningen mKSOM medium (en siste konsentrasjon av 10 µg/mL).
-
Aktivering av de rekonstruerte Oocytes
- En time etter celle fusion, sjekk tidlig kromosom kondens (PCC) i de rekonstruerte oocytes (figur 3B) bruker et mikroskop (400 X).
- Overføre rekonstruert oocytes til aktivisering medium (se trinn 1.3) som inneholder TSA og ruge for 6 h 37 ° C under 5% CO2 i luften (Figur 3 c). Observere dannelsen av pro-kjerner i SCNT embryoer, deretter bruke 2 timer av TSA behandling i mKSOM medium med 0,3% dBSA (figur 2C).
- Overføre de TSA-behandlet embryoene til mKSOM middels supplert med VC og ruge 7 h, som vist i figur 3D.
- Etter 7 h av VC behandling, overføre de VC-behandlet embryoene til mKSOM medium med 0,3% dBSA, og ruge i 4 dager på 37 ° C under 5% CO2 i luften.
Merk: For å produsere klonet mus, overføre morphologically normal 2-celle scenen embryo i oviducts av pseudo gravid kvinne mus (MCH(ICR)) på dagen når en vaginal plugg er funnet (dag 0,5 av pseudopregnancy)15. Etter 19,5 dager registreres antallet implantasjon nettsteder og nyfødte etter keisersnitt.
Representative Results
For å produsere klonet mouse embryoer, ble cumulus cellene og fosterets fibroblast brukt. Antall rekonstruert oocytes og utvikling til 2-celle scenen etter oocyte aktivisering er vist i tabell 1. En meget høy rate av pronuclear formasjon (89-100%) og utvikling til 2-celle scenen (77 til 89%) ble observert under alle forhold. Noen av klonet embryo, som var avledet fra cumulus cellene og utviklet på 2-celle scenen, ble overført til oviducts av pseudo gravide kvinner. Seks klonet avkom av 72 overførte embryo ble produsert fra tre gravide kvinner av føljetong behandling av TSA og VC (Figur 4). Ca 15% av klonet embryo har blitt rapportert å utvikle til begrepet ved å følge denne SCNT prosedyrer12. I tillegg har overføring av klonet 2-celle embryo på andre institusjoner oppnådd 9 til 15% live avkom, som representerer bedre utvikling enn enkelt TSA behandling på klonet embryo. Videre behandling med TSA og VC forbedret effektiviteten av i vitro embryonale utvikling til blastocyst stadiet (tabell 2, P < 0,05, Student t-test). Disse i vitro utviklingsmessige data viser at den positive effekten av TSA og VC er begrenset av musen stammer verken av celletyper. Disse resultatene tyder på at denne SCNT metoden muliggjør utviklingsmessige evne til klonet embryo.
Figur 1: Klargjøring av dBSA.
Trinnvise fremgangsmåter for å forberede dBSA løsningen er avbildet. Omfanget av ionebytte kan bedømmes av fargeendring av perler. Øvre venstre figur viser at 1.2 g av BSA er oppløst i 10 mL av sterilt vann ved romtemperatur. Etter BSA oppløst, legges-ionebytte harpiks perler (øverst til høyre). Når blandingen av BSA løsning med-ionebytte harpiks perler endre farge fra blågrønt til gull (nederst til høyre), kan du erstatte perler med frisk. Nedre venstre figuren viser at fargen på perlene er blå-grønn, og ionebytte er ferdig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Enucleation prosedyrer.
(A) en illustrasjon av enucleation kammeret. Enucleation av oocytes utføres i HCZB medium med CB. Piezo kjøring systemet brukes en flekk av 9% PVP medium å forberede glass pipette for enucleation. Flekker er dekket av mineralolje. (B) en diagram og et mikroskop-bilde viser posisjon spindler og kromosomene før enucleation. Svart pilspisser: spindler og kromosomer. Rød pilspisser: første polar kroppen. (C) en diagram og et mikroskop-bilde skal vises vellykkede enucleation. Svart pilspisser: spindler og kromosomer. Rød pilspiss: første polar kroppen. Blå pilspiss: hullet i zona pellucida. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Celle fusion prosedyrer og kultur tilstand SCNT embryoer.
(A) en illustrasjon av cellen smelting kammeret. Cellen smelting utføres i HCZB mediet som inneholder 6% dBSA. En flekk av 9% PVP medium brukes til å forberede glass pipette cellen smelting. Flekker er dekket av mineralolje. (B) en diagram og et mikroskop-bilde av tidlig kromosom kondens dannet en time etter celle fusion (svart pilspiss). (C) en diagram og et mikroskop-bilde av pronuclear dannet seks timer etter aktivering (svart pilspisser). (D) ordningen med TSA, VC og dBSA behandling for SCNT embryoer. Grønne pilen representerer behandling med TSA, etterfulgt av inkubasjon med VC (gul pil) under mKSOM medium med 0,3% dBSA (blå pil). Pilespisser indikerer tidsberegningen for endre medium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Klonet avkom avledet fra cumulus celler rett etter keisersnitt etter 19,5 dager av svangerskapet.
Det er placentae på den øverste raden. Klonet avkom vises her ble generert i en kjernefysisk overføring eksperimentere fra tre foster mødre. Morkaken størrelsen var 1,5 til 2 ganger større enn størrelsen på de som produseres av i vitro fertilisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gruppe | Donor celle type | Musen belastning | nei. i oocytes brukes | nei. av oocytes smeltet | nei. av oocytes viser tidlig kromosom kondens | nei. av oocytes viser pronuclei formasjon (%) | nei. pronuclei-formet oocytes som utviklet til 2-celle embryo (%) |
|
| TSA, VC | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 81 (99) | 72 (89) | |
| ubehandlet | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 82 (100) | 68 (83) | |
| TSA, VC | føtal fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 202 | 171 | 169 | 151 (89) | 124 (82) | |
| ubehandlet | føtal fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 201 | 171 | 147 | 142 (97) | 109 (77) | |
Tabell 1: effekter av TSA og VC behandling på den i vitro utvikling av klonet mouse embryoer på 2-celle scenen.
| Gruppe | Donor celle type | Musen belastning | nei. av 2-celle embryo brukes | nei. 2-celle embryo utviklet til hver stadier (%) | |||
| 4-cellers | morulastadiet | blastocysten | |||||
| TSA, VC | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 152 | 152 (100) | 149 (98) | 135 (89) en | |
| ubehandlet | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 83 | 47 (57) | 41 (49) | 32 (39) b | |
| TSA, VC | føtal fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 124 | 110 (89) | 101 (81) | 88 (71) c | |
| ubehandlet | føtal fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 109 | 54 (50) | 45 (41) | 29 (27) d | |
| AB, c-d Forskjellige hevet i samme donor cellene representerer betydelige forskjeller (P < 0,05) | |||||||
Tabell 2: effekter av TSA og VC behandling på den i vitro utvikling av klonet mouse embryoer til blastocyst stadiet.
Discussion
Avslutningsvis tyder disse resultatene på at metoden for presentert SCNT kan redusere tekniske problemer, og øke effektiviteten i SCNT uten genetiske modifikasjoner og mRNA kosttilskudd (tabell 1, tabell 2), og sikre stabil produksjon av klonet embryo. Denne metoden kan vi rekonstruere mer SCNT embryo enn konvensjonelle metoder bedre overlevelse og forenklet protokollen. I denne protokollen er en kritisk trinn cellen smelting. For å kunne produsere klonet mus, er det viktig å sikre at riktig mengde HVJ-E beskrevet i protokollen opprettholdes under cellen smelting prosessen og oocytes må returneres til inkubator innen 10 min under trinnene 6.2.3 - 6.2.5. Siden 20-30 donor cellene kan være aspirated sammen med HVJ-E samtidig i manipulasjon pipette, er antall oocytes ved en operasjon større enn den eksisterende metoden. Til slutt, kan vi produsere ca 20 til 30 ombygget oocytes i 10 min. Selv når du arbeider med en stor gruppe med oocytes (100 eller mer), cellen smelting prosedyren bør ta en time eller mindre ved å gjenta trinnene 6.2.3 - 6.2.5. Metoden og teknikker som presenteres her kan tjene som effektive protokoller med forenklet tekniske krav.
I dag er molekylær mekanismene bak utviklingen av SCNT embryoer fortsatt uklart. Denne forbedrede SCNT metoden bidrar også til studere slik reprogramming mekanismer, siden denne metoden kan produsere mange klonet embryo i bare ett eksperiment. Denne metoden bruker somatiske celler med intakt cellemembraner for cellen smelting. Dermed kan det være mulig å bruke denne tilnærmingen til andre celler som hale tips celler16sertoli celler17og embryonic stem (ES) celler18. Når konvensjonelle SCNT metoder brukes for sprøytebruk relativt store celler, for eksempel hale tips celler, direkte i oocyte cytoplasma blir enda mer teknisk krevende å få live embryoer. I tillegg er relativt hardt celler, for eksempel sertoli celler, vanskelig å bryte av pipettering sprøytebrukere. Når disse ulike celletyper anses, er metoden for celle-fusion utnytte HVJ-E enkel og effektiv. Selv om verdien og sikkerheten til HVJ-E har vært overbevisende måte demonstrert19,20, kan det være viktig å re-vurdere muligheten for å bruke HVJ-E for å produsere klonede dyr til landbruket eller biomedisinsk formål.
Nylig en gruppe produsert videre klonet mus avledet fra urin celler21. For å redde truede pattedyrarter, vil heretter SCNT bruker cellene i en ikke-invasiv måte, for eksempel urin cellen, være ideelt. Flere nylig, en annen gruppe har direkte generert klonet mus med antigen-spesifikke CD4+ T celler22. Det ville være interessant å se hvis denne metoden gjelder også effektivt klone mus fra slike celler. Videre har Latrunculin A blitt rapportert som et bedre alternativ for hemme begrepsordbok polymerisasjon under enucleation og parthenogenetiske aktivisering SCNT oocytes23. Fremtidige studien kan avdekke om Latrunculin A behandling, i stedet for cytochalasin B, ytterligere forbedrer generasjon klonet avkom. I tillegg har TSA behandling blitt brukt i mus, griser24og kaniner25 ved å endre behandling tid, periode og konsentrasjon. Videre VC ikke bare forbedrer embryonale utvikling i svin SCNT10, men forbedrer også iPS celleproduksjon hos mennesker og mus26. Det er derfor sannsynlig å spekulere at TSA og VC behandling kan også brukes til andre pattedyrarter, og vi må optimalisere behandling tid TSA og VC til hver art.
I konklusjonen, ville denne metoden gjøre det mulig å generere klonet mus med et praktisk effektivitet med enkle prosedyrer. Derfor kan resultatene av denne studien føre oss å bruke SCNT teknologi for å bevare de genetiske ressursene av sjeldne dyr og forstå de molekylære mekanismene av kjernefysiske reprogramming og embryonale utviklingen.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI grant tall JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 til km Sumitomo stiftelse stipend for grunnleggende vitenskap forskningsprosjekter (150810 til km). Kindai University Research Grant (15-I-2 km og ma). M.O. erkjenner kjernestøtte kreftforskning Storbritannia (C6946/A24843) og Wellcome Trust (203144/Z/16/Z). Vi takker Ms. N. Backes-Kamimura og Mr. J. Horvat bevis lese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
| MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
| CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
| Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
| Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
| NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
| Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
| Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
| Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
| Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
| EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
| Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
| BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
| Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
| Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
| HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
| SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
| Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |
References
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Kishigami, S., et al. Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer. Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).
- Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells. Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).
- Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer. Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).
- Matoba, S., et al. Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell. 159 (4), 884-895 (2014).
- Kishigami, S., et al. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).
- Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer. Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).
- Bui, H. T., et al. Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos. Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).
- Chen, J., et al. H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat Genet. 45, 34-42 (2013).
- Huang, Y., et al. Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos. Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).
- Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos. J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules. Biol Open. 6, 415-424 (2017).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
- Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).
- Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. Manipulating the mouse embryo. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).
- Ogura, A., et al. Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells. Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).
- Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).
- Tachibana, M., et al. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).
- Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 1-8 (2016).
- Kaminuma, O., et al. Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells. EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).
- Terashita, Y., et al. Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization. Biol Reprod. 86 (6), 180 (2012).
- Zhao, J., et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).
- Shi, L. H., et al. Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos. Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).
- Esteban, M. A., et al. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).
